朝鮮淫羊藿的分子鑑定方法

2023-09-16 11:19:25

專利名稱：朝鮮淫羊藿的分子鑑定方法
技術領域：
本發明涉及中藥材來源品種鑑定技術領域，採用特異性引物進行PCR擴增鑑定的 分子方法。
二.
背景技術：
中藥淫羊藿為來源於小檗科淫羊藿屬多個種植物的乾燥地上部分，在我國有悠 久的使用歷史。其功效除了傳統的補腎壯陽祛風溼之外，臨床上還被用於治療骨質疏鬆、 更年期綜合症、高血壓、冠心病等疾病，另外淫羊藿還具有增強免疫力、抗衰老、抗腫瘤、抗 愛滋病等作用，因此受到國內外的廣泛關注。藥典規定藥材淫羊藿的來源物種包括淫羊 藿 Epimedium brevicornu Maxim.、箭葉淫羊藿 Epimedium sagittatum(Sieb. et Zucc.) Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubscens Maxim.、卓月鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai 和巫山淫羊藿Epimediumwushanense T. S. Ying等5個種；《貴州省中藥材、民族藥材標 準》中還收載了粗毛淫羊藿Epimedium acuminamm Franch.、天平山淫羊藿Epimedium myrianthum Stearn、it嶺淫羊藿Epimedium leptorrhizum Steam禾口租毛淫羊藿Epimedium coactum H. R. Liang.，其來源之多在中藥中是很罕見的。不同植物來源的淫羊藿藥材其有 效成分的含量存在很大的差異，再加上藥材和飲片難以進行形態鑑別，這就對藥材質量控 製造成了很大的障礙，這就需要尋找到一種穩定可靠的方法將不同來源的淫羊藿藥材和飲 片加以鑑定區分。通過比較不同藥用淫羊藿品種的一段DNA鹼基序列，找到了朝鮮淫羊藿 和其他藥用淫羊藿品種存在差異的一段序列，這種差異可以通過進行鑑定性PCR來區別。

發明內容
本發明的目的是提供一種在藥用淫羊藿品種中準確鑑定朝鮮淫羊藿的鑑定性PCR 分子鑑定方法，該方法包括朝鮮淫羊藿的特徵性DNA鹼基序列、兩對鑑定性PCR引物及其鑑 定方法。本發明的技術方案如下首先從各藥材中提取基因組DNA，然後利用該方法進行鑑定。本發明設計的朝鮮淫羊藿聚合酶鏈式反應的鑑定引物DNA序列為引物 1 :kor. -aF :5，-CAGCGAACTTGTGAAAAACAC-3，引物 2 kor· -bR 5，-CGATAAGAGAACAAAGGGCTA-3，引物 3 kor· -bF 5，-CGAACTTGTGAAAAACAC-3，用全自動DNA合成儀按上述鑑定引物的DNA序列進行合成，即得到鑑定引物的白 色粉末結晶。中藥材朝鮮淫羊藿聚合酶鏈式反應鑑定的方法為1、藥材DNA的提取按照常規植物DNA的提取方法或者用市售植物基因組提取試 劑盒進行，用無菌去離子水溶解供試品DNA模版，並將模版濃度調整到能夠進行常規PCR反 應的濃度；
2、模版DNA質量的鑑定用另一對引物鑑別模版DNA的質量，該對引物能夠擴增淫 羊藿屬植物的線粒體基因組nadl第2內含子序列。引物的DNA序列為nadl-2intron-up 5』 -GGT CTT ATT CTT ATT GTG CGC CT-3，，nadl-2intron-low :5』 -TTC GTC TAT ACCAGA CCA TAA GG-3，。反應體系為引物各OluM，IOul 的 2XPCR StarMix，模版DNA約 20ng，用無 菌去離子水補充反應體積到20ul。PCR擴增程序為95°C預變性3min ；94°C變性30s，54°C 退火30s，72°C延伸2min，共30個循環；72°C延伸lOmin。取5ul的PCR產物在瓊脂糖 凝膠(包括適量的溴化乙錠，即EB)檢測擴增結果。如果得到ISOObp左右的條帶，則表明 DNA模版合格，可以進行後續的鑑定試驗，如果沒有陽性條帶，則需要改進DNA提取方法，以 得到合格的模版DNA。對於模版DNA質量的鑑定，也可以選擇其他能夠在淫羊藿屬植物中成 功擴增的引物對進行；3、鑑定性PCR反應引物用無菌去離子溶解並稀釋至2umol/uL。以25uL反應體 係為參照，各物品的用量為IOXPCR 反應緩衝液 2.5uldNTPs (2. 5mM)1. 6ulprimer 1(2um)2ulprimer 2 (2um)2ulEasy Taq(5U/ul) 0. 3ulDNA 模版20ngddH20補充體積到25uL4、PCR反應程序；在PCR儀上按照以下程序進行擴增反應
94 0C30s 一 η
50 °C30s個循環
72 V1min J
72 °C5min5、電泳檢測取5uLPCR反應液與IuL加樣緩衝液混合，1 %瓊脂糖凝膠電泳(含 0. 5%溴化乙錠)檢測PCR擴增產物；反應體系可以因為酶的活性、模版DNA的質量等原因進行調整；檢測結果有陽性條帶，則檢測對象為朝鮮淫羊藿；如果是陰性結果，則檢測對象不 是朝鮮淫羊藿，檢測結果參看說明書附圖1和附圖2。四、說明書


圖1 為引物組合Kor. -aF&Kor. _bR的PCR反應產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。1、 2為朝鮮淫羊藿樣品，3、4為粗毛淫羊藿樣品，5、6為黔嶺淫羊藿樣品，7、8為箭葉淫羊藿樣 品，9、10為柔毛淫羊藿樣品，11、12為巫山淫羊藿樣品，13、14為淫羊藿樣品，15、16為天平山淫羊藿樣品，M為DL2000 DNA marker ；圖2 為引物組合Kor. -bF&Kor. _bR的PCR反應產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。M 為DL2000DNAmarker，1、2為朝鮮淫羊藿樣品，3、4為粗毛淫羊藿樣品，5、6為黔嶺淫羊藿樣 品，7、8為箭葉淫羊藿樣品，9、10為柔毛淫羊藿樣品，11、12為巫山淫羊藿樣品，13、14為淫 羊藿應聘，15、16為天平山淫羊藿樣品；圖3 用兩對引物分別對8份來自於藥材市場的朝鮮淫羊藿藥材進行PCR鑑定的 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。前8個為引物組合Kor. -bF&Kor. _bR的PCR擴增結果，其中7個 有陽性條帶，一個為陰性結果；後8個條帶為引物組合Kor. -aF&Kor. _bR的PCR擴增結果， 其中7個有陽性條帶，一個為陰性結果；該結果與形態鑑定結果一致，其中編號為1、2、3、4、 5、7、8的樣品為未經炮製的生飲片，而編號為6的樣品為經過羊油炙的飲片。五、實施例
1、從藥材市場上收集了來自於不同藥材公司的8份樣品，分別取30mg葉片材料， 在液氮中研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組DNA試劑盒提取總DNA。2、用弓I 物 nadl-2intron-up :5，-GGT CTT ATT CTT ATT GTG CGC CT-3，， nadl-2intron-low :5，-TTC GTC TAT ACC AGA CCA TAA GG-3，檢測提取的樣品總 DNA 的質 量。反應體系為引物各0. IuM, IOul的2 XPCR StarMix，模版DNA約20ng，用無菌去離子 水補充反應體積到20ul。PCR擴增程序為95°C預變性3min ；94°C變性30s，54°C退火30s， 72°C延伸2min，共30個循環；72°C延伸lOmin。取5ul的PCR產物在1 %瓊脂糖凝膠(包 括適量的溴化乙錠，即EB)檢測擴增結果。結果顯示5uL約20ng的總DNA能夠得到很好的 陽性結果，證實提取的總DNA質量達到檢測要求；3、分別用鑑定引物Kor. -bF&Kor. -bR和Kor. -aF&Kor. -bR對8個樣本的總DNA進 行PCR擴增，反應體系和PCR擴增程序如下IOXPCR 反應緩衝液 2.5uldNTPs (2. 5mM)1. 6ulprimer 1 (2um)2ulprimer 2 (2um)2ulEasy Taq(5U/ul) 0. 3ulDNA 模版5ulddH20補充體積到25uL 4、分別取5ul的PCR擴增產物上樣，用1 %的瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳後在凝膠 成像儀上檢測結果。結果參看說明書附圖3，顯示市售的8個朝鮮淫羊藿藥材中有7個得到 陽性條帶，1個為陰性結果，表明其中7個為朝鮮淫羊藿，而1個被誤售為朝鮮淫羊藿，經專 家鑑定是原植物為 淫羊藿(Epimedium brevicornu)的藥材。
權利要求
一種來源為朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum的中藥淫羊藿藥材聚合酶鏈式反應鑑定引物，其特徵在於可分別用兩對鑑定引物kor.-aF&kor.-bR以及kor-bF&kor.-bR對朝鮮淫羊藿進行分子鑑定。鑑定引物DNA序列為kor.-aF5』-CAGCGAACTTGTGAAAAACAC-3』，kor.-bR5』-CGATAAGAGAACAAAGGGCTA-3』以及kor.-bF5』-CGAACTTGTGAAAAACAC-3』，用全自動DNA合成儀按上述鑑定引物的DNA序列進行合成，即得到鑑定引物的白色粉末結晶。
2.根據權利要求1所述鑑定引物鑑定朝鮮淫羊藿原植物以及來源於朝鮮淫羊藿的中 藥淫羊藿藥材和飲片的方法，其特徵在於朝鮮淫羊藿聚合酶鏈式反應(PCR)鑑定的步驟 為(1)藥材DNA的提取按照常規植物DNA的提取方法或者用市售植物基因組提取試劑 盒進行，用無菌去離子水溶解共試品DNA模版，並將模版濃度調整到能夠進行常規PCR反應 的濃度；(2)模版DNA質量的鑑定用另一對引物鑑別模版DNA的質量，該對引物能夠擴增淫 羊藿屬植物的線粒體基因組nadl第2內含子序列。弓丨物的DNA序列為nadl-2intron-up 5，-GGT CTT ATT CTT ATT GTG CGC CT-3，，nadl-2intron_low :5』 -TTC GTC TAT ACC AGA CCA TAA GG-3』。反應體系為引物各 0. luM，IOul 的 2XPCR StarMix，模版 DNA 約 20ng， 用無菌去離子水補充反應體積到20ul。PCR擴增程序為95°C預變性3min ；94°C變性30s， 54°C退火30s，72°C延伸2min，共30個循環；72°C延伸lOmin。取5ul的PCR產物在瓊 脂糖凝膠(包括適量的溴化乙錠，即EB)檢測擴增結果。如果得到ISOObp左右的條帶，則 表明DNA模版合格，可以進行後續的鑑定試驗，如果沒有陽性條帶，則需要改進DNA提取方 法，以得到合格的模版DNA，對於模版DNA質量的鑑定，也可以選擇其他能夠在淫羊藿屬植 物中成功擴增的引物對進行；(3)鑑定性PCR反應引物用無菌去離子溶解並稀釋至2um0l/uL。以25uL反應體系為 參照，各物品的用量為10XPCR反應緩衝液 2. 5uldNTPs (2. 5mM) 1. 6ulprimer 1(2um) 2ulprimer 2(2um) 2ulEasy Taq(5U/ul) 0. 3ulDNA 模版20ngddH20補充體積到25uL(4)PCR反應程序在PCR儀上按照以下程序進行擴增反應 (5)電泳檢測取5uLPCR反應液與IuL加樣緩衝液混合，瓊脂糖凝膠電泳(含0. 5% 溴化乙錠)檢測PCR擴增產物；反應體系可以因為酶的活性、模版DNA的質量等原因進行調整； 檢測結果有陽性條帶，則檢測對象為朝鮮淫羊藿；如果是陰性結果，則檢測對象不是朝鮮淫羊藿。
全文摘要
本發明屬於中藥鑑定技術領域，是用於鑑定朝鮮淫羊藿的分子鑑定方法。發明方法設計的朝鮮淫羊藿聚合酶鏈式反應的鑑定引物DNA序列為kor-aF5』-CGAACTTGTGAAAAACAC-3』，kor.-bR5』-CGATAAGAGAACAAAGGGCTA-3』以及kor.-bF5』-CAGCGAACTTGTGAAAAACAC-3』。本發明能夠實現朝鮮淫羊藿原植物、藥材、生飲片和羊油炙飲片的快速、準確鑑定。
文檔編號C12N15/11GK101886116SQ20091013666
公開日2010年11月17日 申請日期2009年5月12日 優先權日2009年5月12日
發明者王川易, 肖培根, 郭寶林 申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所