蚓激酶分離工藝的製作方法
2023-09-16 02:34:15 2
專利名稱：蚓激酶分離工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物化學製藥技術，具體地說，是涉及靜脈注射用的蚓激酶分離工藝。
文獻報導，蚯蚓中成分複雜，其分子量在14000～60000範圍內的蚓激酶高達10種，且均有溶栓活性。多大分子量範圍的蚓激酶收率高，活性強，致敏性低，如何提純並除掉過敏物質和細菌內毒素，同時實現工業化均不清楚。有的從蚯蚓中提純了分子量為60000的蚓激酶，但動物實驗產生強烈的過敏反應。有的從蚯蚓中提純了含有兩個亞基的分子量為45000的蚓激酶，所含兩個亞基的分子量為26000和18000，該酶溶栓活性較低，其分離後的兩個亞基則基本無活性。有的將蚯蚓洗淨後用0．2摩爾PH4．6～4．8的檸檬酸鈉製成勻漿，經1000～4000轉／分鐘離心20～40分鐘，再經GSAC親和、DEAE-52纖維素離子交換和丙烯葡聚糖S-200分子篩柱層析分離出分子量為3．0、2．5及2．2萬的三種活性蛋白質，但不能達到最佳效果。總之，目前國內外尚未見到用規模化生產的分離工藝技術，從蚯蚓中純化出SDS-聚丙烯醯胺電泳為一條帶或二條帶，分子量在25000～30000之間，高活性，且細菌內毒素和過敏性均達到的靜脈注射要求的蚓激酶的報導。
1992年衛生部批准的蚓激酶膠囊經近年臨床使用情況表明，由於蚓激酶屬於酶類製劑，口服後易在胃腸道破壞，且吸收作用緩慢，不能發揮出溶解血栓的主要作用。因此，我們將其給藥途徑改變為靜脈注射，使蚓激酶的生物利用度和溶解血栓的作用得到充分的提高，避免胃腸道的破壞作用，使蚓激酶真正發揮出溶解血栓藥理作用。迄至今日，研製出既能適合工業化生產又能分離出致敏性低無熱原符合靜脈注射要求的蚓激酶的生產工藝是急待解決的技術關鍵。
本發明的目的在於克服現有技術的不足之處，而提供產品無熱源、無過敏、符合靜脈注射要求、適合工業化生產的蚓激酶的分離工藝。
本發明的目的可以通過以下措施來達到蚓激酶的分離工藝是將新鮮的蚯蚓用水洗淨，食鹽處理，蚯蚓∶食鹽按重量比為1∶0．02～0．2，洗淨；加緩衝液，蚯蚓∶0．02～0．3摩爾三羥甲基氨基甲烷或磷酸緩衝液按W／V比為1∶1～3，PH7．3～8．8製成勻漿；6000～12000轉／分鐘，離心30～60分鐘；上清液加熱50～62℃，30～60分鐘，沉澱雜蛋白後，再同法離心，得上清濾液；通過親和層析收集總蚓激酶；分離用離子交換層析1；精製用分子篩層析或離子交換層析2，得分子量為30000±400，29000±400，28000±400，27000±400，25000士400和23000±400的蚓激酶；用超濾法除掉細菌內毒素後，分子量不同的蚓激酶原料藥加輔料或注射用水，製成蚓激酶的粉針劑和水針劑。親和層析的配基為精氨酸、苯甲脒、慈菇蛋白酶抑制劑和大豆(或利馬豆)胰蛋白酶抑制劑，洗脫液為0．005～1．0摩爾精氨酸，PH5．0～8．0和PH9．5～11．5的氨水。離子交換層析1採用羧甲基-或DEAE-葡聚糖凝膠或瓊脂糖凝膠柱層析，用0～1．5摩爾氯化鈉梯度洗脫分離出分子量不同的蚓激酶。分子篩層析採用葡聚糖凝膠-G75，離子交換層析2採用Mono-Q或Q-瓊脂糖凝膠H．P層析，用0～1．5摩爾氯化鈉緩衝液進行洗脫，製成分子量不同的蚓激酶溶液。超濾法採用3～5萬的超濾膜或超濾柱進行超濾，製成分子量不同的蚓激酶原料藥。新鮮活的蚯蚓是雙胸蚓、赤子愛勝蚓、廣地龍和鋸齒遠蚓。
上清濾液，即粗蚓激酶；總蚓激酶，即不同分子量的蚓激酶；離子交換層析1目的是將總蚓激酶分離為分子量不同範圍的蚓激酶；精製目的是將分子量不同範圍的蚓激酶精製成分子量不同的蚓激酶溶液。輔料包括右旋糖酐和甘露醇。
採用SDS-聚丙烯醯胺電泳法檢測各部分純度及分子量分布。採用Folin法測定蛋白含量。細菌內毒素依法檢查(中國藥典2000年版二部附錄XI E)。
過敏試驗，取本品適量，以氯化鈉注射液配成每1毫升中含37．5微克的溶液，分別做為致敏溶液及供試品溶液。取體重250-300克健康豚鼠6隻，間日腹腔注射致敏0．5毫升／只，連續3次，於第3次給藥後的14天自靜脈注射供試品溶液1．0毫升／只，注射後15分鐘內動物應不得出現連續乾咳，明顯聳毛，四肢發軟，乾嘔等現象中的兩種以上者或者有躺臥，呼吸困難，痙攣，虛脫及死亡現象之一者，應判為陽性。
本發明相比現有技術具有如下優點經鑑定不同分子量的蚓激酶均為蛋白水解酶，具有高效、溶栓、抗凝、極低毒性、化學性質穩定、無熱源、無過敏，可製成粉針劑和水針劑，用於治療心肌梗塞和腦梗塞；另外，原料來源豐富、價格低廉，適合工業化生產。
圖1蚓激酶的分離工藝流程下面結合圖和實施例，對本發明加以進一步說明實施例1稱取1．0公斤新鮮活的雙胸蚓用自來水洗淨，加20克精鹽並攪動後，使蚯蚓吐出大量粘液，再用水洗滌乾淨，加1．5升0．1摩爾三羥甲基氨基甲烷(PH7．3)，用膠體研磨粉碎，於4℃、12000轉／分鐘離心30分鐘，取上清液置62℃水浴中加熱50分鐘，再離心1次，上清液用0．45um微孔濾膜過濾得上清濾液1．2升，將上清濾液加入以苯甲脒為配基的親和層析柱進行親和層析，控制流速30毫升／小時，待樣品完全進入膠床後，將膠面上部填滿平衡緩衝液，洗脫至基線。用1．0摩爾精氨酸(PH7．0)洗脫活性峰至基線，活性峰用0．02摩爾磷酸緩衝液(PH7．8)反覆透析至PH7．8，即得總蚓激酶360毫克。
總蚓激酶進行羧甲基-葡聚糖凝膠-C50柱層析，控制流速30毫升／小時，用0～1．0摩爾氯化鈉進行梯度洗脫，按先後順序收集A、B和C。A峰產量為4．0毫克，B峰產量為140毫克，C峰產量為208毫克。
10毫克B峰用0．02摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(PH7．3)的平衡液透析至平衡，進行Mono-Q層析柱分離，控制流速1．0毫升／分鐘，用0～0．3摩爾氯化鈉進行梯度洗脫，按先後順序收集分子量為25000±400、27000±400和28000±400的蚓激酶，電泳均為一條帶。
各部分用3萬超濾柱超濾分離出分子量不同的蚓激酶原料藥，加甘露醇和注射用水至一定濃度，用0．22um微孔濾膜過濾，經分裝和凍幹製成粉針劑，均符合靜脈注射的要求。
實施例2稱取1．0公斤鮮活的赤子愛勝蚓用自來水洗淨，加50克精鹽並攪動後，使蚯蚓吐出大量粘液，再用超純水洗滌乾淨，加1．0升0．2摩爾磷酸緩衝液(PH7．8)，用膠體研磨粉碎，於4℃、8000轉／分鐘離心60分鐘，取上清液置60℃水浴中加熱60分鐘，再離心1次，上清液用0．45um微孔濾膜過濾得上清濾液1．2升。
將上清濾液0．4升分三次加入以大豆胰蛋白酶抑制劑為配基的親和層析柱，進行親和層析，控制流速30毫升／小時，待樣品完全進入膠床後，將膠面上部填滿平衡緩衝液，洗脫至基線。分別用氨水(PH9．5)、氨水(PH10．5)和氨水(PH11．5)洗脫活性峰至基線，活性峰用0．02摩爾磷酸緩衝液(PH7．8)反覆透析，分別獲得總蚓激酶192毫克、198毫克和206毫克。
總蚓激酶進行DEAE-葡聚糖凝膠-A50柱層析，控制流速30毫升／小時，用0～1．3摩爾氯化鈉進行梯度洗脫，按先後順序收集A1、A2和A3。A1峰產量為57．6毫克，電泳一條帶。A2峰產量為160毫克，電泳二條帶，用超純水透析除鹽後，超濾除熱源，即可符合注射用蚓激酶的質量標準。A3峰產量為約319毫克，電泳三條帶。
80毫克A2峰用0．02摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，PH7．3的平衡液透析至平衡，進行Q-瓊脂糖凝膠H．P層析柱分離，控制流速60毫升／小時，用0～0．2摩爾氯化鈉進行梯度洗脫，按先後順序收集分子量為25000±400、27000±400和29000±400的蚓激酶，電泳均為一條帶。
144毫克A3峰用0．02摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，PH7．3的平衡液透析至平衡，進行Q-瓊脂糖凝膠H．P層析柱分離，控制流速12毫升／小時，用0～0．3摩爾氯化鈉進行梯度洗脫，按先後順序收集Q1、Q2、Q3和Q4。Q1峰為46．9毫克，電泳為一條帶，分子量為30000±400。
各部分用3萬超濾膜超濾，分別分離出分子量不同的蚓激酶原料藥，加右旋糖酐10和注射用水至一定濃度，用0．22um微孔濾膜過濾，經分裝和凍幹製成粉針劑，均符合靜脈注射用藥的要求。
實施例3稱取1．0公斤鮮活的鋸齒遠蚓用自來水洗淨，加100克精鹽並攪動後使蚯蚓吐出大量粘液，再用超純水洗滌乾淨，加3．0升0．3摩爾磷酸緩衝液(PH8．3)，用膠體研磨粉碎，於4℃、6000轉／分鐘離心40分鐘，取上清液置55℃水浴中加熱1小時，再離心1次，上清液用0．45um微孔濾膜過濾得上清濾液1．2升，將上清濾液加入以精氨酸為配基的親和層析柱進行親和層析，控制流速30毫升／小時，待樣品完全進入膠床後將膠面上部填滿平衡緩衝液，洗脫至基線。用0．005～0．5摩爾／升精氨酸(PH8．8)進行梯度洗脫至基線，活性峰用0．02摩爾磷酸緩衝液(PH7．8)反覆透析至PH7．8，即得總蚓激酶260毫克。
總蚓激酶進行羧甲基-瓊脂糖凝膠柱層析，控制流速30毫升／小時，用0～1．5摩爾氯化鈉進行梯度洗脫，按先後順序收集C1、C2和C3。C1峰產量為約50毫克，電泳一條帶。C2峰產量為約60毫克，電泳二條帶。C3峰產量為138毫克，電泳三條帶。
60毫克C2峰用0．02摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，PH7．3的平衡液透析至平衡，進行Q-瓊脂糖凝膠H．P層析柱分離，控制流速60毫升／小時，用0～0．2摩爾氯化鈉進行梯度洗脫，按先後順序收集分子量為23000±400的蚓激酶，電泳均為一條帶。
各部分用5萬超濾柱超濾製成分子量不同的蚓激酶原料藥，加注射用水至一定濃度，分離出蚓激酶水溶液，用0．22um微孔濾膜過濾，分裝成水針劑，均符合靜脈注射的要求。
實施例4稱取1．0公斤新鮮的廣地龍用自來水洗淨，加200克精鹽並攪動後使蚯蚓吐出大量粘液，再用超純水洗滌乾淨，加3．0升0．02摩爾三羥甲基氨基甲烷(PH8．8)，用膠體研磨粉碎，於4℃、10000轉／分鐘，離心30分鐘，取上清液置50℃水浴中加熱30分鐘，再離心1次，上清液用0．45um微孔濾膜過濾得上清濾液1．2升，將上清濾液加入以慈菇蛋白酶抑制劑為配基的親和層析柱，進行親和層析，控制流速30毫升／小時，待樣品完全進入膠床後，將膠面上部填滿平衡緩衝液，洗脫至基線。用含1摩爾／升氯化鈉和1．0摩爾精氨酸醋酸緩衝液(PH5．0)，洗脫活性峰至基線，活性峰用0．02摩爾磷酸緩衝液(PH7．8)反覆透析，即得總蚓激酶280毫克。
總蚓激酶進行DEAE-瓊脂糖凝膠CL-6B柱層析，控制流速30毫升／小時，用0～1．0摩爾氯化鈉進行梯度洗脫，按先後順序收集A1、A2和A3。A1峰產量為30毫克，電泳一條帶。A2峰產量為72毫克，電泳二條帶。A3峰產量為160毫克，電泳三條帶。
720毫克A2峰用0．02摩爾磷酸緩衝液(PH7．8)透析至平衡，進行葡聚糖凝膠-G75層析柱分離，控制流速12毫升／小時，用0．02摩爾磷酸緩衝液(PH7．8)進行洗脫，收集第一峰的前1／2處獲得分子量為30000±400的蚓激酶，電泳為一條帶。
各部分用5萬超濾膜超濾，以下操作同實施例3，製成無菌無熱源的蚓激酶水針劑。
權利要求
1．蚓激酶的分離工藝，其特徵在於將新鮮的蚯蚓用水洗淨，食鹽處理，蚯蚓∶食鹽按重量比為1∶0．02～0．2，洗淨；加緩衝液，蚯蚓∶0．02～0．3摩爾三羥甲基氨基甲烷或磷酸緩衝液按W／V比為1∶1～3，PH7．3～8．8製成勻漿；6000～12000轉／分鐘，離心30～60分鐘；上清液加熱50～62℃，30～60分鐘，沉澱雜蛋白後，再同法離心，得上清濾液；通過親和層析收集總蚓激酶；分離用離子交換層析1；精製用分子篩層析或離子交換層析2，得分子量為30000±400，29000±400，28000±400，270004±400，25000±400和23000±400的蚓激酶；用超濾法除掉細菌內毒素後，分子量不同的蚓激酶原料藥加輔料或注射用水，製成蚓激酶的粉針劑和水針劑。
2．根據權利要求1所述的分離工藝，其特徵在於親和層析的配基為精氨酸、苯甲脒、慈菇蛋白酶抑制劑和大豆胰蛋白酶抑制劑，洗脫液為0．005～1．0摩爾精氨酸，PH5．0～8．0和PH9．5～11．5的氨水。
3．根據權利要求1所述的分離工藝，其特徵在於離子交換層析1採用羧甲基-或DEAE-葡聚糖凝膠或瓊脂糖凝膠柱層析，用0～1．5摩爾氯化鈉梯度洗脫分離出分子量不同的蚓激酶。
4．根據權利要求1所述的分離工藝，其特徵在於分子篩層析採用葡聚糖凝膠-G75，離子交換層析2採用Mono-Q或Q-瓊脂糖凝膠H．P層析，用0～1．5摩爾氯化鈉緩衝液進行洗脫，製成分子量不同的蚓激酶溶液。
5．根據權利要求1所述的分離工藝，其特徵在於超濾法採用3～5萬的超濾膜或超濾柱進行超濾，製成分子量不同的蚓激酶原料藥。
6．根據權利要求1所述的分離工藝，其特徵在於新鮮活的蚯蚓是雙胸蚓、赤子愛勝蚓、廣地龍和鋸齒遠蚓。
全文摘要
本發明涉及注射用的蚓激酶的分離工藝,現有技術中的蚓激酶膠囊口服後,易在胃腸道破壞,吸收作用緩慢,不能發揮出溶解血栓的主要作用,本發明將給藥途徑改變為靜脈注射,使蚓激酶的生物利用度和溶解血栓的作用得到充分的發揮,分離工藝詳見說明書,本發明優點是高效,溶栓,抗凝,極低毒性,化學性質穩定,無熱源,無過敏,原料來源豐富,經濟,可製成粉針劑和水針劑,用於治療心肌梗塞和腦梗塞,並適用於工業化生產規模。
文檔編號A61K35/64GK1293245SQ0013271
公開日2001年5月2日 申請日期2000年11月14日 優先權日2000年11月14日
發明者孫啟良 申請人:北京儒展生化藥物研究中心