一種低免疫原性蚓激酶及其製備方法和應用的製作方法

2023-09-16 02:44:45

專利名稱：一種低免疫原性蚓激酶及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及蚓激酶的製備方法，特別是涉及ー種低免疫原性蚓激酶的製備方法和由其製備的可供ロ服、注射的多種劑型的藥物製劑。屬於生物製藥領域。
背景技術：
血栓和心腦血管疾病是ー種嚴重威脅人類健康的重大疾病，特別是50歲以上中老年人健康的常見病，全世界毎年死於血栓和心腦血管疾病的人數高達2500萬人，居各種死因之首。血栓和心腦血管疾病已成為導致人類死亡的頭號殺手。血栓和心腦血管疾病具有「四高一多」的特點，即「發病率高、致殘率高、 死亡率高、復發率高，併發症多」，目前，我國血栓和心腦血管疾病患者已經超過3. 7億人，我國每年死於血栓和心腦血管疾病的人達530萬人，佔我國每年總死亡人數的60%。而倖存下來的患者中75%患不同程度的併發症。因此，快速滲透，溶解血栓淤阻，使血管暢通，靜脈曲張逐漸回落是治療血栓和心腦血管疾病的關鍵。迄今為止人們已從多種生物組織中提取得到各種各樣的溶栓酶，如鏈激酶、尿激酶、蝮蛇抗栓酶等並已開發成溶血栓類藥物。這些藥物在臨床使用上,易引起出血、過敏等副作用；有的品種給藥方式単一，使得用藥範圍受到很大限制；而有的原料非常缺乏，從而導致藥價非常昂貴。理想的溶栓藥物要求可迅速溶解血栓、無毒、無出血等副作用，給藥方便，價格便宜。因此尋找有效的治療藥物是國內外醫學界重點攻關的熱點之一。鑑於蚯蚓蚓激酶能溶解血栓，無毒副作用，且來源豐富、療效顯著，因此，人們期望能將蚯蚓蚓激酶開發成ー種新型的溶栓藥劑。九十年代初，日本、韓國及我國的江西江中製藥廠、山東青島雙龍藥業有限公司等製藥企業相繼開發成功價格廉、療效佳的ロ服蚓激酶膠囊，如博洛克，該產品為多組分酶制齊U，經臨床驗證該酶可降低血液粘滯度、改善微循環。對缺血性心腦血管病、陳舊性血栓病、高血壓、動脈硬化、心肌梗塞等具有較好治療作用，尤其對因腦血管病導致的肢體癱瘓及語言障礙的恢復效果顯著。但是，ロ服劑型在體內易受酶、抑制劑等分解破壞，也不易進入病灶細胞和組織，人體生物利用度低，吸收慢，起效時間長而無法作急救之用，此外蚓激酶對人體而言屬於異種蛋白，即使純度達到要求，也可能會在採用非腸胃道給藥途徑(如注射、輸液等)進入人體後，使人體產生免疫過敏反應，使藥物失去臨床療效，甚至會危及生命。所以蚓激酶的抗原性問題是影響注射用蚓激酶在體內發揮其功效的重要問題。此外，酶類藥物在人體內的穩定性(半衰期)，抗水解酶降解能力等等也是影響酶在體內發揮其功效的因素。本發明的目的是利用現代生物分離技木，分離得到來源廣泛且具有較高純度的蚓激酶(F-III-2組分)、通過大分子修飾劑聚こニ醇及右旋糖苷對其進行修飾，獲得既可降底或消除蚓激酶的免疫原性，又可保留其生物活性，防止降解和延長半衰期的エ藝方法；同時研製新劑型抗血栓生物藥物-高純度注射用蚓激酶。此外經分子修飾的低分子蚓激酶亦可用於抗血栓的固體製劑及液體製劑中，如片劑，膠囊劑，ロ服液等。

發明內容
本發明的目的在於克服蚓激酶組分多，質量不易控制，易產生過敏反應，利用度低等不足，提供ー種經分子修飾的低免疫原性蚓激酶的製備方法及由該方法製備得到的低免疫活性的蚓激酶，該方法的特點是製備得到的蚓激酶比活力> 30000IU/mg，分子量為25500±2000道爾頓，免疫原性較天然酶的免疫原性小，小於天然酶免疫原性的12%。本發明的另ー個目的是提供以低免疫活性蚓激酶為原料製成的片劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、注射劑等多種途徑給藥的藥物製劑。為了達到所述的目的，本發明採用了以下技術手段本發明的一種製備低免疫原性蚓激酶的方法，其特徵在於包括首先從蚯蚓中提取得到蚓激酶粗品，然後粗品通過離子交換柱進行洗脫，純化，收集具有纖溶活性的組分，冷凍乾燥濃縮，濃縮後的蚓激酶溶液用凝膠過濾色譜柱進行分離，用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測纖溶活性，收集具有纖溶活性的第二個洗脫峰，經SDS-PAGE電泳檢測，其分子量為 23500-27500Da，洗脫峰經透析脫鹽低溫冷凍乾燥後採用活化的單甲氧基聚こニ醇以及右旋糖酐對其進行分子修飾，即得。本發明的方法具體的，包括以下步驟(I)蚓激酶粗品的製備取新鮮蚯蚓，水洗數次，清水浸泡除去內臟中的汙物，然後加入水，並加入苯甲酸鈉防腐，置於4 (TC - 5 (TC水浴加熱自溶8 -10 h，離心，棄去沉澱，抽濾；濾液加入固體(NH4)2SO4使得(NH4)2SO4的濃度為30-40%，在4°C下保存3h_5h，用離心機離心，取得上清液，加(NH4)2SO4使得(NH4)2SO4的濃度為60-80%，離心，收集沉澱，用去離子水溶解，用透析袋透析2-3天，脫鹽，然後用截流分子量為10000WM的超濾膜超濾濃縮，低溫冷凍乾燥即得蚓激酶粗品；(2)蚓激酶的純化將步驟(I)提取的蚓激酶粗品用緩衝液溶解後，上離子交換柱，用磷酸鹽緩衝液平衡，用O. 1-0. 6M氯化鈉梯度洗脫，用HPLC分析，並用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測，收集具有纖溶活性的組分，冷凍乾燥濃縮；(3)蚓激酶組分F-II1-2的分離及純化將經離子交換得到的蚓激酶，過Superdex 75凝膠過濾色譜柱，用磷酸鹽緩衝液洗脫，流速為I. ο-I. 3ml/h，用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測纖溶活性，收集具有纖溶活性的第二個洗脫峰，經SDS-PAGE電泳檢測，其分子量為23500-27500Da，即為蚓激酶組分F-111-2純品，洗脫峰經透析脫鹽低溫冷凍乾燥備用；(4)蚓激酶組分F-II1-2分子修飾a、將PEG活化成單甲氧基聚こニ醇甲酸琥珀醯亞胺脂肪採用改良N-羥基琥珀醯亞胺活化脂法活化mPEG5000，即將mPEG5000，N-羥基琥珀醯亞胺溶於CH2Cl2中，完全溶解後攪拌約25-35min，緩慢滴加無水三こ胺，攪拌12h，向反應液中滴加こ醚，過濾後重新溶解於CH2Cl2中，然後再以こ醚沉澱，過濾，乾燥，得到顏色為淡黃色的產物，即為單甲氧基聚こニ醇甲酸琥珀醯亞胺脂肪，以SC-mPEG表示；稱上述終產物於三ロ燒瓶中，加入氨基磺酸(NH2SO3H)，溶解於CH2Cl2中，緩慢滴加三こ胺與CH2Cl2混合液，繼續反應5-7h，在低溫下向反應物中緩慢加入こ醚，過濾後溶解於CH2Cl2，再以こ醚沉澱，所得產物即為活化的SC-mPEG，存放於真空乾燥器中備用；b、SC-mPEG 修飾 F-II1-2將活化過的修飾劑SC-mPEG與蚓激酶組分F-III-2以摩爾比I : 3的比例加入O. lmol/L, ρΗ9· 2的硼酸緩衝液中，在37°C下水浴保溫lh，然後在O. lmol/L, ρΗ7· O磷酸緩衝液中透析24h，然後用截流分子量為10000WM的超濾膜超濾，濃縮液冷凍乾燥48h，即得經單甲氧基聚こニ醇甲酸琥珀醯亞胺脂肪修飾的蚓激酶，用SC-mPEG — F-III-2表示；C、右旋糖苷修飾 SC-mPEG — F-III-2①右旋糖苷的活化
取右旋糖苷溶於蒸餾水，另取適量的NaIO4，兩溶液混合，在4°C冰箱反應18h、滴加5%的NaHSO3的溶液還原過量的NaIO4,室溫下以蒸餾水透析4h後，再以適量的磷酸鹽緩衝液透析16h，濃縮、冷凍乾燥即得活化的右旋糖苷；②活化右旋糖苷化學修飾SC-mPEG — F-III-2用ρΗ8· 4，O. IM的硼酸緩衝液溶解SC-mPEG — F-III-2,按照I : I摩爾比加入活化的右旋糖苷，在25°C下反應18h，滴加NaBH4中止反應，再調pH值至7. 0，對水透析4小時，冷凍乾燥即得修飾的蚓激酶，用SC-mPEG — F-III-2 —糖苷表示。在本發明中，優選的所述蚯蚓包括赤子愛勝蚓、雙胸蚓、縞蚯蚓(土地龍)、參環毛蚓(廣地龍)。在本發明中，優選的所述的超濾膜為中空纖維超濾膜或管式超濾膜。在本發明中，優選的步驟(2)中所述的緩衝液為磷酸緩衝液或三羥甲基氨基甲燒-鹽酸。在本發明中，優選的步驟(2)中所述的離子交換柱採用瓊脂糖凝膠柱或葡聚糖凝膠柱，更優選的為DEAE-52離子交換柱。在本發明中，優選的所述冷凍乾燥其乾燥條件為-20 _30°C預凍5 6h，然後在10 20Pa壓カ40 45°C條件下升華乾燥IOh 12h。在本發明中，採用沉澱曲線法或者放射免疫法測定化學修飾後蚓激酶的抗原性。本發明提供了ー種由上述方法製得的低免疫原性蚓激酶。經檢測該蚓激酶比活力彡30000IU/mg，分子量為25500 ±2000道爾頓，免疫原性小於天然酶免疫原性的12%。本發明還提供了由以上任一項所述的方法製備得到的蚓激酶。及所述的蚓激酶在製備抗血栓藥物、治療或預防心腦血管疾病藥物中的應用。採用的本發明的方法製備得到的蚓激酶可用於製備抗血栓、治療或預防心腦血管疾病的藥物製劑，所述製劑中含有權利要求8所述的蚓激酶。本發明還提供了由本發明的低免疫原性蚓激酶為原料藥製備的藥物製劑。使用常用的藥物製劑的製備方法可以製成下列劑型的藥物製劑(I)蚓激酶ロ服固體製劑(片劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑等)；(2)蚓激酶ロ服液；(3)蚓激酶注射用針劑。對蛋白質進行化學修飾的修飾劑很多，其中應用最廣泛的是PEG，這是因為PEG是ー種可溶性惰性聚合物，水溶性好，沒有免疫原性和毒性，具有較好的生物活性且反應條件溫和，不會破壞生物分子的活性。經PEG修飾後的蛋白質一般具有以下優點(I)提高蛋白的穩定性(2)降低或消除蛋白的免疫原性((3)延長其在體內的半衰期(4)増加蛋白在水中的溶解度等。蛋白質分子表面的游離氨基(主要為Lys的-NH2)，具有較高的親核反應活性，使之成為蛋白質化學修飾中最常用的被修飾基團。具有羥基的修飾劑，由於羥基反應活性低，為了能在溫和條件下，以較高速率與蛋白質相偶聯，事先需對PEG進行活化，形成活化的PEG。本專利採用改良N-羥基琥珀醯亞胺活化脂法修飾PEG，此法具有生物活性保留較好，質量易於控制等特點。然而，採用PEG修飾的蛋白，其疏水作用增強，溶解度會顯著下降，為了增加被修飾蛋白的溶解性，本發明引入了右旋糖苷修飾蛋白質側鏈氨基。當活化後的水溶性分子右旋糖苷與酶分子上的氨基共價結合，使分子間的空間位阻増加，與水解酶接觸的難度加大，抗水解酶的能力得到加強；而且修飾後的酶分子上纏繞的親水性很強的多糖鏈使酶的水溶性提高，從而在水溶液中修飾酶外圍形成一溶劑化層，這樣對分子間的碰撞起到緩衝作用，降低了碰撞的能量，減少了相互聚集的傾向，使穩定分子構象的次級鍵得到保護，致使穩定性提高；另外，修飾酶分子上的大分子右旋糖苷能「屏蔽」其分子表面的抗原決定簇，避免相應抗體的產生，或阻止抗原抗體的結合，從而抑制免疫應激反應。本發明的有益效果體現在如下方面(I)化學修飾後的蚓激酶，純度高，比活力高，免疫原性低，具有較強的溶栓、調節微循環、提聞免疫力等功能；(2)修飾後的蚓激酶可用於製備ロ服製劑和注射劑，患者長期應用無任何毒副作用。


圖I蚓激酶組分(F-III-2)提取エ藝流程圖；圖2是低免疫原性蚓激酶化學修飾エ藝流程具體實施例方式下面結合具體實施例來進ー步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。本發明實施中涉及的主要材料及試劑的來源mPEG5000 :按照文獻Abraham Abuchowski, et al. Alteration of immunologicalproperties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethyleneglycol [J]. The Journal of Biological Chemistry, 1977,252 (11) :3578-3581.所述的方法製備得到。赤子愛勝蚓寧夏眾生福奧特生物製品有限公司PEG 江蘇南京花奇化工有限公司、
N-羥基琥珀醯亞胺上海勁馬生物科技有限公司超濾膜杭州超濾膜技術有限公司DEAE-52離子交換柱上海密理博生物技術有限公司Superdex 75凝膠過濾色譜柱廣州何為化工有限公司右旋糖酐上海華茂藥業有限公司氨基磺酸南京金彰實業有限公司無水三こ胺南京厚旺化工有限公司實施例I蚓激酶(F-III-2)的製備
一、蚓激酶組分(F-III-2)精製I、蚓激酶粗品的製備取新鮮赤子愛勝蚓50g，水洗數次，清水浸泡除去內臟中的汙物。然後加水50ml，並加入千分之O. 02苯甲酸鈉防腐，置於45 °C水浴加熱自溶9h，渾濁液用離心機離心4000rpm，10min，棄去沉澱，抽濾。濾液加固體(NH4)2SO4使(NH4)2SO4的終濃度達30. 0%，在4°C下保存4h，用離心機15，000r/min離心lOmin，取得上清液，加(MM)2SO4，使(MM)2SO4的終濃度達75. 0%,15, 000r/min離心lOmin，收集沉澱，用去離子水溶解。用透析袋透析48小時，脫鹽，然後用截流分子量為10000WM的超濾膜超濾濃縮。低溫冷凍乾燥即得蚓激酶粗品O2、蚓激酶的純化將步驟I提取的蚓激酶粗品用磷酸緩衝液(PH6. 8，IOmM)溶解後，上DEAE-52離子交換柱，用磷酸鹽緩衝液(PH6.8，5mM)平衡，用O. 4M氯化鈉梯度洗脫，然後用截流分子量為10000麗的超濾膜超濾濃縮。用HPLC分析，並用Deogny等提供的瓊脂糖-纖維&白平板法(具體參見 Lynn Deogny, ea al. Improved fibrin plate method forfibrinolytic activity measurements Use of bentonite precipitation and agarsolidification [J]. Clinica Chimica Acta, 1975,60 :85-89.)檢測，收集具有纖溶活性的組分。冷凍乾燥濃縮到蛋白質含量為2mg/ml。3、蚓激酶(F-III-2)組分分離及純化將經離子交換得到的蚓激酶，過Superdex 75凝膠過濾色譜柱，用磷酸鹽緩衝液(PH6.8,5mM)洗脫，流速為I. 2ml/h，用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測纖溶活性，收集具有纖溶活性的第二個洗脫峰，經SDS-page電泳檢測，其分子量為23500_27500Da，即為蚓激酶(F-111-2)組分純品，洗脫峰經透析脫鹽低溫冷凍乾燥備用。蚓激酶組分(F-III-2)提取エ藝流程圖如圖I所示。ニ、蚓激酶組分(F-III-2)分子修飾2. I、活化PEG對蚓激酶(F_III-2)修飾I、PEG活化(單甲氧基聚こニ醇甲酸琥珀醯亞胺脂肪(SC-mPEG))採用改良N-羥基琥珀醯亞胺活化脂法活化mPEG5000，將mPEG5000，N-羥基琥珀醯亞胺溶於CH2CL2中，完全溶解後攪拌約30min，緩慢滴加無水三こ胺，攪拌12h。向反應液中滴加こ醚30mL，過濾後重新溶解於CH2Cl2，然後再以こ醚沉澱，過濾，-25°C預凍6h，然後在15Pa壓カ45°C條件下升華乾燥12h乾燥，產品顏色為淡黃色。稱上述終產物於三ロ燒瓶中，加入氨基磺酸(NH2SO3H)，溶解於CH2Cl2中，緩慢滴加三こ胺與CH2Cl2混合液，繼續反應約6h。在低溫下向反應物中緩慢加入20mLこ醚，過濾後溶解於CH2Cl2，再以こ醚沉澱，所得產物即為活化的PEG，存放於真空乾燥器中備用。2、SC-mPEG 修飾 F-II1-2將活化過的修飾劑SC-mPEG與蚓激酶(F-II1-2)以摩爾比I : 3的比例加入硼酸緩衝液(O. lmol/L,pH9. 2)中，在37°C下水浴保溫lh，然後在磷酸緩衝液(O. lmol/L,pH7. O)中透析24h，然後用截流分子量為IOOOODa的中空纖維超濾膜超濾，濃縮液冷凍乾燥48h即得經PEG修飾的蚓激酶(SC-mPEG — F-III-2)。2. 2、右旋糖苷(分子量 3000Da)修飾 SC-mPEG — F-III-2 I、右旋糖苷的活化取右旋糖苷溶於蒸餾水，另取適量的NaIO4，兩溶液混合，在4°C冰箱反應18h、滴加5%的NaHSO3的溶液還原過量的NaIO4,室溫下以蒸餾水透析4h後，再以適量的磷酸鹽緩衝液透析16h，濃縮、-25°C預凍6h，然後在15Pa壓カ45°C條件下升華乾燥12h，即得活化的右旋糖苷。2、活化右旋糖苷化學修飾SC-mPEG — F-III-2 將適量的酶液(用ρΗ8· 4，O. IM的硼酸緩衝液溶解)中加入一定的活化的右旋糖苷(摩爾比I : I)，在25°C下反應18h，滴加NaBH4中止反應，再調pH值至7.0，對水透析4小時，冷凍乾燥得修飾的蚓激酶(SC-mPEG — F-III-2 —糖苷)。低免疫原性蚓激酶化學修飾エ藝流程圖如圖2所示。實施例2以低免疫原性的蚓激酶(以20000IU/mg蚓激酶計)作為原料藥，在十萬級潔淨區內，將低免疫原性蝴激酶50g和澱粉15kg於溼法混合制粒機中，混合2 2. 5min後,在攪拌過程中分次加入澱粉漿(總量為5% )，並攪拌制軟材，快速制粒4 5min。取出溼顆粒於60 70°C下在烘房中乾燥，經加入硬脂酸鎂後整粒混合得幹顆粒。置壓片機中壓片。壓片過程中隨時注意片劑的外觀，按規定定時抽查藥片的重量差異、硬度和崩解實現。實施例3以低免疫原性的蚓激酶(以20000IU/mg蚓激酶計)作為原料藥，在十萬級潔淨區內，將低免疫原性蝴激酶50g和澱粉15kg於溼法混合制粒機中，混合2 2. 5min後,在攪拌過程中分次加入澱粉漿(總量為5% )，並攪拌制軟材，快速制粒4 5min。取出溼顆粒於60 70°C下在烘房中乾燥。整粒後填充0#膠囊。實施例4以低免疫原性的蚓激酶(以20000IU/mg蚓激酶計)50g作為原料藥，與植物油15kg、PEG60002kg、丙ニ醇4kg混合，用膠體磨充分研勻或者用低速攪拌加玻璃砂研勻，使得低免疫原性的蚓激酶以極細膩的質點形式均勻分散於基質中，製得軟膠囊內容物。將明膠、甘油、蒸餾水按I : 0.33 : I的重量比例加入夾層罐中，蒸汽夾層加熱，攪拌加熱I. 5h。化膠後，用抽真空的方法去除膠液中的氣泡。將膠液置於保溫罐中，50 60°C保溫備用。採用滴制或壓製法製備軟膠囊，噴體的溫度為45 50°C，膠盒溫度為55 60°C。軟膠囊經冷風固化乾燥後，用擦丸機進行擦拭，保證軟膠囊外觀光潔。實施例5以低免疫原性的蚓激酶(以20000IU/mg蚓激酶計)作為原料藥50g，將其用蒸餾水溶解。用單效真空濃縮設備將溶液濃縮至可溶性固形物含量為35 45%，加入適量甜味劑混勻。常用甜味劑安賽蜜、阿巴斯甜、葡萄糖、甘露醇、木糖醇等。將濃縮後的ロ服液經無菌灌裝，得低免疫原性蚓激酶ロ服液成品。實施例6以低免疫原性的蚓激酶(以20000IU/mg蚓激酶計)作為原料藥，在百級潔淨區內按配製處方將主藥與輔料準確稱量，在配液容器內加注射用水，攪拌溶解後，用O. 45 μ m、O. 22 μ m濾芯過濾除菌。將濾液分裝於抗生素瓶，放入乾燥箱，-20 -30°c預凍6h ;然後在10 20Pa壓カ40 45°C條件下升華乾燥IOh 12h。最後壓塞、軋蓋得低免疫原性蚓激酶注射粉針成品。實驗例I修飾酶(SC-mPEG — F-III-2 —糖苷)活力測定
纖維蛋白原在凝血酶作用下，轉變成纖維蛋白凝塊。蚓激酶SC-mPEG —F-II1-2 —糖苷不僅能激活纖溶酶原，使其轉變為具有水解活性的纖溶酶，還可以直接溶解纖維蛋白，這與尿激酶作用原理相似。兩者均可溶解新鮮血栓，還可以溶解陳舊性血栓。本實驗例測定了該修飾酶的活性。實驗方法I、試劑的配製I. 10. 01mol/L磷酸鹽緩衝液(pH7. 8):取磷酸氫ニ鈉3. 58g，加水使溶解並稀釋至IOOOml為A液；取磷酸ニ氫鈉(NaH2PO4 · 2H20)0. 78g，加水使溶解並稀釋至500ml為B液；將A、B兩液混合至pH值為7. 8。I. 2工作溶液取O. Olmol/L磷酸鹽緩衝液(ρΗ7· 8)與O. 9%氯化鈉溶液(I 17)混合。I. 30. 75%瓊脂糖溶液取瓊脂糖O. 75g，加工作溶液IOOml加熱溶解。I. 4牛纖維蛋白原溶液取纖維蛋白原適量，加工作溶液製成每Iml中含IOmg的可凝蛋白溶液。I. 5牛凝血酶溶液取凝血酶，加工作溶液製成每Iml中含20BP單位的溶液。I. 6蚓激酶標準品溶液取蚓激酶標準品，加工作液配製成每Iml中含50000IU/mL的溶液。2、纖維蛋白平板的配製在直徑9cm的平板上加入O. 5mL凝血酶溶液，再加2mL工作液混勻。在一支大試管中加入37°C保溫一段時間的牛纖維蛋白原溶液ImL和50°C的瓊脂糖溶液15mL，混合均勻。將試管中的溶液倒入平板，迅速混勻，靜止30min。用膠頭滴管在製備好的纖維蛋白平板上打孔，孔直徑約為3mm。3、配製樣品溶液將修飾酶配成質量濃度為O. 5mg/mL的溶液 4、點樣在纖維蛋白平板的孔洞中加入蚓激酶標準品溶液和供試品溶液各10μし5、保溫將點樣後的平板加蓋，放入37°C恆溫箱中保溫反應18h。6、結果與計算
取出平板後，用遊標卡尺測量溶圈的垂直兩直徑，兩者乘積作為溶圈的纖溶活性面積。結果修飾酶的活力為31400IU/mg。實驗例2修飾酶(SC-mPEG — F-III-2 —糖苷)與天然酶抗原性的比較天然酶O. 5mg/ml 及修飾酶 O. 5mg/ml 分別取 25 μ L，50 μ L, 80 μ L，120 μ L, 200 μ L,250 μ L於試管中，分別加入50 μ L抗血清，空試管只加抗血清，不加酶，在37°C下反應Ih後，每個樣品在4°C下保持5天，然後高速離心並用冷鹽水洗滌，沉澱物重新溶解在O. IN的NaOH中，再然後280nm下看吸光度，分別作出天然酶和修飾酶免疫沉澱曲線，結果顯示，經分子修飾的蚓激酶的抗原性大約為原 酶的12. I %。
權利要求
1.一種製備低免疫原性蚓激酶的方法，其特徵在於包括首先從蚯蚓中提取得到蚓激酶粗品，然後粗品通過離子交換柱進行洗脫，純化，收集具有纖溶活性的組分，冷凍乾燥濃縮，濃縮後的蚓激酶溶液用凝膠過濾色譜柱進行分離，用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測纖溶活性，收集具有纖溶活性的第二個洗脫峰，經SDS-PAGE電泳檢測，其分子量為23500-27500Da，洗脫峰經透析脫鹽低溫冷凍乾燥後採用活化的單甲氧基聚乙二醇以及右旋糖酐對其進行分子修飾，即得。
2.如權利要求I所述的方法，其特徵在於具體的，包括以下步驟 (1)蚓激酶粗品的製備 取新鮮蚯蚓，水洗數次，清水浸泡除去內臟中的汙物，然後加入水，並加入苯甲酸鈉防腐，置於40°C -50°C水浴加熱自溶8-10h，離心，棄去沉澱，抽濾；濾液加入固體(NH4)2SO4使得(NH4)2SO4的濃度為30-40%，在4°C下保存3h-5h，用離心機離心，取得上清液，力口(NH4)2SO4使得(NH4)2SO4的濃度為60-80%，離心，收集沉澱，用去離子水溶解，用透析袋透析2-3天，脫鹽，然後用截流分子量為10000WM的超濾膜超濾濃縮，低溫冷凍乾燥即得蚓激酶粗品； (2)蚓激酶的純化 將步驟(I)提取的蚓激酶粗品用緩衝液溶解後，上離子交換柱，用磷酸鹽緩衝液平衡，用0. 1-0. 6M氯化鈉梯度洗脫，用HPLC分析，並用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測，收集具有纖溶活性的組分，冷凍乾燥濃縮； (3)蚓激酶組分F-II1-2的分離及純化 將經離子交換得到的蚓激酶，過Superdex 75凝膠過濾色譜柱，用磷酸鹽緩衝液洗脫，流速為I. 0-1. 3ml/h，用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測纖溶活性，收集具有纖溶活性的第二個洗脫峰，經SDS-PAGE電泳檢測，其分子量為23500-27500Da，即為蚓激酶組分F-III-2純品，洗脫峰經透析脫鹽低溫冷凍乾燥備用； (4)蚓激酶組分F-III-2分子修飾 a、將PEG活化成單甲氧基聚乙二醇甲酸琥珀醯亞胺脂肪 採用改良N-羥基琥珀醯亞胺活化脂法活化mPEG5000，即將mPEG5000，N-羥基琥珀醯亞胺溶於CH2Cl2中，完全溶解後攪拌約25-35min，緩慢滴加無水三乙胺，攪拌12h，向反應液中滴加乙醚，過濾後重新溶解於CH2Cl2中，然後再以乙醚沉澱，過濾，乾燥，得到顏色為淡黃色的產物，即為單甲氧基聚乙二醇甲酸琥珀醯亞胺脂肪，以SC-mPEG表示； 稱上述終產物於三口燒瓶中，加入氨基磺酸(NH2SO3H)，溶解於CH2Cl2中，緩慢滴加三乙胺與CH2Cl2混合液，繼續反應5-7h，在低溫下向反應物中緩慢加入乙醚，過濾後溶解於CH2Cl2，再以乙醚沉澱，所得產物即為活化的SC-mPEG，存放於真空乾燥器中備用； b、SC-mPEG修飾 F-II1-2 將活化過的修飾劑SC-mPEG與蚓激酶組分F-II1-2以摩爾比I : 3的比例加入0. Imol/L，pH9. 2的硼酸緩衝液中，在37°C下水浴保溫lh，然後在0. lmol/L,pH7. 0磷酸緩衝液中透析24h，然後用截流分子量為10000WM的超濾膜超濾，濃縮液冷凍乾燥48h，即得經單甲氧基聚乙二醇甲酸琥珀醯亞胺脂肪修飾的蚓激酶，用SC-mPEG — F-III-2表示； C、右旋糖苷修飾SC-mPEG — F-III-2 ①右旋糖苷的活化取右旋糖苷溶於蒸餾水，另取適量的NaIO4，兩溶液混合，在4°C冰箱反應18h、滴加5%的NaHSO3的溶液還原過量的NaIO4,室溫下以蒸餾水透析4h後，再以適量的磷酸鹽緩衝液透析16h，濃縮、冷凍乾燥即得活化的右旋糖苷； ②活化右旋糖苷化學修飾SC-mPEG — F-III-2 用pH8. 4，0. IM的硼酸緩衝液溶解SC-mPEG — F-III-2,按照I : I摩爾比加入活化的右旋糖苷，在25°C下反應18h，滴加NaBH4中止反應，再調pH值至7. 0，對水透析4小時，冷凍乾燥得修飾的蚓激酶，用SC-mPEG — F-III-2 —糖苷表示。
3.按照權利要求I或2所述的方法，其特徵在於所述的蚯蚓包括赤子愛勝蚓、雙胸蚓、縞蚯蚓及參環毛蚓。
4.按照權利要求2所述的方法，其特徵在於所述的超濾膜為中空纖維超濾膜或管式超濾膜。
5.按照權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(2)中所述的緩衝液為磷酸緩衝液或三羥甲基氨基甲烷-鹽酸。
6.按照權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(2)中所述的離子交換柱採用瓊脂糖凝膠柱或葡聚糖凝膠柱。
7.按照權利要求2所述的方法，其特徵在於所述的冷凍乾燥其乾燥條件為-20 -30°C預凍5 6h，然後在10 20Pa壓力40 45°C條件下升華乾燥IOh 12h。
8.由權利要求1-7任一項所述的方法製備得到的蚓激酶。
9.權利要求8所述的蚓激酶在製備抗血栓藥物、治療或預防心腦血管疾病藥物中的應 用。
10.一種用於抗血栓、治療或預防心腦血管疾病的藥物製劑，其特徵在於含有權利要求8所述的蚓激酶，優選的，所述的藥物製劑包括口服固體製劑、口服液和注射用針劑，其中口服固體製劑包括片劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑。
全文摘要
本發明公開了一種低免疫原性蚓激酶及其製備方法和應用，屬於生物製藥領域。本發明的方法包括首先從蚯蚓中提取得到蚓激酶粗品，然後粗品通過離子交換柱進行洗脫，純化，收集具有纖溶活性的組分，冷凍乾燥濃縮，濃縮後的蚓激酶溶液用凝膠過濾色譜柱進行分離，用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測纖溶活性，收集具有纖溶活性的第二個洗脫峰，經SDS-PAGE電泳檢測，其分子量為23500-27500Da，洗脫峰經透析脫鹽低溫冷凍乾燥後採用活化的單甲氧基聚乙二醇以及右旋糖酐對其進行分子修飾，即得。通過本發明製備得到的蚓激酶具有免疫原性小，酶活力高等特點，能夠用於抗血栓藥物以及治療或預防心腦血管疾病藥物的研究和製備。
文檔編號A61P9/00GK102660523SQ20121012395
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月25日 優先權日2012年4月25日
發明者王輝, 陳喜君 申請人:哈爾濱眾生北藥生物工程有限公司