一種以電化學生物傳感器實時檢測酶中間體的方法

2023-09-16 14:42:55

專利名稱：一種以電化學生物傳感器實時檢測酶中間體的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測酶中間體的方法。具體涉及採用電化學生物傳感器對酶-底物複合中間體的相對量，以及它們隨底物濃度和抑制劑濃度的變化進行實時測量。
背景技術：
酶活性檢測是生物化學的基本技能，也是醫學診斷、藥物設計、食品工程、環境監測等領域的基礎。傳統的檢測方法有液相色譜法、茚三酮顯色法、Nessler定氨法等，這些檢測是一種終態的測量，不能對反應進行中物質的變化進行連續跟蹤。紫外光譜、動力學分析等方法雖然可以進行連續跟蹤，而監測的對象要麼是底物的消耗，要麼是產物的累積，但難以對反應的中間體進行測定。酶-底物複合中間體是酶動力學和酶機理研究最為直接的對象。然而，由於它們是瞬間存在的不穩定物質，所以對其進行觀測和定量分析是十分困難的。傳統的研究方法有終點法和連續法兩種方式。終點法是在催化體系中加入化學淬滅劑以終止反應，然後用突光光譜(Huang H, et al.，Analyst 2012,137,1481-1486)、質譜(Houston CT, et al.，Anal. Chem. 2000, 72, 3311-3319)或色譜(Guasch A, et al. , J. Chromatogr. 1989,473，281-286)進行測量。連續的方式是利用停流法或T-躍遷法進行實驗，並用紫外光譜儀(Rowe GT, et al. , Inorg. Chem. 2007,46,10594-10606)或突光光譜儀(Gong P, et al.,Anal. Biochem. 2009，391，45-55)進行檢測。酶生物傳感器有著多方面的應用。例如,對糖尿病人的血糖監測(Han M, etal.，Biosens. Bioelectron. 2012, 31,151-156)。此類傳感器是基於氧化還原反應中所產生的微電流與底物濃度之間存在著的線性關係，並以此從電流值來推算底物的濃度。傳感器方法非常靈敏，能夠偵測出納米級濃度的底物。其實，與傳感器電流直接存在著計量關係的並不是底物的濃度，而是反應中間體的生成或消耗速率。例如，消耗一個過氧化物酶-H2O2複合氧化中間體I和一個過氧化物酶-H2O2複合氧化中間體II各需要兩個電子，共有4個電子進行傳遞[George P. Nature 1952，169，612-613]。因此電流與中間體的數量成正比。目前，生物傳感器已發展到第三代，即無電子媒介體的生物傳感器，但此類傳感器的應用尚不成熟。而電子媒介體的使用並不影響對酶活性的測量。因此，以辣根過氧化物酶和氫醌電子媒介體為代表的第二代生物傳感器可作為酶活性測定較為理想的裝置。與以往生物傳感器的使用目的不同，在這裡傳感器並不是用來檢測底物濃度，而是用於對瞬間存在的酶中間體的相對量進行持續的測量，並且由此來分析底物和抑制劑對酶催化反應所產生的影響。此方法可進一步為酶動力學和酶機理的研究提供一種靈敏的和實時在線式的實驗手段。

發明內容
本發明的目的之一是建立一種能夠實時測量反應中間體相對量的方法。本發明的目的之二是建立一種能夠對固定酶活性和抑制進行檢測的方法。、
本發明的目的之三是進一步為酶動力學、抑制動力學和酶機理研究提供一種新的實驗手段。為了達到上述目的，本發明將辣根過氧化物酶(HRP)傳感器引入到酶催化活性的檢測中。在催化反應體系中，H2O2被HRP的還原成H2O,而HRP則被氧化成HRP氧化中間體
I。HRP氧化中間體I能被對苯二酚(氫醌)還原成HRP氧化中間體II，隨後再消耗一個氫醌分子進一步還原成初始的HRP。同時，2個分子的氫醌也被氧化成苯醌。每個苯醌分子在負電極上各得到2個電子重新還原為氫醌，那麼電極共失去了 4個電子來維持催化反應的一次循環。於是，在電極上可以檢測到微電流。由於還原酶中間體I和II會在電極上轉移4個電子。因此，反應體系內酶中間體的還原速率就與電極上電子傳遞的速率(電流)成正t匕。如果中間體的壽命恆定不變，那麼中間體的消耗速率則又與中間體的存在量(濃度)成正比。由此推知，檢測電流反映了中間體的存在量。即使不能確定絕對濃度，也可以電流的變化來反映酶中間體相對量的變化。
具體工藝如下電化學傳感器採用酶傳感器三電極系統將玻碳電極作為工作電極，鉬絲作為對電極，甘汞電極(SCE)作為參比電極。將多壁碳納米管沉積在玻碳電極表面上。將HRP和牛血清白蛋白(BSA)覆蓋在玻碳電極上，加入戊二醛使BSA交聯成膜。酶修飾的工作電極與對電極和參比電極連接到電化學工作站，並浸入到含有氫醌的電解液中。加入微量H2O2,電化學工作站在-O. 4 O. 2V的電壓範圍內進行循環伏安掃描。同樣，也將用無HRP修飾的傳感器進行同樣的掃描。將兩者進行比較，如果在HRP存在的循環伏安圖中出現了更加明顯的還原電流峰，證明酶活性的存在，並且在電流-時間曲線的測定中施加這一峰值電壓。在峰值電壓下，測定電流隨時間的變化。在攪拌下每隔一定時間向體系加入微量的&02，電流則出現了階躍式的上升(附圖I的上升折線)，這說明酶中間體的相對量升高。以往，在一定的H2O2濃度範圍內，可根據電流與H2O2濃度之間的線性關係從電流值推算體系中H2O2的濃度，這已作為酶傳感器得到了廣泛的應用。但根據上述電化學反應機制，該電流實際上反映的是酶中間體的瞬時含量。在較高的H2O2的濃度下，電流值對H2O2加入的敏感性下降，它們之間的線性關係被打破，這說明過高的底物濃度並不能繼續產生酶中間體。在恆定的H2O2濃度下，向體系間歇加入苯肼，電流則出現階梯式下降(附圖I中的下降折線)，說明酶中間體的相對量隨抑制劑的加入呈下降趨勢。進而，交替加入H2O2和苯肼。酶中間體的相對量呈現出交替的上升和下降趨勢(附圖I)。這揭示了在底物和抑制劑共同作用下反應體系中酶的實時催化狀態。苯肼抑制劑和H2O2底物相互競爭與酶分子結合，苯肼用量的增加相當於減少了底物，反之亦然。但是，附圖I的曲線上，左側的「臺階」要高於右側。這說明隨著催化體系中底物和抑制劑濃度的持續上升，電流所反映的酶中間體的相對量對這些底物和抑制劑的敏感性下降。電流並不與底物的濃度或抑制劑的濃度成正比，而是與中間體的相對量成正比。電流-時間曲線實際上記錄了每一時刻酶中間體相對量的變化,也直接反映了酶催化活性的實時變化。由此，可用於對酶的前穩態動力學或瞬態動力學進行分析研究。本發明的優點在於
I.本發明將傳感器可用於酶活性檢測，為酶活性實驗，特別是為需要對酶活性進行精密的，不間斷的監測的研究和應領域提供了一種新的方法。同時也為酶生物傳感器提供了一種新的應用途徑。2.本發明所述的方法可用於酶中間體相對量的測量，為捕捉瞬間存在的不穩定中間體提供了簡單的和低成本的實驗手段。3.本發明所述的方法可對酶動力學、酶抑制和酶催化機理的研究提供一種實驗技術。


圖I描繪了能反映電催化峰值電流隨H2O2底物濃度和苯肼抑制劑濃度的變化的計時安培曲線。在HRP傳感器上，向含有I. OmmoI/L的氫醌的磷酸鹽緩衝液中間歇加入H2O2,使體系中H2O2的濃度依次為O. 5、I. O和I. 5mmol/L。隨後間歇加入苯肼，使體系中苯肼的濃度依次為O. 5、I. O和1.5mm0l/L。重複上述過程，交替加入H2O2和苯肼，反覆得到呈階梯上升和下降趨勢的計時安培曲線。所施加電壓相對於SCE為-O. 25V。
具體實施例方式實施例I :在修飾前，用砂布上覆蓋O. 05mm的氧化鋁糊漿對玻碳電極的表面進行打磨拋光，隨後分別用丙酮、50% NaOH溶液、50%硝酸、雙蒸水對玻碳電極進行超聲清洗，室溫乾燥。將Img活化的多壁碳納米管分散在IOmL的N，N_ 二甲基甲醯胺中，超聲振蕩，得到黑色懸液。將IOmL的懸液滴加在玻碳電極表面上，在紅外燈下揮幹溶劑，由此製備出HRP修飾的電極。將2.5mg 300U/mL HRP 和 4mg BSA 溶於 O. 2mL 的 KH2PO4-Na2HPO4 磷酸鹽緩衝液(O. 05mol/L, pH值7. O)中形成混合液。然後將20 μ L的混合液滴加到碳納米管修飾的玻碳電極表面。再將電極置於一個含有25 %戊二醛蒸汽的封閉的容器內進行交聯4h，室溫乾燥lh，在4°C下儲藏待用。實施例2 用電化學工作站和一套常規的三電極系統進行循環伏安實驗。其中，以修飾過的玻碳電極作為工作電極；鉬絲作為對電極；飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極；PBS (O. 05mol/L，pH值7. O)作為支持電解液。在測試前電解液用氮氣脫氣30min，實驗期間電化學反應器用氮氣保護。循環伏安實驗的電勢掃描範圍(相對於SCE)為-0.4 0.2V，掃描速率100mV/s。實驗在室溫下進行。實施例3:
考察底物影響的實驗在盛有20mL支持電解液的反應池中進行。在攪拌下，加入lmmol/L對苯二酹,在-O. 25V電壓下記錄初始電流的基線。然後，每間隔約50s加入O. ImL
O.lmol/L H2O2溶液，得到呈階躍上升的趨勢的電流-時間曲線。實施例4 考察抑制劑影響的實驗亦在盛有20mL支持電解液的反應池中進行。在攪拌下，力口Λ lmmol/L氫醌和O. lmol/L H2O2溶液，在-O. 25V電壓下記錄初始電流的基線。然後，每間隔約50s加入O. ImL O. lmol/L苯肼溶液，得到呈階梯下降趨勢的電流-時間曲線。實施例5
考察底物和抑制劑對酶反應共同影響的電化學實驗也在盛有20mL支持電解液的反應池中進行。在攪拌下,加入lmmol/L的氫醌，在-O. 25V電壓下記錄初始電流的基線。每間隔50s加入O. ImL O. lmol/L的H2O2溶液，得到呈階躍上升的趨勢的電流-時間曲線平臺，再每間隔約50s加入0. ImL 0. lmol/L苯肼溶液，得到呈階梯下降趨勢的電流-時間曲線平臺。然後，再重複上述交替加入底物和抑制劑的過程。此種交替加入底物和抑制劑的程序還可以進一步重複進行。
權利要求
1.一種檢測酶催化反應中間體的工藝方法，其特徵在於所述的工藝方法是採用電化學生物傳感器通過實時測量酶中間體的相對量來監測酶催化活性。
2.根據權利要求I所述的檢測酶催化反應中間體的工藝方法，其特徵在於能夠通過電流-時間曲線持續測量酶中間體的相對量隨底物濃度的變化，從而對前穩態酶動力學進行分析。
3.根據權利要求I所述的檢測酶催化反應中間體的工藝方法，其特徵在於能夠通過電流-時間曲線持續測量酶中間體的相對量隨抑制劑濃度的變化，從而對前穩態抑制動力學 進行分析。
4.根據權利要求I所述的檢測酶催化反應中間體的工藝方法，其特徵在於電化學傳感器採用三電極系統，其中工作電極的修飾是以戊二醛交聯的牛血清白蛋白將辣根過氧化物酶和多壁碳納米管固定在玻碳電極上；底物為過氧化氫和氫醌，抑制劑為苯肼。
全文摘要
本發明公開了一種以電化學傳感器實時檢測酶催化反應中間體的工藝方法。所述的工藝方法是通過傳感器電極上的還原電流對中間體相對量的持續測量來實現的。在固定化辣根過氧化物酶催化H2O2氧化還原反應體系中，反應過程中電子傳遞與酶中間體存在的數量具有定量的關係。通過考察底物、抑制劑，以及底物和抑制劑共同對酶活性的影響，證實此方法能夠實時跟蹤監測酶活性的變化和中間體的相對量。與傳統的中間體檢測方法相比，此方法具有靈敏度高，成本低的特點，可作為酶瞬態動力學檢測的標準，在實驗室、醫學化驗和工業中得到進一步的應用。
文檔編號G01N27/26GK102636529SQ20121014435
公開日2012年8月15日 申請日期2012年5月11日 優先權日2012年5月11日
發明者王緹緹, 邢達傑, 黃積濤, 黃薇 申請人:南開大學