一種評價藥物抗菌敏感性的方法
2023-09-16 06:14:55 2
專利名稱：一種評價藥物抗菌敏感性的方法
技術領域：
本發明涉及一種評價藥物抗菌敏感性的方法。
背景技術：
隨著抗生素的大量以及不合理使用，細菌的耐藥性逐漸增強，越來越多的單藥和多藥耐藥菌被報導，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，萬古黴素耐藥腸球菌(VRE)， 結核分枝桿菌耐藥菌株(MDR-TB)以及最近引起廣泛關注的攜帶有新德裡金屬內醯胺酶-I(NDM-I)腸桿菌科「超級細菌」。這些耐藥菌的出現對人類公共衛生安全提出了嚴峻的挑戰，因而發展一種快速、簡便及高通量的方法用於抗菌藥物敏感性評價顯得尤為重要。其中，最小抑菌濃度(MIC)作為定量的指標廣泛用於藥物敏感性評價，因為它不但可以作為藥物篩選的重要指標，而且還可以作為醫師合理給藥的重要參考依據。目前，用於最小抑菌濃度測定的傳統方法主要包括常量紙片擴散法，瓊脂稀釋法， 肉湯稀釋法和抗生素梯度試紙法。然而，這些方法均依賴於微生物的生長，並且MIC數據的獲取是通過肉眼判斷而得到的，因而常常需要Μ-48小時或更長的時間才能夠達到肉眼分辨的程度。除此之外，僅憑肉眼觀察，很難正確並且重現性的確定生長抑制端點。為了克服以上不足，基於儀器的一些方法不斷湧現，包括螢光素酶報導噬菌體、電化學測量、實時定量PCR以及基於納米粒子的方法。雖然這些方法克服了傳統方法中長時間培養的不足，但是複雜的儀器要求、較低的靈敏度和重現性、複雜的操作步驟以及昂貴的實驗成本限制了這些方法的進一步高通量應用。
發明內容
本發明的目的是提供一種用於評價藥物抗菌敏感性的方法(也即輔助評價藥物對病原菌的敏感性的方法)。本發明提供的用於檢測藥物對病原菌的敏感性所用(也即輔助評價藥物對病原菌的敏感性)的一種化合物，其結構通式如式I所示(簡稱為PPP)，
權利要求
1.式I所示化合物，
2.一種製備權利要求1所述式I所示化合物的方法，包括如下步驟將2，5-二溴-1， (4-溴丁氧基)苯二酚、1，4_苯二硼酸新戊二酯和四(三苯基膦)鈀在惰性氣氛中於溶劑中混勻進行反應，反應完畢得到所述式I所示化合物。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述2，5_二溴-1，4-二(4-溴丁氧基)苯二酚、1，4_苯二硼酸新戊二酯和四(三苯基膦)鈀的用量比為 165mg 20mg ；所述溶劑由體積比為5. 4 3. 6的甲苯和碳酸鉀水溶液組成；其中，所述碳酸鉀水溶液的濃度為 2M;所述2，5-二溴-1，4-二(4-溴丁氧基)苯二酚與所述甲苯的用量比 5. 4mL ； 所述惰性氣氛為氮氣氣氛；所述反應步驟中，溫度為95°C，時間為M小時。
4.由權利要求1所述式I所示化合物和式II所示化合物組成的組合物在檢測藥物對病原菌的敏感性中的應用，
5. 一種輔助評價藥物抗菌敏感性的方法，包括如下步驟將待測藥物和病原菌混合， 再加入權利要求1所述式I所示化合物和式II所示化合物，檢測由所述待測藥物、所述病原菌及所述式I和式II所示化合物組成的體系的螢光光譜；若由所述待測藥物、所述病原菌及所述式I和式II所示化合物組成的體系的螢光光譜顯示為所述式II所示化合物的特徵綠色螢光，則候選確定所述病原菌對所述待測藥物敏感；若由所述待測藥物、所述病原菌及所述式I和式II所示化合物組成的體系的螢光光譜顯示為所述式I所示化合物的特徵藍色螢光，則候選確定所述病原菌對所述待測藥物不敏感；
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述檢測由所述待測藥物、所述病原菌及所述式I和式II所示化合物組成的體系的螢光光譜步驟中，激發光的波長為320-380nm，優選!355nm，功率為150W ；所述式II所示化合物的特徵綠色螢光的波長為450-550nm，優選505nm ；所述式I所示化合物的特徵藍色螢光的波長為380-500nm，優選420nm。
7.一種輔助評價藥物對病原菌的敏感性的方法，包括如下步驟1)製作標準曲線a)測定由所述式I、式II所示化合物和水組成的溶液甲在最大激發波長的螢光光譜， 得到所述溶液甲在發射波長為450-550nm與380-500nm處螢光強度的比值，記為FRET。；b)測定由所述步驟1)所述溶液甲和已知病原菌菌量的菌液組成的溶液乙在最大激發波長的螢光光譜，得到所述溶液乙在發射波長為450-550nm與380-500nm處螢光強度的比值，記為FRET乙；c)根據如下公式計算FRET乙比率的相對變化RCfket,並繪製RCfket對病原菌數量的螢光儀標準曲線
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述最大激發波長為320-380nm，優選 !355nm，功率為 150W ；所述溶液甲、乙和丙中，所述式I和式II所示化合物的終濃度均分別為 1Χ1(Γ7-8Χ1(ΓΜ 禾口 4Χ1(Γ8-14Χ1(Γ8Μ，優選分別為 4. 0Χ10"Μ 和 7 X KT8M ；所述步驟b)中，所述病原菌在所述溶液乙中的濃度為15-25 μ L/mL,優選20 μ L/mL。
9.一種輔助評價藥物對病原菌的敏感性的方法，包括如下步驟1)製作標準曲線a)將所述式I、式II所示化合物溶於由乙醇和水以體積比4.8-5. 5 100混勻而得的混合液中，得到溶液甲』，再加入到含有雙蒸水的微孔板中，得到溶液乙」，測定所述溶液乙」在最大激發波長380/20nm的螢光光譜，得到所述溶液乙」在發射波長為528/20nm與 440/30nm處螢光強度的比值，記為FRETtl ；b)將所述步驟1)所得溶液甲』加入到含有已知病原菌菌量菌液的微孔板中，得到溶液乙』，測定所述溶液乙』在最大激發波長為380/20nm的螢光光譜，得到所述溶液乙』在發射波長為528/20nm與440/30nm螢光強度的比值，記為FRET乙，；c)根據如下公式計算FRET乙』比率的相對變化RCfket,並繪製RCfket對病原菌數量的酶標儀標準曲線
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於所述溶液甲』、乙』和丙』中，所述式I和式II所示化合物的終濃度均分別為0. 5X10_6-3X10_6M和1 X 1(T-5X 10_7M，優選分別為 1. 5 X KT6M 和 2. 5 X KT7M ；所述步驟b)中，所述病原菌在所述溶液乙』中的濃度為0.075-0. 125 μ L/mL，優選 0.1 μ L/mLo
11.根據權利要求4所述的應用或權利要求4-10任一所述的方法，其特徵在於所述菌或病原菌均為耐藥菌和非耐藥菌中的至少一種，優選革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌和真菌中的至少一種，更優選大腸桿菌，更優選均為氨苄抗性大腸桿菌，尤其優選均為 AmprTOPlO 菌株；所述藥物或待測藥物均為氨苄青黴素鈉、青黴素G鈉鹽、硫酸鏈黴素、羧苄青黴素鈉、 鹽酸四環素、硫酸慶大黴素、氯黴素、紅黴素或噻孢黴素。
全文摘要
本發明公開了一種評價藥物抗菌敏感性的方法。該方法，是應用式(I)和式(II)所示化合物輔助給出抗生素對病原菌的定量敏感性數據；具有(低至2×104cfu)、快速(4-5小時)、準確以及可視等優點，並且能夠用於抗生素的高通量篩選；與各種技術先進的系統相比，本發明無需複雜的儀器設備，樣品處理簡單，成本低，外界非特異性影響小以及可以給出任意抑制百分比時的抗生素濃度。在臨床上，本方法可以用於抗菌敏感性的快速評價，指導醫師對病人更有針對性的給藥，這樣不僅可以提高治療的效率，同時可以降低由於不正確使用抗生素而產生抗藥性的問題。與此同時，本發明在食品安全、環境檢測等方面也會產生深遠的影響。式I式II
文檔編號G01N21/64GK102558511SQ201110430588
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月20日 優先權日2011年12月20日
發明者朱春雷, 楊瓊, 王樹 申請人:中國科學院化學研究所