質粒介導的端粒酶rna基因幹擾構建體及其構建方法

2023-09-16 07:16:25 1

專利名稱：質粒介導的端粒酶rna基因幹擾構建體及其構建方法
技術領域：
本發明屬於基因沉默技術領域，具體涉及一種針對人端粒酶RNA基因亞基的RNA 幹擾載體以及這種載體的製備方法和應用。
背景技術：
基因治療是指運用DNA轉移來治療乃至於預防一些疾病。比較準確的說，它指的 是遺傳信息相關的特異性DNA序列的轉移，是一項高度集成、綜合性高難度的生物技術。基 因治療是最初是以治療單基因遺傳病為主，而現已廣泛應用於腫瘤等疾病的治療研究。基因治療是將目的基因用基因轉移技術導入靶細胞，使其表達此基因而獲得特定 的功能，繼而執行或介導對患病細胞的殺傷和抑制作用，從而達到治療之目的。基因治療涉 及目的基因、載體及受體細胞三方面。有效的基因治療依賴於外源基因高效而穩定的表達。 利用病毒載體介導基因轉移，以其高轉染率和良好的靶向性而成為腫瘤基因治療中應用最 廣泛的方法治療基因的靶向性表達決定了基因治療能否成功。理想的腫瘤基因治療是， 目的基因的表達應能區別正常組織和腫瘤組織，且對腫瘤組織的類型無選擇性，能在多 種腫瘤組織中表達。利用特異性的基因啟動子使目的基因在特定的組織、細胞或器官 中表達，實現對腫瘤靶向性治療的目的。RNA幹擾(RNAinterference，RNAi)是由雙鏈 RNA (double-strandedRNA, dsRNA)引發的轉錄後基因靜默機制。RNAi是真核生物中普遍存 在的抵抗病毒入侵、抑制轉座子活動、調控基因表達的監控機制。目前已成功用於基因功能 和信號轉導系統上下遊分子相互關係的研究。隨著研究的不斷深入，RNAi的機制正在被逐 步闡明，而同時作為功能基因組研究領域中的有力工具，RNAi也越來越為人們所重視。RNAi 作為一種高效的序列特異性基因剔除技術在傳染性疾病和惡性腫瘤基因治療領域發展極 為迅速。在利用RNAi技術對HIV-1、B型肝炎、C型肝炎等進行基因治療研究中發現，選擇 病毒基因組中與人類基因組無同源性的序列作為抑制序列可在抑制病毒複製的同時避免 對正常組織的毒副作用。同時將抑制序列選擇在特定的位點，可對部分有明確基因突變的 惡性腫瘤細胞如含有BCL/ABL或AML1/MTG8融合基因的白血病細胞產生凋亡誘導作用。此 外尚可通過使用腫瘤特異性啟動子如hTERT啟動子、survivin啟動子或組織特異性啟動子 如酪氨酸酶啟動子、骨鈣素啟動子引導針對某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA或shRNA表 達，從而達到特異性殺傷腫瘤細胞的目的。外源的或體內產生的長雙鏈RNA(long double stranded RNA, dsRNA)首先被降解為長21 23bp的小分子雙鏈RNA，這種RNA分子稱為 小幹擾RNA(smallinterfering RNA, siRNA), siRNA通過鹼基互補配對識別具同源序列的 mRNA，並介導其降解。近年研究發現，端粒酶在80% 90%的腫瘤細胞中呈高密度表達，而在大部分正 常的體細胞中不表達。構建基於端粒酶基因核心啟動子調控的腫瘤細胞特異性表達可以很 好的顯示和檢測腫瘤細胞；而且可以達到較好的治療腫瘤的目的；基於端粒酶的基因治療 策略也在臨床應用中逐漸增加。
體外的siRNA的製備主要有5種方法，包括化學合成、體外轉錄、用RNaseIII消化 長片斷雙鏈RNA製備siRNA、siRNA表達載體、siRNA表達框架。多數的siRNA表達載體依賴3種RNA聚合酶III啟動子(pol III)中的一種，操 縱一段小的髮夾siRNA在哺乳動物細胞中的表達(1-4)。這3類啟動子包括人源和鼠源的 U6啟動子和人Hl啟動子。之所以採用RNA pol III啟動子是由於它可以在哺乳動物細胞 中表達更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串(3到6個)U來終止轉錄的。要使用這類 載體，需要2段編碼短髮夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應載體的pol III啟動子 下遊。由於涉及到克隆，這個過程需要幾天的時間，同時也需要經過測序以保證克隆的序列 是正確的。siRNA表達載體的優點在於這是眾多方法中唯一可以進行長期研究的方法——帶 有抗生素標記的載體可以在細胞中持續抑制靶基因的表達，持續數星期甚至更久。即使是 對轉染帶有篩選標記質粒的細胞進行瞬時篩選，也有助於富集帶質粒的細胞。這也可以幫 助解決一些難轉染的細胞由於轉染效率低造成的問題。最近多個廠家及實驗室開始研究逆轉錄病毒和其他病毒載體用於siRNA表達，其 優勢在於可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究，避免由於質粒轉染效率低而帶來 的種種不便。然而，病毒載體介導的目的基因長期表達已經被全世界許多實驗室應用，沒有 出現過任何意外，但仍具有潛在的致癌的風險，操作者在實驗中仍需要保持高度警惕，所有 操作均應儘量在BSL2級生物安全櫃中進行；必須高度注意被汙染的尖銳物品；所有接觸過 病毒的器具均應高壓消毒再進行下一步處理；裝盛慢病毒載體的實驗用品，要單獨放置，標 示清楚，並標註「危險品」字樣；對共用實驗室的人員進行病毒安全培訓或提示。本發明由 此而來。

發明內容
本發明的目的是提供一種質粒介導的端粒酶RNA基因幹擾構建體，解決了現有技 術中病毒載體操作過程不夠安全、基因沉默時間短、存在一些潛在致癌危險等問題。為了解決現有技術中的這些問題，本發明提供的技術方案如下一種質粒介導的端粒酶RNA基因幹擾構建體，其特徵在於所述構建體包括U6啟動子，所述啟動子為DNA依賴的RNA聚合酶III所識別；與啟動子有效連接的DNA片段，所述DNA片段具有為SEQ ID No 1的核苷酸單鏈 序列或其互補寡核苷酸單鏈。優選的，所述質粒選自PUC119質粒載體、EGFP-Cl質粒載體。優選的，所述的啟動子為人源或鼠源。優選的，所述的DNA片段的互補寡核苷酸單鏈序列為SEQ ID No 2SEQ ID No :3。本發明的又一目的在於提供一種質粒介導的端粒酶RNA基因幹擾構建體的構建 方法，所述方法包括以下步驟(1)、根據人端粒酶RNA基因選擇合適的幹擾靶點合成互補的兩條寡核苷酸單鏈， 所述互補寡核苷酸單鏈序列分別為SEQ ID No 2和SEQ IDNo 3 ；
(2)、以Hela細胞的基因組DNA為模板擴增得到TO啟動子，pUC119質粒載體多克 隆位點HindIII和BamHI間接U6啟動子，獲得重組體pUC119_U6啟動子；(3)、將互補寡核苷酸單鏈退火後得到的雙鏈定向克隆入質粒載體_啟動子載體， 獲得重組質粒pUC119-U6-shTR ；(4)以重組質粒pUC119-U6_shTR為模板以一對引物擴增獲得TO-shTR產物；(5)對TO-shTR產物進行酶切後，克隆入經線性化和去磷酸化處理的載體EGFP-Cl 中，獲得RNAi表達載體pEGFP-U6-shTR。優選的，所述方法中步驟(2)擴增是通過一對PCR引物PCR擴增得到的5』和3』 端引入HindIII和BamHI酶切位點的U6啟動子。優選的，所述一對引物具有下列核苷酸順序上遊引物SEQ ID No 4 ；下遊引物 SEQ ID No :5。優選的，所述方法步驟(4)中所述的一對引物具有下列核苷酸順序上遊引物 SEQ ID No 6 ；下遊引物=SEQ ID No :7。優選的，所述方法中載體EGFP-Cl通過MluI限制性內切酶線性化形成。本發明優選技術方案中採用HeLa細胞的基因組DNA為模板經PCR擴增得到U6啟 動子，為了避免TO啟動子末端序列被酶切位點的置換造成的轉錄活性的喪失，在pUC119質 粒載體多克隆位點HindIII和BamHI間接入U6啟動子，獲得重組體pUC119_U6。對所研究人端粒酶RNA基因[GI 38176147]選擇合適的幹擾靶點，並將其按 照特定形式分別合成兩條互補的寡核苷酸單鏈，按特定參數退火後，兩互補單鏈形成 一對雙鏈，將該退火雙鏈定向克隆入PUC119-U6載體的TO啟動子下遊，獲得重組質粒 pUCl 19-U6-shTR,並以TO啟動子、下遊退火DNA雙鏈及作為終止轉錄的連續5個T組成的表 達框為模板，用一對引物經PCR技術獲得TO-shTR產物，經引物中引入的酶切位點酶切後， 克隆入經線性化和去磷酸化處理的載體EGFP-Cl中，獲得理想的針對人端粒酶RNA亞基的 RNAi 表達載體，稱 pEGFP-U6-shTR。本發明的又一目的在於提供一種藥物組合物，其特徵在於包括權利要求1所述的 端粒酶RNA基因幹擾構建體。與現有技術中各類生物質秸稈制氣已有技術相比，本發明的有益效果在於1.本發明技術方案中採用質粒介導的RNA幹擾載體來轉染人腫瘤細胞，擯去了現 有技術中病毒載體可能帶來的潛在致癌危險，所以本發明進行RNA幹擾來維持基因沉默操 作較為安全。2、本發明的技術方案採用質粒介導的RNA幹擾載體能帶來較高的轉染成功率，而 且能維持長時間的基因沉默，可以應用於對人端粒酶RNA基因更安全、高效、長期的沉默研允。序列說明SEQ ID No 1表示具有人端粒酶RNA亞基(hTR)包含模板區的特異性19個鹼基 序列(靶位點)。SEQ ID No :2表示具有按照shRNA設計原則合成的、針對hTR模板區的、按照shRNA 設計原則合成的、5』帶有BamHl酶切位點和3』端帶有作為轉錄終止序列的5個連續T的 shRNA核苷酸單鏈序列。
5板區的、按照shRNA設計原則合成的、5，端帶有 帶有EcoRl酶切位點的shRNA互補寡核苷酸單鏈。SEQ ID No 4表示具有針對人U6啟動子序列設計的、5，端帶有HindIII酶切位點 及保護鹼基的PCR上遊引物核苷酸單鏈序列。SEQ ID No 5表示具有針對人U6啟動子序列設計的、5』端帶有BamHI酶切位點及 保護鹼基的PCR下遊引物核苷酸單鏈序列。SEQ ID No 6表示具有針對重組質粒pUC119-U6_shTR中U6啟動子及與其有效連 接的shTR片段序列設計的、5』端帶有MluI酶切位點及保護鹼基的PCR上遊引物核苷酸單 鏈序列。SEQ ID No 7表示具有針對重組質粒pUC119-U6_shTR中U6啟動子及與其有效連 接的shTR片段序列設計的、5』端帶有MluI酶切位點及保護鹼基的PCR下遊引物核苷酸單 鏈序列。


下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述圖1為本發明實施例pUC119-U6載體模式圖；圖2為本發明實施例pUC119-U6_shTR重組體模式圖；圖3為本發明實施例pEGFP-Cl質粒模式圖；圖4為本發明實施例pEGFP-U6_shTR重組體模式圖；圖5為pEGFP-U6-shTR的Hela細胞轉染後第210天光鏡下轉染效果圖；其中圖 5-A為普通光鏡40倍下觀察得到的，圖5-B為普通光鏡100倍下觀察得到的；圖5-C為普 通光鏡400倍下觀察得到的，圖5-D為螢光鏡40倍下觀察得到的，圖5-E為螢光鏡100倍 下觀察得到的，圖5-F為螢光鏡400倍下觀察得到的；圖6為RT-PCR方法檢測不同實驗組hTR的表達水平；圖7為MTT法繪製的細胞生長曲線。
具體實施例方式以下結合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，這些實施例是用於說明 本發明而不限於限制本發明的範圍。實施例中採用的實施條件可以根據具體廠家的條件做 進一步調整，未註明的實施條件通常為常規實驗中的條件。實施例lpEGFP-U6_shTR重組載體的構建以HeLa細胞的基因組DNA為模板經PCR擴增得到U6啟動子；將鹼裂解法提取的 質粒pUC119和純化的U6啟動子PCR產物分別用HindIII和BamHI雙酶切，低熔點瓊脂糖 凝膠電泳回收目的片段，連接，轉化感受態JM109，塗板藍白斑篩選，雙酶切鑑定和PCR鑑定 重組體pUC119-U6(如圖1)，最後測序確認。合成兩個寡核苷酸單鏈片段用TE溶為lOOuM，上下兩互補鏈以1 1比例混合，按 以下程序進行95°C 30s ；72°C 2min ；37°C 2min ；25°C 2min ；冰浴lOmin。退火形成的雙鏈 即可與RNAi載體連接或貯於-20°C備用。將鹼裂解法提取的質粒pUC119-U6分別用BamHI和EcoRI雙酶切，低熔點瓊脂糖
6凝膠電泳回收目的片段，與退火雙鏈片段連接，轉化感受態JM109，塗板藍白斑篩選，雙酶切 鑑定和PCR鑑定重組體PUC119-U6，最後測序確認。將鹼裂解法提取的質粒EGFP-Cl用MluI酶切，低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收目的片 段後去磷酸化處理。以 pUC119-U6-shRNA 為模板，用引物(SEQ ID No 6 和 SEQ ID No 7)經 PCR 技術 獲得TO-shRNA產物，利用引物中引入的MluI酶切後，克隆入經MluI線性化載體EGFP-Cl 中，獲得理想的RNAi表達載體，為pEGFP-U6-shRNA，篩選後的陽性克隆進行測序證實。實施例2將pEGFP-U6_shTR重組載體轉染入腫瘤細胞的步驟分空白組、空載體組和實驗組進行細胞轉染處理；轉染步驟如標準步驟，可如下1.脂染前24h，選擇狀態良好的Hela細胞以6X 105個/孔接種於六孔板，加2ml 完全培養基，轉染時細胞匯合度應達到90% _95%，轉染前細胞換新鮮的完全培養基。2.取 2 支 1. 5mlEP 管，A 管 250ul 無血清 DMEM+4ugpEGFP_U6_shRNA ；B 管 250ul 無 血清DMEM+lOul脂質體lipofectamineTM2000分別室溫放置5min，將兩管內液體充分混合， 室溫放置20min。3.將混合物加到含細胞和完全培養基的孔內，充分混合。4.將六孔板放回37°C，5% CO2培養箱中繼續培養。該細胞轉染後損傷較輕，不必 換液。如果細胞對脂質體較敏感損傷嚴重，需在轉染後6小時換新鮮完全培養基。按此操 作步驟轉染效率可大於80 %。5.穩定轉染細胞克隆的篩選如要獲得100%轉染效率，需進行穩定轉染細胞克隆的篩選。穩定轉染細胞克隆 的篩選轉染後24h，將轉染細胞以1 10的比例傳代，24小時後，加選擇培養基G418，對於 HeLa細胞可用600ug/mlG418篩選陽性細胞，10至14天後，非穩定轉染細胞死去，陽性克隆 長出。可在螢光顯微鏡下標記發綠色螢光的細胞克隆並挑取，經有限稀釋後擴大培養。經 轉讓後的效果如圖5所示。用RT-PCR方法分析各細胞株hTR的表達分別收集轉染24、48、72h細胞，提取細胞 總RNA，並進行逆轉反應。其中內參DAPDH擴增產物理論大小為311bp，目的基因hTR擴增 產物理論大小為179bp。對heLA細胞2%瓊脂糖凝膠電泳進行鑑定，測得結果如圖6所示，其中M =DLlOOO Marker 條帶分子量從小到大依次為100，200，300，400，500，700，IOOObp ； 1-3 依次為 RT-PCR檢測Hela細胞空白組、空載體組和實驗組細胞內參GAPDH的表達水平；4_6 依次為 RT-PCR檢測Hela細胞空白組、空載體組和實驗組細胞hTR的表達水平；由圖6可知，第6泳 道中實驗組細胞hTR的表達水平明顯被沉默。按上法處理細胞24、48、72、96、120、144h後，進行MTT染色，MTT法檢測He 1 a細胞 空白組、空載體組和實驗組細胞的增殖速度如圖7所示，實驗組細胞生長速度較空白組和 空載體組顯著減慢。上述實例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在於讓熟悉此項技術的人是 能夠了解本發明的內容並據以實施，並不能以此限制本發明的保護範圍。凡根據本發明精 神實質所做的等效變換或修飾，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。序列表顧天一
質粒介導的端粒酶RNA基因幹擾構建體及其構建方法

7
1
19
DNA

1
GTCTAACCCT AACTGAGAA19
2 58 DNA 2
GATCCGTCTA ACCCTAACTG AGAATTCAAG58
AGATTCTCAG TTAGGGTTAG ACTTTTTG
3
57
DNA

3
CAGATTGGGA TTGACTCTTA AGTTCTCTAA57
GAGTCAATCC CAATCTGAAA AACTTAA
4
29
DNA

4
GCGAAGCTTA AGGTCGGGCA GGAAGAGGG 29
5
29
DNA

5
GCGGGATCCT CGTCCTTTCC ACAAGATAT 29 6 28 DNA
8
6CCGACGCGTT CACACAGGAA ACAGCTAT28727DNA7CCGACGCGTT TGTAAAACGA CGGCCAG2權利要求
一種質粒介導的端粒酶RNA基因幹擾構建體，其特徵在於所述構建體包括U6啟動子，所述啟動子為DNA依賴的RNA聚合酶III所識別；與啟動子有效連接的DNA片段，所述DNA片段具有為SEQ ID No1的核苷酸單鏈序列或其互補寡核苷酸單鏈。
2.根據權利要求1所述的端粒酶RNA基因幹擾構建體，其特徵在於所述質粒選自 PUC119質粒載體、EGFP-Cl質粒載體。
3.根據權利要求1所述的端粒酶RNA基因幹擾構建體，其特徵在於所述的啟動子為人 源或鼠源。
4.根據權利要求1所述的端粒酶RNA基因幹擾構建體，其特徵在於所述的DNA片段的 互補寡核苷酸單鏈序列為SEQ ID No 2SEQ ID No :3。
5.一種權利要求1所述的幹擾構建體的製備方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟(1)、根據人端粒酶RNA基因選擇合適的幹擾靶點合成互補的兩條寡核苷酸單鏈，所述 互補寡核苷酸單鏈序列分別為SEQ ID No 2和SEQ ID No 3 ；(2)、以Hela細胞的基因組DNA為模板擴增得到U6啟動子，pUC119質粒載體多克隆位 點HindIII和BamHI間接入U6啟動子，獲得重組體pUC119_U6啟動子；(3)、將互補寡核苷酸單鏈退火後得到的雙鏈定向克隆入質粒載體_啟動子載體，獲得 重組質粒 pUC119-U6-shTR ；(4)以重組質粒pUC119-U6-shTR為模板以一對引物擴增獲得TO_shTR產物；(5)對TO-shTR產物進行酶切後，克隆入經線性化和去磷酸化處理的載體EGFP-Cl中， 獲得RNAi表達載體pEGFP-U6-shTR。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述方法中步驟(2)擴增是通過一對PCR 引物PCR擴增得到的5』和3』端引入HindIII和BamHI酶切位點的U6啟動子。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述一對PCR引物包括上、下遊引物，所 述上遊引物具有下列核苷酸順序SEQ ID No :4;所述下遊引物具有下列核苷酸順序SEQ ID No :5。
8.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述方法步驟(4)中所述的一對引物包括 上下遊引物，所述上遊引物具有下列核苷酸順序SEQ ID No :6 ；所述下遊引物具有下列核苷 酸順序 SEQ ID No :7ο
9.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述方法中載體EGFP-Cl通過MluI限制性 內切酶線性化形成。
10.一種藥物組合物，其特徵在於包括權利要求1所述的端粒酶RNA基因幹擾構建體。
全文摘要
本發明公開了一種質粒介導的端粒酶RNA基因幹擾構建體，其特徵在於所述構建體包括U6啟動子，所述啟動子為DNA依賴的RNA聚合酶III所識別；與啟動子有效連接的DNA片段，所述DNA片段具有為SEQ ID No1的核苷酸單鏈序列或其互補寡核苷酸單鏈。該幹擾構建體能夠高效轉染人腫瘤細胞、能維持長時間的基因沉默，操作過程安全，無潛在致癌危險。
文檔編號A61K48/00GK101921805SQ201010109279
公開日2010年12月22日 申請日期2010年1月26日 優先權日2009年4月8日
發明者顧天一 申請人:顧天一