螢光定量pcr溶解曲線在監測tcrcdr3譜系漂移中的應用的製作方法
2023-09-16 07:12:40
專利名稱：：螢光定量pcr溶解曲線在監測tcrcdr3譜系漂移中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及監測TCRCDR3譜系漂移
技術領域：
，特別是涉及用螢光定量PCR溶解曲線來監測TCRCDR3譜系漂移的應用。
背景技術：
：近年來，隨著用於特異T細胞研究的四聚體技術、TCR免疫掃描譜型分析技術(ImmunoscopeSpectratyping)、轉特異TCR基因小鼠技術等的發展和應用，T細胞的生長、分化、增殖在分子水平上的整體畫面逐漸清晰，這使得對臨床疾病整體樣本中克隆增殖的腫瘤T細胞、特異應答/耐受T細胞的監測成為可能。這些技術中，能從整體水平上去分析特異T細胞的主要方法是TCRCDR3譜系多態性和長度分析技術(TCRCDR3譜系漂移分析技術或稱T細胞免疫指紋技術)和ELISpot技術等，其中T細胞TCRe鏈的CDR3譜型分析技術應用較廣，目前已在感染性疾病(HIV、病毒性肝炎、麻疹等)、腫瘤(白血病、大腸癌、黑色素瘤等)、移植(腎和骨髓移植等)、自身免疫病(SLE、類風溼性關節炎等)中研究報導。螢光定量PCR技術因具有特異性、準確性、全封閉反應等優點，已經成為分子生物學、分子免疫學等實驗研究中的重要手段，近年來FQ-PCR中的SYBYGreen螢光染料因能與所有的DNA雙鏈相結合，對DNA模板沒有選擇性，適用於多種目的產物的檢測，其中的FQ-PCR溶解曲線分析法是把PCR產物從一定的溫度開始緩慢上升至95。C，擴增產物雙鏈DNA隨溫度升高逐漸變性解鏈產生單鏈，嵌到雙鏈中的螢光染料SYBRGreen釋放出來，反應中的螢光信號隨之衰減，儀器自動檢測反應管內螢光信號的變化，最後繪製出擴增產物螢光信號隨溫度變化的溶解曲線，對螢光信號強度變化的負一次導數與溫度作圖，則得到相應PCR產物的溶解曲線峰圖。目前，螢光定量PCR溶解曲線主要應用於監測PCR反應產物的特異性。國內外目前監測TCRCDR3譜系漂移採用的是基因掃描分析技術，即對TCRCDR3譜系進行"PCR"和"PCR產物掃描"分析，對標記的PCR產物進行測序儀的凝膠掃描或毛細管電泳PCR分析，了解TCRCDR3譜系漂移情況，但該方法成本高，操作複雜，因需進行兩步的分析，幹擾結果的因素也會增加。
發明內容理論上，不同大小、不同基因所得到的PC財廣增產物的螢光定量PCR溶解曲線峰型圖是不一樣的，該PCR溶解曲線與TCRCDR3譜系漂移存在某種關係，本發明所要解決的技術問題就是提供螢光定量PCR溶解曲線在監測TCRCDR3譜系漂移中的應用。為了解決上述技術問題，本發明採用如下的技術方案螢光定量PCR溶解曲線在監測TCRCDR3譜系漂移中的應用將螢光定量PCR溶解曲線用於監測TCRCDR3譜系漂移。上述螢光定量PCR溶解曲線應用於監測人體的TCRCDR3譜系漂移。前述監測的方法為分析螢光定量PCR溶解曲線，當該曲線出現單峰、寡峰或偏峰時，即存在TCRCDR3譜系漂移。前述螢光定量PCR溶解曲線是這樣得到的首先對待測樣本加入螢光染料進行PC財廣增，擴增產物以0.2。C/秒的速度從75。C增至95。C，每秒讀取一次螢光值，100cycle,繪製出擴增產物螢光信號隨溫度變化的溶解曲線，對螢光信號強度變化的負一次導數與溫度作圖，即得待測樣本的螢光定量PCR溶解曲線。比如:TCR6鏈CDR3譜系的溶解曲線分析技術是根據TCR基因重排規則，TRBV基因家族特點，設計26個e鏈特異性上遊引物及l個共同下遊引物TRBC，經螢光定量PC財廣增後，75°C95。C時每升高0.2度讀取一次螢光值(100cycles)得到每個家族溶解曲線圖，從圖上即可分析TCRCDR3的單/寡/多克隆性增生情況(譜系漂移)。與現有技術相比，本發明將螢光定量PCR溶解曲線應用於TCRCDR3譜系漂移的監測，其中的"PCR"和"CDR3譜型"分析在封閉管中一步完成，因同時能對每個TRBV或TCRAV家族的CDR3PCR產物進行相對定量和克隆增生情況分析，是一種較為簡便的適用於臨床樣本研究的方法，特別適用於臨床外周血和組織樣本TCRCDR3譜系漂移的監測，經實驗證實該方法準確、經濟、簡便、快速，在腫瘤、感染患者的T細胞應答機制上具有很好的理論和應用價值。圖l:正常人-1PBMC中26個TRBV家族CDR3溶解曲線譜型圖。TRBV1TRBV24呈不規則的多峰圖型，無單峰、寡峰、偏峰及極低水平或缺失現象，對照的TRBC、e-actin、GAPDH呈明顯的單峰圖型，陰性對照無溶解曲線峰(圖中列出TRBV1TRBV2GAPDHControl)。圖2:大腸癌患者-1PBMC中26個TRBV家族CDR3溶解曲線譜型圖。TRBV1TRBV24圖中呈現數量不等的單峰(TRBV17TRVV20)、雙峰(TRBV11TRBV13-1)、偏峰(TRBV16)及極低水平或家族缺失(TRBV3TRBV18)現象，對照的TRBC、p-actin、GAPDH呈單峰圖型，陰性對照無溶解曲線峰(圖中列出TRBV1TRBV20TRBV11TRBV16GAPDHControl)。圖3:正常人-1PBMC中32個TRAV家族CDR3溶解曲線譜型圖。TRAV1.1TRAV32呈不規則多峰圖型，無單峰、寡峰、偏峰及極低水平或缺失現象，對照的GAPDH呈明顯的單峰圖型，陰性對照無溶解曲線峰(圖中列出TRAVl.1TRAV1.2GAPDHControl)。圖4:大腸癌患者-1PBMC中32個TRAV家族CDR3溶解曲線譜型圖。TRAV1.1TRAV32呈現數量不等的單峰(TRAV4.2、TRAV10)、雙峰(TRAV9、TRAV12、TRAV19)、偏峰(TRAV16)、及極低7K平或缺失(TRAV8、TRAVll、TRAV13、TRAV18、TRAV32)現象，對照的GAPDH呈明顯的單峰圖型，陰性對照無溶解曲線峰(圖中列出TRAVl.1TRAV10TRAV9TRAV12GAPDHControl)。具體實施例方式以分析人的TCRa和{3鏈CDR3譜系漂移為例。實施例l:正常人12例外周血標本的TCRCDR3譜系漂移(同時監測26個TRBV基因家族和34個TRAV基因家族的CDR3譜系漂移情況)1、設計併合成引物設計併合成人TRBV基因家族上遊引物26條，共同的TRBC下遊引物1條，對照TRBC上遊引物一條，對照的GAPDH、e-Actin上、下遊引物(見表l)。設計併合成人TRAV基因家族上遊引物34條，共同的TRAC下遊引物1條，對照的GAPDH上、下遊引物(見表2)。表l:TCRe鏈CDR3譜系26個家族的TRBV引物及對照的TRBC、GAPDH、Actin上下遊弓tableseeoriginaldocumentpage5tableseeoriginaldocumentpage6tableseeoriginaldocumentpage7tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage9Ul、純水7ul，總體積20ul;標準曲線選取JEC細胞株的GAPDH表達量為相對量標準；(2)擴增反應條件一94°C3min，1cycles;94°C30sec，55°C30sec，72°C50sec，45cycles;72°C10min1cycles;二溶解曲線分析75°C95°C以O.2"C/秒的速度升溫，每秒讀取螢光值一次，100cycle,三溶解曲線分析後的PCR產物按步驟①的反應條件，將45cycles改成5cycles進行PCR，PCR產物8ml在l.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，餘-2(TC保存備用。4、TRAV家族CDR3區段cDNA的FQ-PC財廣增(1)每例樣本做36個PCR反應管，第l至34管分別加入TRAVl至TRAV32上遊引物ly1(各引物濃度均為10mmol/L，TRAVl和TRAV4分別為兩個亞家族)，l-34管每管加入TRAC下遊引物lyl，第35管加GAPDH上、下遊引物lyl，第36管為無引物的陰性對照管；每個PCR反應管分別加樣品lyl、螢光定量MixlOy1、純水7yl，總體積20yl;標準曲線選取JEC細胞株的GAPDH表達量為相對量標準；(2)反應條件①94。C3min，1cycles;94。C30sec，55。C30sec，72。C50sec，45cycles;72°C10min，lcycles;②溶解曲線分析擴增產物以O.2'C/秒的速度從75'C增至95。C，每秒讀取一次螢光值，100cycle,繪製出擴增產物螢光信號隨溫度變化的溶解曲線，對螢光信號強度變化的負一次導數與溫度作圖，即得待測樣本的螢光定量PCR溶解曲線;③溶解曲線分析後的PCR產物按步驟①的反應條件，將45cycles改成5cycles進行PCR，PCR產物8yl在l.5%瓊脂糖凝膠將進行電泳，餘-2(TC保存備用。5、所得螢光定量PCR溶解曲線如圖1和圖3(正常人-1的PCR溶解曲線圖)所示，根據各家族的溶解曲線，詳細分析TCRCDR3譜系的漂移根據溶解曲線的峰型來判斷，命名為CDR3譜系溶解曲線峰(meltingcurvespectratypingofCDR3):(1)單峰出現顯著的單個峰;(2)寡峰出現明顯的2條或2條以上異常峰；(3)偏峰在非標準的正態分布家族中，出現較顯著的異常峰；(4)多峰，規則的正態分布峰。當出現了單峰、寡峰或偏峰時，即可判斷產生了譜系漂移。實施例2:按照實施例1的方法監測大腸癌患者12例的外周血和手術切除的癌周圍組織樣本的TCRCDR3譜系漂移(同時監測26個TRBV基因家族和34個TRAV基因家族的CDR3譜系漂移情況)。所得螢光定量PCR溶解曲線示例如圖2和圖4所示(其中一名大腸癌患者的PCR溶解曲線圖)。在12例患者中，發現多個TCRCDR3漂移家族，目前共得到單克隆增生家族20多個，並已測序出各特異的TCRCDR3基因序列。實施例3:按照實施例1的方法監測B型肝炎患者24例的外周血和肝組織樣本的TCRCDR3譜系漂移(同時監測26個TRBV基因家族和34個TRAV基因家族的CDR3譜系漂移情況)。在24例患者中，發現多個TCRCDR3漂移家族，目前共得到單克隆增生家族30多個，並已測序出各特異的TCRCDR3基因序列。實施例4:按照實施例1的方法監測淋巴癌患者10例的組織標本和10例的T細胞白細胞患者外周血標本的TCRCDR3譜系漂移(同時監測26個TRBV基因家族和34個TRAV基因家族的CDR3譜系漂移情況)。在10例患者中，發現多個TCRCDR3漂移家族，目前共得到單克隆增生家族IO多個，並已測序出各特異的TCRCDR3基因序列。實施例5:按照實施例1的方法監測流行性出血熱患者15例的外周血標本的TCRCDR3譜系漂移(同時監測26個TRBV基因家族和34個TRAV基因家族的CDR3譜系漂移情況)。在15例患者中，發現多個TCRCDR3漂移家族，目前共得到單克隆增生家族30多個，並已測序出各特異的TCRCDR3基因序列。從實施例1至5可以看出正常人PBMC的標本中發現正常人PBMC的26個TRBVCDR3譜型和34個TCRAVCDR3譜型螢光定量PCR溶解曲線分析結果提示，26個TRBV和34個TCRAV家族均呈多克隆增生(多峰)，與前期建立的GeneScan分析方法所得結果相同，而對照管的TRBC、f3-actin、GAPDH為單峰圖型，說明各個TRBV家族CDR3中存在多種CDR3產物，提示溶解曲線法適宜分析螢光定量PCR產物的多態性，可用於TCRCDR3的譜型分析。臨床腫瘤感染患者的外周血和組織樣本26個TRBV和34個TCRAV家族族均存在不同的單克隆(單峰)、寡克隆(雙峰/偏峰)、多克隆(多峰)增生及表達，部分家族消失(無峰)c臨床患者的單克隆增生家族的TRBV和TRAV均能測序出TCR基因序列，分別翻譯成胺基酸序列，模擬出結構，可用於相應疾病的個體化診斷和治療。權利要求1.螢光定量PCR溶解曲線在監測TCRCDR3譜系漂移中的應用，其特徵在於將螢光定量PCR溶解曲線用於監測TCRCDR3譜系漂移。2.按照權利要求l所述的應用，其特徵在於將螢光定量PCR溶解曲線用於監測人體的TCRCDR3譜系漂移。3.按照權利要求1或2所述的應用，其特徵在於所述監測的方法為:分析螢光定量PCR溶解曲線，當該曲線出現單峰、寡峰或偏峰時，即存在TCRCDR3譜系漂移。4.按照權利要求1或2所述的應用，其特徵在於首先對待測樣本加入螢光染料進行PC財廣增，擴增產物以O.2"C/秒的速度從75。C增至95。C，每秒讀取一次螢光值，100cycle,繪製出擴增產物螢光信號隨溫度變化的溶解曲線，對螢光信號強度變化的負一次導數與溫度作圖，即得待測樣本的螢光定量PCR溶解曲線。全文摘要本發明公開了一種螢光定量PCR溶解曲線在監測TCRCDR3譜系漂移中的應用，將螢光定量PCR溶解曲線應用於TCRCDR3譜系漂移的監測，其中的「PCR」和「CDR3譜型」分析在封閉管中一步完成，因同時能對每個TRBV或TCRAV家族的CDR3PCR產物進行相對定量和克隆增生情況分析，是一種較為簡便的適用於臨床樣本研究的方法，特別適用於臨床外周血和組織樣本TCRCDR3譜系漂移的監測，經實驗證實該方法準確、經濟、簡便、快速，在腫瘤、感染患者的T細胞應答機制上具有很好的理論和應用價值。文檔編號C12Q1/68GK101619363SQ20091030246公開日2010年1月6日申請日期2009年5月20日優先權日2009年5月20日發明者姚新生,湯賢英,明覃,銳馬申請人:遵義醫學院