一種具有物理、生物雙重靶向作用的肝癌治療新製劑的製作方法

2023-09-16 23:55:20 1

專利名稱：一種具有物理、生物雙重靶向作用的肝癌治療新製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種採用現代藥劑學技術製備的肝癌靶向治療新製劑。超聲波輻照產生的生物效應使腫瘤血流量增多，血管通透性加大，進而使多烯紫杉醇納米粒大量聚集在腫瘤局部，並通過受體介導的內吞途徑進入腫瘤細胞內，從物理學、生物學雙重途徑發揮肝癌革巴向治療作用。
背景技術：
肝癌全球發病率已超過62. 6萬/年，其中55%的病例發生在中國。目前肝癌的治療手段主要有外科手術切除和局部介入治療，各種技術尤其是腫瘤局部消融技術發展迅猛並廣泛應用於臨床。但研究結果表明，肝癌患者的5年生存率並沒有明顯提高。因此，探索更為有效的肝癌治療方法對延長患者的生命，提高生活質量具有極為重要的意義。·
多烯紫杉醇是一種半合成抗腫瘤藥物，已經廣泛應用於如乳腺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、胃癌和頭頸部腫瘤等多種惡性腫瘤的化療。體內外研究表明，多烯紫杉醇具有較強的抗肝細胞癌作用。但由於多烯紫杉醇難溶於水，目前臨床上使用製劑多採用吐溫增溶，容易引起過敏反應。此外，系統化療引起的骨髓抑制、神經、心臟及肝腎毒性等不良反應較明顯。因此，改變多烯紫杉醇劑型，提高其水溶性與腫瘤靶向性，對提高其抗腫瘤療效、降低毒副作用具有重要意義。腫瘤靶向治療是現代腫瘤治療研究的重點與熱點之一，其利用特異性載體，將藥物或其他殺傷腫瘤細胞的活性成分選擇性地運送到腫瘤靶部位，具有高效、低毒的抗腫瘤優勢。肝癌細胞表面存在去唾液酸糖蛋白受體，可特異性識別末端帶有半乳糖殘基的糖蛋白並與之結合，再通過細胞內吞作用，主動轉入細胞內發揮抗腫瘤作用。去唾液酸糖蛋白受體已經成為肝癌靶向治療研究的重要靶點之一。
單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸是一種兩嵌段聚合物，常用於製備各種載藥納米粒。疏水性的聚乳酸羥基乙酸位於納米粒的核心，包裹各種難溶性抗腫瘤藥物。親水性的聚乙二醇分布在納米粒表面，明顯改善了納米粒的親水性和表面穩定性，並可顯著減少網狀內皮系統對納米粒的攝取清除作用，使納米粒具有長循環的效果。

發明內容
本發明的目的是提供一種具有物理、生物雙重靶向作用的肝癌治療新製劑以及在製備烯紫杉醇靶向納米粒聯合超聲輻照治療腫瘤的藥物中的應用。本發明的目的是這樣實現的，所述的一種具有物理、生物雙重靶向作用的肝癌治療新製劑，為乳化-溶劑揮發法製備的多烯紫杉醇靶向納米粒，採用單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸、多烯紫杉醇和半乳糖化膽固醇溶於二氯甲烷形成有機相；吸取有機相，緩緩注入到聚乙烯醇水溶液中，超聲乳化，獲得的乳化液倒入另一聚乙烯醇水溶液中，攪拌去除二氯甲烷，經聚碳酸酯膜過濾，真空冷凍乾燥，6tlCo輻照滅菌後獲得多烯紫杉醇靶向納米粒。所製得的多烯紫杉醇靶向納米粒的平均粒徑為209. 3nm,多元分散係數為O. 40 ；多烯紫杉醇靶向納米粒的載藥率為3. 79%。本發明所述的一種具有物理、生物雙重靶向作用的肝癌治療新製劑的製備方法，步驟為精密稱取IOOmg單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸輕基乙酸、5mg多烯紫杉醇、15mg半乳糖化膽固醇Gal-C4-Chol，溶於I ml 二氯甲烷，60°C渦旋震蕩，使其充分溶解，為有機相；用注射器吸取有機相，緩緩注入到3ml 5 % (體積分數)聚乙烯醇水溶液中，超聲乳化，50 W,工作30 sec，間歇5 sec，乳化5次，乳化液倒入到8ml I % (體積分數)聚乙烯醇溶液，磁力攪拌去除二氯甲烷，聚碳酸酯膜過濾，真空冷凍乾燥，6°Co輻照滅菌後4°C保存。本發明所述的一種具有物理、生物雙重靶向作用的肝癌治療新製劑在製備烯紫杉醇靶向納米粒聯合超聲輻照治療腫瘤的藥物中的應用。本發明的優點為超聲波在生物體內傳播時，可產生熱效應、空化效應、機械效應等，進而使組織血流量增多，血管通透性加大。正常組織血管內皮間隙多小於lOOnm，粒徑大於IOOnm的顆粒難以通過血管內皮到達組織間隙。本發明採用乳化溶劑揮發法製備靶向 肝癌的載多烯紫杉醇高分子納米粒，粒徑約200nm，靜脈注射後難以進入正常組織間隙，再通過超聲波輻照提高腫瘤局部血流量，擴張腫瘤血管通透性，使納米粒大量聚集在腫瘤局部，並且通過去唾液酸糖蛋白受體進入肝癌細胞內，發揮高效、低毒的肝癌靶向治療效果。體內抗腫瘤實驗得出，多烯紫杉醇靶向納米粒聯合超聲輻照進行治療效果最佳，抑瘤率達74. 2%，明顯高於其它各組，二者聯合具有協同抗腫瘤作用。


圖I為多烯紫杉醇靶向納米粒的掃描電鏡圖。圖2為多烯紫杉醇靶向納米粒在磷酸鹽緩衝液中釋放圖，6h釋放了 11. 3%，3天累積釋放了 78. 1%。
具體實施例方式I、多烯紫杉醇靶向納米粒的製備
採用乳化-溶劑揮發法製備多烯紫杉醇靶向納米粒。精密稱取IOOmg單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸輕基乙酸、5mg多烯紫杉醇、15mg半乳糖化膽固醇Gal-C4_Chol,溶於I ml 二氯甲烷，渦旋震蕩，使其充分溶解，為有機相；用注射器吸取有機相，緩緩注入3ml 5 % (體積分數)聚乙烯醇水溶液中，超聲乳化，50 W，工作30 sec，間歇5 sec，乳化5次，乳化液倒入8ml I % (體積分數)聚乙烯醇溶液，磁力攪拌去除二氯甲烷，聚碳酸酯膜過濾，真空冷凍乾燥，6°Co輻照滅菌後4°C保存備用。2、多烯紫杉醇靶向納米粒的表徵
配製多烯紫杉醇靶向納米粒水溶液，充分超聲分散後，滴於覆蓋碳膜的銅網上，乾燥後用離子鍍膜儀濺金，在掃描電子顯微鏡下觀察可見納米粒分散良好，呈類球形(見圖I)。雷射粒徑儀測得多烯紫杉醇靶向納米粒的平均粒徑為209. 3nm，多元分散係數為O. 40。採用高效液相色譜檢測多烯紫杉醇靶向納米粒的載藥率。流動相甲醇/水=75/25(體積比)，流速1. Oml/min,柱溫30°C，檢測波長227nm。精密稱取多烯紫杉醇靶向納米粒IOmg於5ml離心管中，加入O. 5ml 二氯甲燒,充分溶解後加入2. 5ml甲醇,潤旋IOmin,5000rpm離心lOmin，取上清液20μ1進樣，測得載藥率為3. 79%。
3、多烯紫杉醇靶向納米粒的體外釋放
以O. 02 mol/L的磷酸鹽緩衝液(pH 7. 2)製備多烯紫杉醇靶向納米粒溶液(含O. 02 %(體積分數)NaN3、0. I % (體積分數)吐溫80)，於37°C，80rpm恆溫搖床震蕩進行體外釋放，定時取樣，5000rpm超濾離心10分鐘，濾液行高效液相色譜測定多烯紫杉醇含量。結果多烯紫杉醇靶向納米粒在磷酸鹽緩衝液中平穩釋放，6h釋放了 11. 3%，3天累積釋放了 78. 1%(圖 2)。4、多烯紫杉醇靶向納米粒的急性毒性試驗
取昆明種小鼠80隻，體質量為18 22 g，雌雄各半，隨機分為10組，每組8隻，分別經鼠尾靜脈注射多烯紫杉醇靶向納米粒溶液(多烯紫杉醇劑量分別為80、120、180、270、405mg/kg)和多帕菲注射液(多烯紫杉醇劑量分別為15、23、34、51、76 mg/kg)。給藥後常規飼養2周，記錄小鼠的外觀、活動和死亡情況等。改良寇氏法測得多帕菲注射液小鼠半數致死量為47. 3mg/kg,而多烯紫杉醇祀向納米粒的小鼠半數致死量升高到219. 5mg/kg。5、超聲輻照對腫瘤血流灌注的影響
體外培養人肝癌細胞H印G2，大量擴增後用生理鹽水調整細胞密度約I X 107/ml，每隻裸鼠右腋下注射O. 2 ml細胞懸液。2周後選取腫瘤最大徑I. 7 2. Ocm荷瘤裸鼠12隻,分為對照組與超聲輻照組，每組6隻。對照組裸鼠尾靜脈團注超聲造影劑S0n0Vue(5ml/kg)，SEQUOIA 512超聲診斷儀進行超聲造影。超聲輻照組裸鼠先行腫瘤超聲輻照，頻率840kHz、聲強O. 75w/cm2,福照2min後立即進行超聲造影。啟動造影分析軟體Syngo US Workplace,·比較兩組腫瘤造影始增時間(AT)、達峰時間(TTP)、峰值-基礎強度差(PBD)等參數。結果，超聲輻照後，腫瘤峰值-基礎強度差明顯高於對照組(P〈0. 05)，表明腫瘤血流灌註明顯增多。表I超聲輻照對腫瘤血流灌注的影響(i 土s)
...... —割.................................................................AT..........................................................................ITP.......................................................................PBD.................................
wi ,J ω Cs) uffi.o......涵.....................................................i7s9 + o7fM...........................Γ2 ±Γ 32.............................2 Γ6 Τ678；Γ
超盧_ 照 I, Π + ΛK 01 + 1. I I ；!9, 78 士 9, :F
6、超聲福照對藥物分布的影響
取腫瘤最大徑I. 7 2. Ocm荷瘤裸鼠12隻，分為多烯紫杉醇靶向納米粒與多烯紫杉醇靶向納米粒聯合超聲輻照組，每組6隻。裸鼠尾靜脈注射納米粒(多烯紫杉醇10mg/kg)後，聯合超聲輻照組腫瘤行超聲輻照，頻率840kHz、聲強0. 75w/cm2的超聲輻照2min，間隔2h重複輻照I次，共3次。取腫瘤組織勻漿抽提多烯紫杉醇，高效液相色譜檢測。結果，聯合超聲輻照組腫瘤組織多烯紫杉醇藥物量為2. 9±0. 5μ g/g蛋白，是單純多烯紫杉醇靶向納米粒組的I. 8倍。7、體內抗腫瘤作用
選取腫瘤最大徑約I. O Cm的荷瘤裸鼠25隻，隨機分為5組，每組5隻，給予相應治療。納米粒採用尾靜脈注射給藥，多烯紫杉醇劑量為10mg/kg。聯合超聲輻照組於給藥後，頻率840kHz、聲強0. 75w/cm2的超聲輻照2min，間隔2h重複輻照I次，共3次。A組模型組
B組多烯紫杉醇納米粒組C組多烯紫杉醇靶向納米粒組 D組多烯紫杉醇納米粒+超聲輻照組 E組多烯紫杉醇靶向納米粒+超聲輻照組
以上治療每周治療I次，連續4次。治療後第28天，處死裸鼠，剝離腫瘤稱質量，計算抑瘤率，多烯紫杉醇靶向納米粒聯合超聲輻照治療效果最佳，抑瘤率達74. 2%，明顯高於其它各組(表2)。表2各組腫瘤治療效果比較(i ±s)
權利要求
1.一種具有物理、生物雙重靶向作用的肝癌治療新製劑，為乳化-溶劑揮發法製備的多烯紫杉醇靶向納米粒，採用單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸、多烯紫杉醇和半乳糖化膽固醇溶於二氯甲烷形成有機相；吸取有機相，緩緩注入到聚乙烯醇水溶液中，超聲乳化，獲得的乳化液倒入另一聚乙烯醇水溶液中，攪拌去除二氯甲烷，經聚碳酸酯膜過濾，真空冷凍乾燥，6ciC0輻照滅菌後獲得多烯紫杉醇靶向納米粒。
2.根據權利要求I所述的一種具有物理、生物雙重靶向作用的肝癌治療新製劑，其特徵在於所製得的多烯紫杉醇靶向納米粒的平均粒徑為209. 3nm，多元分散係數為O. 40 ;多烯紫杉醇靶向納米粒的載藥率為3. 79%。
3.權利要求I所述的一種具有物理、生物雙重靶向作用的肝癌治療新製劑的製備方法，步驟為精密稱取IOOmg單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸輕基乙酸、5mg多烯紫杉醇、15mg半乳糖化膽固醇Gal-C4-Chol，溶於I ml 二氯甲烷，渦旋震蕩，使其充分溶解，為有機相；用注射器吸取有機相，緩緩注入到3ml 5 %聚乙烯醇水溶液中，超聲乳化，50 W，工作30 sec,間歇5 sec，乳化5次，乳化液倒入到8ml I %聚乙烯醇溶液，磁力攪拌去除二氯甲烷，聚碳酸酯膜過濾，真空冷凍乾燥，6°Co輻照滅菌後4°C保存。
4.權利要求I所述的一種具有物理、生物雙重靶向作用的肝癌治療新製劑在製備烯紫杉醇靶向納米粒聯合超聲輻照治療腫瘤的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開一種具有物理、生物雙重靶向作用的肝癌治療新製劑，為乳化-溶劑揮發法製備的多烯紫杉醇靶向納米粒，採用單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸、多烯紫杉醇和半乳糖化膽固醇溶於二氯甲烷形成有機相；吸取有機相，緩緩注入到聚乙烯醇水溶液中，超聲乳化，獲得的乳化液倒入另一聚乙烯醇水溶液中，攪拌去除二氯甲烷，經聚碳酸酯膜過濾，真空冷凍乾燥，60Co輻照滅菌後保存備用。所製得的多烯紫杉醇靶向納米粒的平均粒徑為209.3nm，多元分散係數為0.40；多烯紫杉醇靶向納米粒的載藥率為3.79%。本發明的載多烯紫杉醇高分子納米粒，粒徑約200nm；體內抗腫瘤實驗得出，多烯紫杉醇靶向納米粒聯合超聲輻照進行治療效果最佳，抑瘤率達74.2%。
文檔編號A61K9/14GK102920660SQ201210399268
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月18日 優先權日2012年10月18日
發明者陳志奎, 林禮務, 薛恩生 申請人:福建醫科大學附屬協和醫院