編碼ToIC和確定的胺基酸序列的核苷酸序列的製作方法

2023-09-17 09:40:55

專利名稱：編碼ToIC和確定的胺基酸序列的核苷酸序列的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種編碼TolC的核苷酸序列、一種包含這種核苷酸序列的質粒，一種由這種核苷酸序列編碼的蛋白或肽，一種包含這種核苷酸序列的細菌以及這種細菌的多種應用。
背景技術：
和現有技術在病毒力減毒中，細胞內繁殖的細菌可以作為活疫苗誘導持久的免疫。迄今已具體將傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhi)TY1a(Levine等人，Lancet 11049-1052，1987)、分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)BCG(Fine和Rodrigues，Lancet 3351016-1020，1990)和霍亂弧菌(Vibrio cholerae)(Levine and Kaper，Vaccine 11207-212，1993)用作活疫苗。
例如已將單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)、鼠傷寒沙門氏菌(SalmonellaTyphimurium)和寒沙門氏菌(Salmonella Typhi)以及BCG類的變體用作良好的易消化抗斑疹傷寒和結核病的活疫苗。這些細菌，包括其弱化的突變體是一般性免疫刺激，可以引起良好的細胞免疫應答並且本身可用作疫苗載體。
這些細菌作為疫苗載體的優點是，它們首先誘導所謂的Thl免疫應答(Hess and Kaufmann，FEMS Immunol.Med.Microbiol.23165-173，1999)。這些免疫應答的特徵是細胞毒性淋巴細胞(CTL)以及特定的IFN-γ分泌性CD4+T-細胞(即T-輔助細胞，Th)的存在，出自(Abbas等人，Nature 383787-793，1996)。
例如單核細胞增生性李斯特菌(L.monocytogenes)特定程度地刺激THl細胞的活化和細胞毒性T-淋巴細胞(CTL)的增殖。這些細菌提供分泌的抗原，後者直接進入到提供抗原的細胞的胞質中(APC；巨噬細胞和樹狀細胞)，這些細胞本身抑制共同刺激的分子並導致有效刺激T細胞。李斯特菌部分降低噬菌體相容性，因此由這些載體細菌產生的抗原一方面可以在MHC類II分子中呈遞並由此誘導T-輔助細胞。另一方面李斯特菌從噬菌體內釋放出後在APCs的胞質溶膠中複製；因而由這些細菌產生和分泌的抗原優選經MHC類I途徑呈遞，因此將誘導抗這些抗原的CTL應答。此外可以表明，通過李斯特菌與巨噬細胞、自然殺傷細胞(NK)和嗜中性粒細胞之間的相互作用誘導這些細胞因子的表達(TNF-α，IFN-γ，I1-2，IL-12；Unanue，Curr.Opin.Immunol.，935-43，1997；Mata and Paterson，J Immunol.1631449-14456，1999)，由此表明抗腫瘤效果。
因此，重組細菌能夠保護抗異源腫瘤(Medina等人，Eur.J.Immunol.29693-699，1999；Pan等人，Cancer Res.595264-5269，1999；Woodlock等人.，J Immunother.22251-259，1999；Paglia等人，Blood 923172-3176，1998；Paglia等人，Eur.J.Immunol.271570-1575，1997；Pan等人，Nat.Med.1471-477，1995；Pan等人，Cancer Res.554776-4779，1995)。
因此通過提供轉導表達腫瘤抗原的單核細胞增生性李斯特菌(L.monocytogenes)，可以抗原特異性地抑制實驗性腫瘤的生長(Pan等人，Nat.Med.1471-477，1995；Cancer Res.595264-5269，1999；Voest等人，Natl.Cancer Inst.87581-586，1995；Beatty andPater son，J.Immunol.1655502-5508，2000)。
已引入編碼腫瘤抗原的核苷酸序列的病毒減毒的腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)在口服後可以作為抑制腫瘤抗原的細菌載體導致針對不同的實驗腫瘤的特異性保護作用(Medina等人，Eur.J.Immunol.30768-777，2000；Zoller und Christ J.Immunol.1663440-34450，2001；Xiang等人，PNAS 975492-5497，2000)。
重組沙門氏菌也有效地作為抗病毒感染(HPV；Benyacoub等人，Infect.Immun.673674-3679，1999)的預防疫苗並用於治療固定腫瘤病毒(HPV)的小鼠腫瘤(Revaz等人，Virology 279354-360，2001)。
為用作疫苗載體，提出以下方法通過在這些細菌的細胞膜上往細菌內引入核酸序列來抑制表達產物或者通過這些細菌來分泌表達產物。這些方法的基礎是大腸桿菌(Escherichia coli)溶血素系統HlyAs，它產生來自革蘭氏陰性菌的I型分泌系統的原型。藉助HlyAs產生分泌載體，從而可以有效地將腸道沙門氏菌(Salmonellaenterica)、小腸結腸炎耶氏菌(Yersinia enterocolitica)和霍亂弧菌(Vibrio cholerae)內的蛋白抗原帶出。這樣的分泌載體包含在HlyA-信號肽、溶血素分泌器、hlyB和hlyD以及hly特異性啟動子的核苷酸序列上偶聯的任何蛋白抗原的cDNA。例如藉助這些分泌載體可以抑制這些細菌表面的蛋白。這種基因修飾的細菌作為疫苗比通過引入核酸而受抑制的蛋白保持其細胞系的細菌更好地誘導免疫保護作用的提高(Donner等人，EP 1015023 A；Gentschev等人，Gene 179133-140，1996；Vaccine 192621-2618，2001；Hess等人PNAS 931458-1463，1996)。但是，此系統的缺點是通過使用Hly-特異性啟動子由細菌抑制的蛋白的數量小。
例如，細菌中的其它轉運系統是i)新月形柄桿菌(Caulobactercrescentus)的S-層蛋白(Rsa A)的轉運信號，其—對於分泌和膜結合性表達—使用C-末端RsaA-轉運信號(Umelo-Njaka等人，Vaccine 191406-1415，2001)和ii)單核細胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的Internalin A的轉運信號。分泌需要N-末端轉運信號，而膜結合性表達需要N-末端轉運信號和包含負責細胞壁固定的LPXTG-基元的C-末端部分(Dhar等人，Biochemistry 393725-3733，2000)。
其它相關的是得自大腸桿菌(E.coli)的完整膜蛋白TolC是已知的。這是一種大腸桿菌(E.coli)外膜的多功能、成孔蛋白，例如其功能除了近似大腸桿菌素E1的吸收(Morona等人，J.Bacteriol.153693-699，1983)和大腸桿菌素V的分泌(Fath等人，J.Bacteriol.1737549-7556，1991)，還用作U3噬菌體的受體(Austin等人，J.Bacteriol.1725312-5325，1990)。這些蛋白不僅見於大腸桿菌(E.coli)，還見於多數革蘭氏陰性菌(Wiener，Structure Fold.Des.，8171-5，2000)。
TolC蛋白的結晶結構表明，它作為均三聚體形成長度為大約120埃的隧道，均二聚體的最大部分，隧道區位於周質，且在細菌表面上僅有二個小環(胺基酸52-61和257-279)(Koronakis等人，Nature405914-919，2000)。Niki等人，Nucleo tide sequence of the tolCgene of Escherichia coli，Nucleic Acids Res.18(18)，5547(1990)公開了，tolC基因具有該核苷酸序列。TolC是來自至少四個不同細菌輸出系統的部分，藉此它形成膜隧道，通過膜隧道可以輸出細菌蛋白。例如在該HlyA轉運系統中，HlyD和TolC周質末端之間的連接允許將來自HlyD的溶血素在TolC膜隧道中輸出(Gentschev等人，Trends in Microbiology 1039-45，2002)。

發明內容
本發明技術問題本發明基於描述轉運系統的技術目的，藉助於該轉運系統可以提供在外部細胞膜上具有較高效力的表達產物。
本發明的基本概念和優選的實施方式為達到這個技術目的，本發明教導一種編碼TolC和確定的胺基酸序列的核苷酸序列，其中該確定的胺基酸序列插在允許的TolC的膜外區域。
利用本發明產生一種新的革蘭氏陰性菌的轉運系統，與現有技術的轉運系統相比，藉助它可以將更大量的通過細菌內的基因抑制的蛋白轉運到細菌外部細胞膜上。令人驚奇的是，與現有技術的轉運系統相比，大腸桿菌(Escherichia coli)的TolC-蛋白的轉運系統允許強大得多的(任意的)肽或蛋白的膜永久性表達，並且這是對於大量的革蘭氏陰性細菌。因而僅通過TolC完成該確定的胺基酸序列或基因產物的膜永久性表達。
確定的胺基酸序列可以是任何給定的肽或蛋白、任何藥學活性物質、任何抗原、任何抗體或任何配體。
TolC可以是根據用於清楚指示出處的ACCESSION X54049的(野生型)TolC蛋白，或者其(優選N-末端)部分序列或該蛋白的突變體或部分序列，其中對於該部分序列或突變體，保持轉運功能。N-末端部分序列在此稱為起始於TolC蛋白的N-末端區域胺基酸1-50並終止於環的C-末端的任何部分序列，其處在細菌表面。因此優選TolC的N-末端轉運信號和蛋白的中心部分，它形成TolC的細胞外區域。突變體可以包括插入、缺失或取代，只要它的轉運功能沒有因此明顯降低。
對於特定的應用情況，建議確定的胺基酸序列插在間隔序列的單側或雙側。但是僅當在特定的空間結構中提供確定的胺基酸序列時才是有益的，例如在抗原的情況下，然而這通過確定的胺基酸序列本身則在理想程度上並不產生，由於空間或構象的原因。因此尤其可以通過天然的連接於該確定的胺基酸序列之後的序列構建間隔序列，由此使確定的胺基酸序列如同天然抗原一樣摺疊。然而間隔序列也可以是人造的，只要藉此得到期望的確定胺基酸序列的呈遞和/或摺疊。這利用理論方法並考慮TolC的插入位置的空間狀況很容易計算。
詳細地講，特別優選確定的胺基酸序列具體插在TolC的N-末端區域，特別是胺基酸52-61和/或257-279(各自指TolC蛋白)區域。
此外，本發明的主題是包含本發明的核苷酸序列的質粒和由本發明的核苷酸序列編碼的蛋白或肽。
此外，本發明教導包含本發明的核苷酸序列的細菌，其中TolC導致確定的胺基酸序列轉運到細菌膜上。換句話說，TolC蛋白導致在細菌內發生基因產物的膜永久性表達。因此本發明的主題還是一種革蘭氏陰性菌，它包含至少一個核苷酸序列，該序列編碼至少一個確定的胺基酸序列，並編碼至少一種大腸桿菌(E.coli)TolC-基因產物。此大腸桿菌(E.coli)TolC-基因產物優選野生型。本發明的主題還是突變大腸桿菌(E.coli)TolC基因產物，其中保持了轉運信號活性。優選細菌選自下列「沙門氏菌(Salmonella spp.)、大腸桿菌(Escherichia coli)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、志賀菌(Shigella spp.)和耶爾森菌(Yersinia spp.)」。
本發明的核苷酸序列和細菌可以於各種應用。例如，本發明還教導一種包含本發明的細菌和任選的至少一種生理學上可接受的載體物質的藥物組合物，其中該確定的胺基酸序列按照在生物體內結合的給定的物質進行選擇。通過這種藥物組合物，可以結合併因此抑制幹擾正常細胞代謝的物質，例如外源毒物或突變引起的內源物質，如(Octagons)。此外，通過結合某種細胞靶物質，可以經過除去正常的複合體參與者或者由於病理狀態而正調節的複合體參與者來調節代謝過程。因此，例如通過抑制確定的聯繫來負調節與其相關的穿梭。此方法又可以用於正調節其它相關方法。據此而言，該確定的胺基酸序列只需要根據欲被高度特異性抑制的靶分子來選擇。因此這種藥物組合物最終用於治療目的。
對於接種目的來說適合的藥物組合物包含本發明的細菌和任選的至少一種生理學上可接受的載體物質，其中該確定的胺基酸序列是一種免疫序列。免疫序列在生物體內刺激抗天然抗原的抗體的產生，它作為部分序列包含免疫序列或由免疫序列組成。
為診斷目的，本發明教導一種包含權利要求7-9之一的細菌的診斷試劑盒，其中該確定的胺基酸序列特異性地結合待測定的標記物。如果，例如，從生物體取組織或液體試樣，並在必要時在進行分離不期望的試樣組分的預處理之後，將這些試樣與細菌一起培養，以可以檢測在確定的胺基酸序列的結合事件，並且就結合事件的情況，檢測到與確定的胺基酸序列特異性結合的物質包含在試樣中。因此結合事件的檢測可以是各種本領域普通技術人員公知的方法。
最後，本發明教導一種包含本發明細菌的製備性結合物質，其中該確定的胺基酸序列與從溶液中分離的靶物質特異性結合。藉助這種結合物，不希望的物質可以一方面具體地從溶液中除去，這是通過使溶液與細菌一起培養，並在分離之後除去細菌進行的。另一方面可以以相應的方式完成分離或者富集靶物質，即培養之後從細菌中洗脫出靶物質。為此，本發明也可用於分離和/或富集抗原、抗體、肽、蛋白或配體。


圖1來源pBR322；Tc抗性基因；克隆來自大腸桿菌的tolC基因；克隆來自單核細胞增生性李斯特菌(L.monocytogenes)的p60表位序列。
具體實施例方式
實施例實施例1TolC載體的構建來自大腸桿菌(E.coli)的tolC基因，包括它們的野生型啟動子，通過PCR(1分94℃，1分66℃，1分30s 72℃)用來自質粒pAX629(C.Wandersman，Institute Pasteur，Paris)寡核苷酸5′TolC(5′-TAACGCCCTATGTCGACTAACGCCAACCTT-3)和3′TolC(5-AGAG-GATGTCGACTCGAAATTGAAGCGAGA-3』)擴增。由此在兩端引入附加的SalI-界面。用限制內切核酸酶SalI消化純化的PCR產物(QIA快速PCR純化試劑盒-Qiagen，Hilden，Germany)並克隆到用SalI-事先分離的載體pBR322中。如此構建的載體稱為pBR322tolC。然後在更多相關的試驗中研究克隆的tolC基因的功能。
實施例2在TolC蛋白序列中插入抗原序列在編碼細胞外環之一的tolC-序列中，確定一種KpnI-界面。這用於克隆單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)的p60-蛋白的抗原性肽序列(iap基因)，並允許在成熟TolC-蛋白的胺基酸271之後插入外來抗原。
編碼p60-蛋白的B-細胞表位(胺基酸291-301)和CD4-限制T-細胞表位(胺基酸301-312)的iap-序列作為KpnI片斷被克隆到事先除去KpnI的載體pBR322tolC中(圖1)。將如此形成的質粒稱為pBR322tolC::LisTB。
圖1表示在載體pBR322上向野生型、質粒編碼的大腸桿菌(E.coli)tolC基因中插入p60-特異性表位序列的克隆策略。它們是bla-氨苄青黴素抗性基因；Tc-四環素；T-單核細胞增生性李斯特菌(L.monocytogenes)p60-T-細胞表位(AS 301-312)；B-單核細胞增生性李斯特菌(L.monocytogenes)p60 B細胞表位(AS 291-301)；PtolC-野生型大腸桿菌(E.coli)tolC-啟動子。
實施例3在革蘭氏陰性菌(大腸桿菌(Escherichia coli))膜上表達抗原用Western印跡法檢測TolC-蛋白內來自單核細胞增生性李斯特菌(L.monocytogenes)的p60-蛋白的表位的表達。為此，來自大腸桿菌(E.coli)CC118tolC、大腸桿菌(E.coli)CC118tolC/pBR322tolC和大腸桿菌(E.coli)CC118tolC/pBR322tolC::LisTB的細胞裂解物蛋白在隨後的對數期分離。該應用的完全細胞蛋白相當於大約100百萬個細菌。在15％SDS-聚丙烯醯胺凝膠中分離蛋白，並檢測嵌合體TolC-蛋白的表達或插入表位的表達，一方面，用抗TolC-蛋白的多克隆血清和另一方面用單克隆抗體K317(Rowan等人，J.Clin.Microbiol.382643-2648，2000)，後者特異性地直接對抗來自單核細胞增生性李斯特菌(L.monocytogenes)的B-細胞表位(圖2B)。
正如可以預期的那樣，在大腸桿菌(E.coli)CC118tolC的細胞裂解物中不能檢測到TolC-蛋白，這可歸因於此菌株中染色體tolC基因的突變(Schlor等人，Mol.Cen.Genet.256306-319，1997)。pBR322tolC的互補導致這些菌株中發生52kDa大TolC-蛋白表達。TolC-蛋白中單核細胞增生性李斯特菌(L.monocytogenes)表位的插入不影響TolC的表達，並導致大約3kDa的嵌合體蛋白大小的輕微修飾。
大腸桿菌(E.coli)CC118tolC/pBR322tolC::LisTB上的p60-特異性表位的表達可以用單克隆p60-抗體K317證明。
實施例4檢測單核細胞增生性李斯特菌(L.monocytogenes)p60-表位在腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)SM6T(tolC)中的暴露定位由於TolC細胞外環中的二個李斯特菌p60表位插在成熟蛋白的胺基酸271之後，因此它應以暴露的方式存在於腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)SM6T的表面(Stone等人，Mol.Microbiol.17701-712，1995)。腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)SM6 T中該p60-特異性表位的確定的細胞外定位通過間接免疫螢光法檢查。將各25μl的腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)SM6T/pBR322tolC和腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)SM6T/pBR322tolC::LisTB的過夜培養物滴到目標載體上並風乾。單克隆p60-抗體K317(1∶200)將細胞著色，然後檢測與FITC標記的第二抗小鼠血清結合的結合抗體(Dianova，Germany，Arbeitstiter1∶40)。
螢光顯微鏡分析證實單核細胞增生性李斯特菌(L.monocytogenes)特異性表位在菌株腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)SM6T/pBR322tolC::LisTB的細胞外定位。
實施例5用革蘭氏陰性菌進行免疫試驗並在用野生型單核細胞增生性李斯特菌(L.monocytogenes)感染之後分析保護性免疫應答為了確定在小鼠的李斯特菌病模型中，單核細胞增生性李斯特菌(L.monocytogenes)是否導致來自p60-蛋白的T-細胞表位的顯露表達而導致的保護作用，通過口服劑量為1×107的腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)SM6T/pBR322tolC::LisTB使8隻六周齡的雌性Balb/c-小鼠(Charles River，Sulzfeld，Germany)免疫。為進行對照，通過口服腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)SM6T使5隻雌性小鼠免疫。3周後用相同的細菌劑量使動物第二次免疫。
在第一次免疫後5周用免疫印跡檢查免疫結果，在其上應用來自單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)的上清液蛋白。由此可以檢測在用腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)SM6T/pBR322tolC::LisTB免疫的小鼠血清中的抗p60特異性抗體。
在第二次免疫後3周，用5×104個單核細胞增生性李斯特菌(L.monocytogenes)EGD，5摺疊的LD50靜脈內感染動物。在此期間在用單核細胞增生性李斯特菌(L.monocytogenes)EGD靜脈內感染後，用腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)SM6T/pBR322tolC::LisTB免疫的Balb/c-小鼠的存活率計為88％，比對照組存活率僅低20％。
這樣在減毒腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)載體菌株SM6T中的TolC的細胞外環內的p60-特異性表位的表達導致誘導單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)-特異性免疫應答，它能用於保護Balb/c小鼠對抗通常致命的感染。因此可以用Westen印跡法檢測來自p60蛋白的抗B-細胞表位的抗體的誘導作用。顯然，抗體參與的免疫反應已導致了這裡觀察到的使小鼠免於單核細胞增生性李斯特菌(L.monocytogenes)的其它致命感染的保護作用。
權利要求
1.編碼TolC和確定的胺基酸序列的核苷酸序列，其中該確定的胺基酸序列插在允許的TolC的膜外區域中。
2.根據權利要求1的核苷酸序列，其中TolC是按照ACCESSIONX54049的蛋白或者優選其N-末端部分序列或者該蛋白或部分序列的突變體，且其中對於該N-末端部分序列或突變體保持轉運功能。
3.根據權利要求1或2的核苷酸序列，其中該確定的胺基酸序列插在間隔序列的單側或雙側。
4.根據權利要求1至3之一的核苷酸序列，其中該確定的胺基酸序列插在TolC的N-末端區域，特別在胺基酸52至61和/或257至279(各自與TolC蛋白有關)區域。
5.質粒，其含有根據權利要求1-4之一的核苷酸序列。
6.蛋白或肽，其根據權利要求1-4之一的核苷酸序列編碼。
7.包含根據權利要求1-4之一的核苷酸序列的細菌，其中TolC引起細菌膜上確定的胺基酸序列的轉運。
8.根據權利要求7的細菌，其中該確定的胺基酸序列表示肽、蛋白、活性物質、抗原、抗體或配體。
9.根據權利要求7或8之一的細菌，其選自「沙門氏菌(Salmonella spp.)、大腸桿菌(Escherichia coli)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、志賀菌(Shigella spp.)和耶爾森菌(Yersinia spp.)」。
10.一種藥物組合物，其包含根據權利要求7-9之一的細菌和任選的至少一種生理學上可接受的載體物質，其中所述的確定的胺基酸序列是按照在生物體內欲結合的給定物質進行選擇的。
11.一種藥物組合物，其包含根據權利要求7-9之一的細菌和任選的至少一種生理學上可接受的載體物質，其中該確定的胺基酸序列是免疫序列。
12.包含根據權利要求7-9之一的細菌的診斷試劑盒，其中該確定的胺基酸序列與待測定的標記物特異性結合。
13.包含根據權利要求7-9之一的細菌的製備性結合物質，其中該確定的胺基酸序列與從溶液中分離的靶物質特異性結合。
全文摘要
本發明涉及編碼To1C和確定的胺基酸序列的核苷酸序列，該確定的胺基酸序列插在允許的To1C的膜外區域，本發明還涉及該核苷酸序列的多種應用，特別是含有這種核苷酸序列的細菌。
文檔編號C12N15/09GK1646560SQ03808686
公開日2005年7月27日 申請日期2003年2月13日 優先權日2002年2月20日
發明者W·格貝爾, I·根特謝夫, S·斯普倫 申請人:烏爾夫·R·拉普