使用移植細胞產生的激素改善魚卵和/或精子的發育和成熟的手段和方法

2023-09-16 17:32:50 10

專利名稱：使用移植細胞產生的激素改善魚卵和/或精子的發育和成熟的手段和方法
使用移植細胞產生的激素改善魚卵和/或精子的 發育和成熟的手段和方法
技術領域：
本發明涉及魚養殖領域。本發明具體涉及在魚中使用激素來改善卵 和/或精子發育和成熟的領域。
許多魚品種響應環境因子而成熟。這些因子(如光周期、溫度、季 節、壓力和能量儲備)被動物感知並調節下丘腦中樞對垂體的抑制作 用。通過這種方式，垂體產生的促性腺激素通常被抑制，並且僅在特定 環境條件下被活化。當被活化時，垂體釋放刺激雄性和雌性性腺生長和 發育的促性腺激素。
對於水產業來說，重要的是一般通過規律注射相同的激素來人工刺 激成熟，所述激素通常由垂體粗提物組成。規律注射在一定程度上壓倒 了環境引發的雄性和雌性性腺的發育。然而，使用激素人工改善卵和/或 精子發育和/或成熟的現行實踐不完全令人滿意。例如，在鰻魚中，它們 在開始產卵洄遊時依然是未成熟的，因此必須在卵母細胞成熟至足以排
卵前的3 5個月期間，每周處理雌魚。這是一個耗時的過程，並且對魚 造成應激。
本發明提供了一種通過施用激素改善魚中卵和/或精子發育和/或成 熟的方法，其包括向所述魚提供產生所述激素的細胞。移植到魚的所述 細胞釋放一種或多種激素，從而至少減少了向其規律注射激素本身的需 要。只要將分泌的激素以足夠的量釋放到循環系統併到達所有組織特別 是性器官，可以多種方式移植細胞。可將細胞移植到身體的任何部位。 一般使用由激素生成細胞組成的植入物繞開垂體腺，以產生激素，如黃 體生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)或絨毛膜促性腺激素(CG)。優選將具 有激素生成細胞的植入物插入到進入血流的部位。優選的插入方法為腹 腔內注射和皮下注射。進入血流的部位非常適合於產生如LH、 FSH和 CG等二級激素的細胞。細胞的移植常常用於哺乳動物而且已經獲得了 許多關於將細胞移植並維持至少一些時間的經驗。考慮到在產卵或收穫 成熟的卵或精子後一般將魚殺死，因此不是非常需要控制移植細胞。重 要的是，細胞仍然以足夠的數量存在以使性腺完全發育和成熟。因此細 胞的數目不能低於發育和成熟的需要，並且細胞不要(或不能變得)特別 多而妨礙性腺的發育和成熟或動物的總體健康。細胞的激素產生水平不 是非常關鍵。注射細胞的數目將取決於成熟所需的總量。通過生物測定 法定量激素產量。注射細胞的激素的釋放需要足夠高以刺激卵和/或精子 的發育和/或成熟。激素表達的上限不是關鍵，因為生育激素的過表達在 自體內沒有毒性並且不負面影響卵和/或精子的成熟和/或發育的刺激。 在哺乳動物世界，已經開發了幾類移植輔助措施以使細胞延長停留或使 細胞分化。這些輔助措施當然也用於本發明。這些輔助措施包括但不限 於，用於細胞移植或粘附的膠原蛋白或合成基質。
在許多情況下由於細胞不必存活非常長的時間，所以可將來自許多 不同品種的魚細胞移植到受體魚中。如果移植細胞和受體的進化差異較 大，受體魚很可能對移植細胞(移植物)產生免疫反應。然而，由於細胞 常常只需要存在有限時間，所以一般可耐受這種免疫反應。為了提高健 康狀況(robustness)和該過程的可預測性，優選移植物來自與受體魚種相 同的屬或科。優選兩者來自相同的種。由於魚一般為遠交群，所以相同 種的魚之間存在免疫差異。如在我們用鰻魚的實驗的實施例中所示的， 這一般不是問題。然而，可進一步使移植物與受體的常見免疫學標記匹 配。 一般的標記為主要和次要組織相容性抗原。通過向受體魚提供如環 孢菌素等免疫抑制劑可進一步有助於移植細胞的移植。 本發明的激素生成細胞的移植可用於改善卵和/或精子的成熟、卵和 /或精子的育性、卵的授精、得到的胚胎的質量、受精卵和未受精卵的存 活和胚胎的存活。這些改善均導致改善魚中卵和/或精子的發育和成熟。 因此術語魚中卵和/或精子的發育和成熟不限於產卵的天然過程，也涉及 用於卵授精的人工方法。因此，也涉及從用本發明的方法處理的魚收穫 未受精卵和/或精子。未受精卵也用於除產生子代之外的其它目的。其非 限制性實例為生產用於人類食用的卵(如魚子醬)。
可以多種方式刺激魚中卵和/或精子的發育和成熟。在本發明的一個 實施方式中，在卵、精子或從受精卵得到的胚胎的絕對數目或質量增加 時，可以說刺激了魚中卵和/或精子的發育和成熟。
生殖是高度調節的生物學過程。生殖的不同方面由不同的激素調 節。然而，當由移植到魚中的細胞表達時，幾種激素可產生或多或少的 相似效果。這些激素包括生長激素、促腎上腺皮質素釋放素(促腎上腺
皮質激素)、促甲狀腺激素、FSH、 LH、催乳素、CG (絨毛膜促性腺激 素)、MG (絕經促性腺激素)、促生長素或其組合。上述激素也以不同的 名稱為人所知。由於根本的胺基酸序列相同，因此其同義詞所指的激素 也在本發明的範圍內。例如，生長激素有時也稱為促生長素、促生長激 素、垂體生長激素、促生長激素或STH。促腎上腺皮質素釋放素也稱為 釋放促皮質素激素。促腎上腺皮質激素(Adreno Corticotrope hormone) 也稱為促腎上腺皮質素(Corticotropin )、促皮質激素 (adrenocorticotropin)、促皮質素(adrenotropin)、 促腎上腺皮質素 (corticotropin ) 、 ACTH或促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone)。促甲狀腺激素也稱為TSH、促甲狀腺素或促甲狀腺激素。 FSH也稱為促卵泡激素、促濾泡激素或促配子活動激素。LH也稱為黃體 生成素、促黃體素或促間質細胞激素(ICSH)。催乳素也稱為PRL、催乳 、激素(lactogenic hormone)、催乳激素(mammotropic hormone)、催乳 '激素(galactopoietic hormone)或促乳素(lactotropin) 。 CG (絨毛膜促
性腺素)也稱為絨膜促性腺激素、絨促性素(choriogonadotropin)或絨毛 膜促性腺激素以及絕經促性腺素(MG)也稱為尿促性腺激素、尿促性素 (menotropin)或絕經促性腺激素。在本發明優選的實施方式中，所述激素為直接參與卵的發育和成熟 的激素。這種生育激素一般由垂體或性器官產生。在優選的實施方式 中，生育激素包括促黃體生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)或絨毛膜促性 腺素(CG)或這種激素的功能部分、衍生物和/或類似物。這些激素是魚中 卵和/或精子發育和成熟的非常強效的刺激物。這些激素在自然界非常保 守並且很少有種間屏障。例如，尿中人生育激素的存在可通過將其與青 蛙卵孵育進行檢測。類似地，人絨毛膜促性腺素(hCG)也對鰻魚和鯉魚 起作用，而且鮭魚的垂體提取物對許多不同的魚種(如鰻魚、鯛和鱒 魚)起作用。
受體可能對異源激素產生免疫反應。雖然該免疫反應一般出現太晚 以至於不會影響魚中卵和/或精子發育和成熟，但是優選所述的激素為魚 激素或其功能部分、衍生物和/或類似物。這限制了提供的和內源性激素 之間的差異，從而至少部分限制了受體中針對提供的激素產生免疫反 應。優選，所述激素來自屬於與受體相同屬的種。這樣進一步降低了免 疫反應發生的機會。在特別優選的實施方式中，提供的激素與受體中的 其等同物免疫學上相同。這完全防止了發生針對提供的激素的任何有害 的免疫反應。
細胞可不需要處理就可表達目的激素，或可進行處理以表達目的激 素。當所述細胞不再表達所述激素或不表達足夠的激素時，可向它們提 供用於表達所述激素的遺傳信息。
在優選的實施方式中，向細胞提供表達激素的遺傳信息。這可通過 向細胞提供包含所述激素的編碼序列的表達盒來實現。然而，也可通過 在各激素的編碼序列附近插入活性調節序列而活化內源性基因。例如可 通過同源重組達到此目的。
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LH和FSH蛋白質屬於相關的蛋白質家族。兩者具有共同的特徵，即 其作為由共同的a-亞單位和不同的P-亞單位組成的異二聚體起作用。在 激素由一種以上蛋白質鏈組成的情況下，細胞可能不表達產生激素需要 的所有鏈。在這些情況下，僅僅需要缺乏的鏈的表達盒。因此，如果在 細胞中充分表達一個或多個但不是所有的激素亞單位，只需要在細胞中 表達剩餘的亞單位。如果所有亞單位都沒有表達，就需要處理細胞使得 所有的亞單位以足夠高的水平表達。在優選的實施方式中，向細胞提供 激素亞單位的表達盒。在優選的實施方式中，向細胞提供組成LH和FSH 的三個蛋白質鏈(即各激素的共同的oi-亞單位和獨有的P-亞單位)的表達 盒，或在單獨的細胞系中表達(3LH + a和pFSH + a的組合。因此在一個 優選的實施方式中，對所述細胞進行遺傳修飾以表達所述激素。優選， 向細胞提供一個或多個編碼所述激素的基因。
所述細胞可以為原代細胞或體外持續培養一段時間的細胞系。在優 選的實施方式中，所述細胞來自克隆細胞群。以這種方式，在使用前可 對細胞進行詳細的質量控制。這也慮及建立具有相同性質的細胞庫。此 外，可對克隆群進行進一步的操作。例如，如果某人想降低受體中的免 疫反應，可敲除主要和/或次要組織相容性抗原的表達。因此在一個優選 的實施方式中，已經對受體中降低的免疫原性的細胞進行選擇。在本發 明的方法或用途中使用的細胞可以為原代細胞或培養細胞。優選，所述 細胞為培養細胞，更優選為永生化培養細胞。培養細胞一般為細胞系。 可將細胞系增殖至少5代而所述細胞的表型基本沒有變化。可將永生化 細胞系傳代至少50代而沒有這樣的表型變化。永生化細胞可以多種方式 自原代細胞獲得。優選地，所述永生化細胞來自原代細胞的培養物，其 經歷了一般原代細胞在培養時的轉換期。在另一優選的實施方式中，通 過向原代細胞引入一個或多個基因使所述細胞永生化。
本發明的方法可用於所有類型的魚。優選的魚為鰻魚、黑艫、鯛、 大比目魚、鮭魚、鱒魚、鱈魚、鯉魚、鯰魚和鱘魚。然而，本發明特別
適合於海河洄遊魚(diadromous fish)，並且優選單次繁殖魚(semelparous fish)。這些魚在產卵前需要較長時間，並且一般不是所有均對外部信號 作相似反應。使用本發明的方法可至少部分地不依賴環境刺激來刺激魚 的發育和成熟。這對養魚的起點提供了大量的可預測性。在海河洄遊魚 中，可進一步使卵的發育和成熟同步以便在生產過程中可更好地安排工 作。
本發明進一步提供了產生生育激素的分離和/或重組魚細胞。在優選 的實施方式中，將所述細胞進行遺傳修飾以表達所述激素。本發明進一 步提供了具有表達生育激素的能力的魚細胞。優選地，魚細胞提供有編 碼所述生育激素的重組和/或分離的核酸序列。如果激素由一個或多個亞 單位組成，所述魚細胞優選具有編碼所述激素的至少一個亞單位的分離 和/或重組核酸序列。優選地，所述魚細胞具有編碼所述激素的所有亞單 位的核酸序列。優選所述細胞為食用魚的細胞。在優選的實施方式中， 所述細胞來自鰻魚、黑鱸、鯛、大比目魚、鮭魚、鱒魚、鱈魚、鯉魚、 鯰魚或鱘魚。優選所述的細胞為如上所述的細胞，即原代細胞或來自體 外持續培養一段時間的細胞系的細胞。在優選的實施方式中，所述細胞 來自細胞的克隆群。優選所述的細胞為培養細胞，更優選永生化的培養 細胞。
在優選的實施方式中，使用了可以培養的細胞的植入物。而且這些 細胞優選為克隆的，且優選其特徵是可選擇的。但是也可使用原代培養 物、組織、受精卵或胚胎材料。己經公開了用於製備轉基因魚卵的方法 (Morita等，2004， Transgenic Research 13， 551)。然而，所述轉基因魚卵 不能進一步繁殖。而且如由Morita等描述的導入基因的表達不穩定。在 卵中選擇導入的基因是困難的，而且由於需要對各個卵進行微注射，所 以相對於可培養細胞，使用魚卵作為生物反應器是相當耗時的，而在細 胞培養物中，我們可利用標準的轉染技術。可培養細胞的優點在於易於 儲存，並且可在任何時間獲得。此外，與基因修飾卵相比，使用可培養
細胞工作不存在倫理問題。與卵和/或胚胎的植入相比，培養細胞的懸浮 液的注射相當簡單。
本發明進一步提供了包含本發明的細胞的魚。優選地，所述魚為食 用魚。優選地，所述魚為食用幼魚或成魚。優選繁殖的時間較短。原代 胚胎材料的缺點在於不能獲得或獲得不能充足的量。在優選的實施方式 中，所述魚為鰻魚、黑鱸、鯛、大比目魚、鮭魚、鱒魚、鱈魚、鯉魚、 鯰魚和鱘魚。在優選的實施方式中，所述的魚包括非遺傳修飾的精細 胞、卵母細胞和/或其祖先。
實施例
LHP、 FSHP和a斑馬魚基因的克隆
已經發表了斑馬魚的基因LHJ3(AY424304) 、 FSHf3(AY424303)和 a(AY424306)，也報導了以下鰻魚基因日本鰻鱺(^"^///"力/ om'ca)中 的LH卩(AB175835);歐洲鰻鱺(^"gw/〃a爿"gw/〃a)中的FSH卩(AY169722) 和日本鰻鱺中的a(AB175834)。為了克隆LHp、 FSH(3和a，在各cDNA序 列的基礎上設計了引物
用於LH(3引物設計的序列為:
ctggscacgc3C33cagcctgctgsgcssccgc33cgcct
gtcaagatgttattggctggaaatggtgtcttctttctcttctctttgtttttcctgctg
gcggctgctc3g3gcttggtttttcc3cgctgtgagctsgggtatcggtg
gctgtccaaaatgcctggtgtttcagacc3ccatctgcagcggccactgc
gtaatcaagggatcccgtttacaagagcccgttttccsccgtccsccsgscagtgtgcatg
tccgctstg3ctgcccgsctgttccgccggcgtggacccg
scccggtggcgctgsgctgcgactgcagtctgtgcaccstaaacacttcc
g3ctgcaccatccagagcctgcsgcccgacttctgcatgtggatttcccc
gc3tsctsg3cctcgggcaactc3cgtca3cct3cgcsc3tagtcgagctcagcattatt
agccctcctg tatgtttttt ccattaatat atatactttc aagscactag tattcagctt aaagtgacat ttaaagacta aactaggtta attaggggga aaagtagagt ssgtcattgt atastsgtgg tttgttctgg agacsatcca aaactaatat tgcttaaggg ggctaataaa
attgacctta asatgaattt aaataattta aaaactgcat ttattctagt cgaaataaaa gaaataagac tttctttaga sgaaaaaaca ttstaggaaa tactgcaaas aaattcctga atctgttcaa catcattegg gsaatcaaag gagggctaat aactgtgact tcagctgtac atcaataaag 3ggctggttc ttaaattcaa asaaaaasaa aaasaaaaaa aaaaaaaa
用於FSHP引物設計的序列為:
ggtctccacg333ctcccgcgcgtgtgcttgttctggcgctgctgttgcc
ggtgttsatgagegcagaatc3g3atgc3ggtgcagctgtcgactcacca3catctccst
c3ctgtgg3ggtgggagctgcgtcacwtcgacaccacagcctgtgcagg
sct3tgctggacaatggatcgagtttaccctsgttccatggcacagcaca
ctgtaacttc33g33cttgatgtacaagagctscgagtttssaggctgtcctgcaggggt
tgattcagtcttcgtgtaccccgtggctctg3gctgtg3gtgcaaccsggttaactcaga
tggggagctatc3gcccgc3gsccaccagctgesgestseactagsgcac
tgt3tcatga ccttaacaac atgtacgttg cagaatcaaa ttaagt33gg agtacsatta
ggatatcaat3cctttsgtttttcaitgcst
tggtaatttggttscttg33tt33tctgttgtgttaattc '匕atagttggt sctatggtsact3g3gtactagagtatccastgctatactsgttttsatt3cagtt33tt
3tgct3cagt3ttt3tt3C3gtttttctgttttcaat3tttsgt3Ctsc3gtatgct3gt
gesttcattasc33taagctgtaaatactaactttactat
sgtstgcttgttatttaatgtgagttsct3tsgtscttttcaattgggat
ttgtcsttttgg3tsttgtgggcttttttggctattcats ,asgttttttt tatttttttttt3ttt33ttttC3gtC333tCC3CC3t33tacacttgtgtttcttttgt
cs33cttatcwtttgtgtctgt3g3tttccatattttss
用於a亞單位引物的設計的序列為
3tC3cgctccgeeggasgtccc3tc3tgtt
tacgctgaagcaagcattttcttgttgtt3stg3ttcttc3tgtcgg3C3actgtattcs
tgtctaactatggatgtgaacgaacgtttc
tCC333CCCggggctccggtct3tC3gtgcgtgggctgctgcttttcgagagcttscccc
acaicccctgaggtccaags33sccatgcttac3tcsc3tc sgsaqecsettgctgtgtsgtcccactats
gactgccactgcagcacctgtt3Ct3tC3tscacactctcttcacatttctcaaatgctc atttcctgtt cttaaatcac agtgactcst gaaatatgat ttttatgtag ctttccatat ttcsactgtg gccatttcca attcgtttct aaaatggttg gcataagtat tgtaaactgc att3ttctgtc 3ct3tccctt tsaga^gcgta 3t3tgccstc ctttactatc stt3satcgc ttstttattt tgttgccttt sctgtgacst tcttcasatc tataaatgas ataaaagatt gctgsaggca aaaaaaaaaa aaaaaaasaa aaaasaaaas
在各情況下，灰色部分表示編碼序列，並且在預測的擴增區下劃線。
設計的引物為
上遊-LHp/EcoRI5'-CAA CCG AAT TCA ACG CCT TCA AGA TGT-3' 下遊-LH|3/EcoRV 5'-CCG ATA TCT AGT ATG CGG GGA AAT-3' 上遊-FSH卩3 5'-AGG ATG CGT GTG CTT GTT CT陽3'
下遊-FSH卩2/3 5'-TGT TGT TAA GGT CAT GAT ACA GTG C墨3' 上遊-al 5'-GTC GAG GAC AAA GCC ATC AT-3'
下遊-al 5'-TGC CAA CCA TTT TAG AAA CGA-3'
為了更有利於LH(3寡聚物的克隆步驟，在上遊寡聚物和下遊寡聚物 中分別包括EcoRI和EcoRV限制性酶切位點。
自在液氮中勻漿的斑馬魚頭分離並根據製造商的說明書使用 TRIZOL試劑提取總RNA。通過與DNasel孵育接著用酚/氯仿提取並用乙 醇沉澱除去痕量DNA。使用白金Taq的Superscript II —步RT-PCR體系進 行RT-PCR。用100ng總RNA使用25pmol的上遊和下遊引物進行反應。於 5(TC進行反轉錄30 min。 PCR條件為40個循環的94'C變性20 s，對於 LHg55。C退火30 s，對於FSHg50 。C退火30 s，和72。C延伸1 min，接著最 後72"C延伸10 min。將PCR產物在"/。的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離並 用溴化乙錠染色。當在瓊脂糖凝膠中觀察時，FSH^ PCR產物產生模糊 條帶，為了優化我們使用這個PCR產物作為模板進行PCR，反應用1/20 的PCR產物使用l(HiM的上遊和下遊引物進行。PCR條件為40個循環的
94°。變性20 s，從5(TC至60'C的梯度進行退火30 s以及72 'C延伸1 min， 接著最後72 'C延伸IO min。然後觀察到清晰條帶。為了證實擴增序列的 一致性，將所述PCR產物克隆到pCRII-TOPO載體中，用限制性酶消化以 鑑定正確的方向並測序。序列分析顯示我們克隆到斑馬魚的LHg、 m和 FSHg亞單位。現在這些構建體允許在組成型啟動子下亞克隆所述基因。
在組成型啟動子(CMV)的控制下克隆LH(3、 FSHp和^。 p3XFLAG-CMV-9表達載體用於建立瞬時或穩定的融合蛋白。所述載體在多克隆 區域的上遊編碼三個相鄰的FLAG表位。使用抗FLAG抗體檢測增強。 CMV的啟動子-調節區域驅動flag融合構建體的轉錄。前胰蛋白酶原 (preprotiypsin)前導序列位於FLAG序列前，啟動蛋白質的分泌。氨 基糖苷磷酸轉移酶基因(Neo)具有對氨基糖苷類(如遺傳黴素(G418))的 抗性，允許選擇穩定的轉染子。
我們使用這個載體，因為它的優點在於由前蛋白酶原前導序列可促 進合成的蛋白質分泌，我們可以通過用抗-FLAG抗體的蛋白質印跡檢測 蛋白質的表達，以及我們可用遺傳黴素選擇製備穩定的細胞系。
LHg的克隆
將PCR產物以及p3XFLAG-CMV-9表達載體純化，並用EcoRI和 EcoRV消化。將DNA片段4'C連接過夜。然後將連接混合物用於轉化化 學感受態細胞。酶消化選擇陽性克隆。對產生正確消化圖式的那些克隆 進行測序。此時，測序的克隆呈現LH這的不正確插入，所以我不得不重 復此克隆步驟。預測的胺基酸序列給出分子量為20593.8的187個胺基酸 的蛋白質。
FSHg的克隆
將pCRII-TOPO FSHg用Bamffl/Notl消化並將對應於FSH旦cDNA的條 帶純化並亞克隆到p3XFLAG-CMV-9。然後用Not/EcoRV和綠豆核酸酶消
化陽性克隆，然後再連接以得到與前蛋白酶原前導序列框內的FSHg，將 這些構建體命名為CMV-FSH良。或者，將pCRII-TOPO FSH^用 Xba/BamHI消化並將得到的條帶亞克隆到p3XFLAG-CMV-9 。然後將陽 性克隆用EcoRV消化並再連接以得到帶有前蛋白酶原前導序列框內的 FSH仏將這個構建體命名為CMV-FSHg。酶消化選擇陽性克隆；對給出 正確消化圖式的那些克隆測序。對應於不同克隆策略的兩個不同的集落 的測序是正確的。這些構建體用於ZF4細胞系的轉化。對於兩個不同克 隆策略，預測的胺基酸序列給出分子量分別為19062.24/19965.21的 174/183個胺基酸。
g的克隆
將pCRII-TOPO i用Kpnl/Xbal消化，將得到的條帶亞克隆到 p3XFLAG-CMV-9。酶消化選擇陽性克隆。對消化的正確圖式的那些克 隆測序。序列分析顯示，我們克隆到正確方向並與flag和前蛋白酶原前 導序列在框內的a，將此構建體命名為CMV-^預測的胺基酸序列給出 分子量為21083.24的190個胺基酸的蛋白質。
使用QIAprep旋轉Miniprep試劑盒，通過SDS鹼性裂解純化質粒 CMV-FSHg禾QCMV-込。用ScaI使純化的質粒線性化。在1%的瓊脂糖凝 膠電泳中分離線性化產物並用溴化乙錠染色。將線性化質粒純化並定
將FSH P轉染入斑馬魚成纖維細胞系(ZF4)
ZF4 (ATCC號CRL-2050)細胞為來自1日齡斑馬魚胚胎的成纖維細 胞。將ZF4細胞的冷凍等分試樣從液氮取出並立即置於冰上10分鐘。將 融化的細胞懸浮液從小管取出並於室溫在IO ml完全培養基(含有l，2g/L碳 酸氫鈉、2.5mM L-穀氨醯胺、15mM HEPES和0.5mM丙酮酸鈉、10%胎 牛血清和青黴素/鏈黴素的l:l Dubelco's改良的Eagle's培養基和Ham's F12
混合物)中稀釋。通過1200rpm離心8min除去上清液。在8 ml完全培養基 中重懸浮細胞並轉移到細胞培養瓶(T25)中於28'C培養。在倒置顯微鏡下 觀察細胞以檢査細胞密度。培養至80%融合時，將培養基除去，並用3 ml的PBS洗滌以除去細胞碎片和血清。然後加入0.5 ml胰蛋白酶溶液 (0.25%)並於室溫孵育直到來自單層的細胞自瓶子分離，當已經獲得單細 胞懸浮液時，加入5 ml完全培養基以停止胰蛋白酶消化。使用Fuchs-Rosenthal血細胞計數器計算活細胞和非活細胞。將細胞以100 150個 細胞/mm2 (各T25培養瓶中5xlS)的密度接種到新瓶。在下一次傳代前， 細胞於28'C培養最多4天。當50 60%融合時，根據製造商說明書，使 用Fugene 6在斑馬魚成纖維細胞中實施轉染。在無血清的培養基中以 Fugene6: DNA為6:1的比率製備Fugene6/DNA複合體。從細胞除去培養基 並更換無血清培養基。逐滴加入Fugene6/DNA複合體並混合。將細胞 28'C培養5小時。然後除去培養基並更換完全培養基。作為對照，以 pEYFP-Nl質粒共轉染Zf4細胞並在轉染後16和24小時在Leica共聚焦顯 微鏡下分析陽性細胞。使用不同濃度的DNA以建立用於這個質粒的最 佳濃度，結果在21 cn^的表面上的l嗎DNA是獲得大約30。/。轉化的最佳 濃度。
LHg、 FSHg和込表達的檢測 免疫組織化學
也可將轉染的細胞通過免疫組織化學進行分析，以檢測細胞中蛋白 質的表達。將細胞在含2%的多聚甲醛、0."/。的戊二醛的PBS中固定10分 鍾，為了除去固定劑，用PBS洗滌細胞兩次。然後將它們在含0.2% Triton X-100的PBS中通透化(permeabilise)10分鐘。為了降低由固定劑引 起的自發螢光，在10分鐘期間加入溶於PBS的2 mg/ml的NaBH4。用 0.1%BSA-c、 0.02%冷水魚鱗明膠封閉30分鐘。於4°。在0.1。/。BSA-c、 0.02n/。冷水魚鱗明膠中與抗FLAG抗體(l:250)孵育過夜。將抗體除去並用
0.1%BSA-c、 0.02%冷水魚鱗明膠洗滌2次，每次10分鐘。加入在 0.1%BSA-c， 0.02%冷水魚鱗明膠中1:1000稀釋的二級抗體(抗兔Alexa 488)並於室溫孵育60分鐘。然後用0.1。/。BSA-c、 0.02%冷水魚鱗明膠洗滌 3次，置於DABCO/Gelvatol中。在Leica共聚焦顯微鏡中的細胞分析顯 示，在轉染細胞的囊泡中有蛋白質的表達。這個位置與預計的蛋白將要 分泌的位點相同。
蛋白質印跡
在T25培養瓶中使用Fugene 6轉染不同的構建體一式兩份，以不轉染 DNA的細胞、轉染空載體和轉染陽性對照CMV-BAP作為對照。在轉染 後第3天和第5天從上清液中收穫蛋白質。根據製造商說明使用amicon柱 對上清液進行濃縮。根據製造商說明將FLAG融合蛋白與抗-FLAG M2 親和凝膠免疫沉澱。將蛋白質樣品用樣品緩衝液1:4稀釋煮沸並於-8(TC 保存。為了設定蛋白質印跡的條件，只分析陽性(CMV-BAP)和陰性(無 DNA)對照，在12%丙烯醯胺凝膠中加樣，50 mAmp運行60 min。將凝膠 印跡在硝酸纖維素膜上。將膜用5%的牛奶於41:封閉過夜，以及與5%的 牛奶中按1:250稀釋的抗FLAG抗體於室溫進行免疫檢測1小時。根據制 造商說明用ECL顯示免疫檢測。抗體識別表達的BAP蛋白質顯示預計大 小的條帶。用這些實驗我們顯示瞬時轉染的細胞產生了目的蛋白質。
製備穩定的細胞系
在6孔室中使用Fugene 6以線性化並純化的DNA轉染細胞。不轉染 DNA的細胞作為對照細胞。轉染3或5天後，加入G418的完全培養基代 替完全培養基。殺死不表達構建體的細胞的G418的量隨細胞系而不同。 對於ZF4細胞系，製造商建議的濃度在0.8-l mg/ml。將細胞以0.8和1 mg/ml處理， 一式四份，每天更換培養基以洗去死細胞。如此進行15天 直到板上沒有DNA的細胞死亡並且我們在板上觀察不到任何細胞。然後將轉染的細胞與相同濃度的G418另外培養5天。當獲得匯合的單層時， 將細胞傳代到T25培養瓶並將完全培養基中G418的濃度降低到 0.5mg/ml。用免疫組織化學並以抗FLAG抗體進行蛋白質印跡分析檢測 穩定的細胞系以檢測蛋白質的表達。
生物測定
為了檢測轉染細胞表達的激素是否有活性，進行了簡單的生物測 定。通過上調或下調不同基因的表達使來自斑馬魚的濾泡細胞培養物對 垂體提取物和/或人絨毛膜促性腺素(hCG)發生反應。hCG (15IU/ml)以時 間依賴的方式提高激活蛋白gA的表達水平。這個作用在處理40 min明顯 並在2h達到最高水平，更長處理時間(4h)減弱了此效果。相反，激活蛋 白&B在相同條件下受到抑制。當使用不同濃度的hCG進行實驗時，觀察 到劑量依賴的反應。金魚垂體提取物也以劑量依賴的方式剌激激活蛋白 gA的表達並抑制激活蛋白gB。我們計劃用培養中的卵泡細胞的這個特 性來檢測FSHg和LHg是否有活性。
體外卵泡細胞培養 卵泡細胞的分離
自寵物商店購買幼斑馬魚並將雌性和雄性不分開培養。將雌性用 0.01%甲卡因甲基磺酸鹽溶液麻醉2分鐘或直到它們靜止不動，並在解 剖前斷頭。然後取出卵巢並置於含L-15 (Gibco)的lO mm培養皿中。以胰 島素針從5條雌魚仔細分離卵泡。在解剖顯微鏡中用目鏡測微計測定分 離的卵泡並選擇大約0.45mm的健康旺盛的卵泡，收集並在添加10%胎 牛血清的M199培養基的T25培養瓶中28'C和5。/。 。02中培養6天。在培養 的第三天更換培養基。在培養的6天期間卵泡細胞顯著增殖，增加細胞 的量用於實驗。洗滌細胞並用胰蛋白酶於28'C消化15分鐘。其後用 M199培養基通過1000 rpm離心2 min洗滌細胞3次，然後在激素處理前，
以每孔lxl05個細胞/ml的密度傳代到24孔板，在完全M199中培養24小 時。由於用於本實驗的細胞量不夠，所以我們以20條雌性開始以得到足 夠的材料。
激素處理
使用不同濃度的上清液，使用15IU/ml的hCG作為陽性對照，並且也 包括鯉魚垂體提取物。為了觀察雌性鰻魚中繁殖能力的作用，我們可在 有垂體提取物的條件下，比較應該使用的細胞的量。
體內注射
將hCG以20IU/ml的濃度溶解於0.9n/。的NaCl溶液。將接受50W的鹽 水的各魚作為陰性對照，hCG作為陽性對照以及不同濃度上清液或純化 的FSHg和/或LH^。注射後l、 2、 4、 6和12 h將魚殺死並取出卵巢用於 RNA提取。
RNA提取
激素處理結束時，從斑馬魚卵巢或卵泡細胞分離總RNA，在液氮中 勻漿，並根據製造商說明使用TRIZOL試劑進行提取。通過與DNaseI孵 育後，接著用酚/氯仿提取以及乙醇沉澱除去痕量DNA。使用白金Taq的 Superscript II—步RT-PCR系統進行RT-PCR。使用25 pmol的上遊和下遊 引物用100ng的總RNA進行反應。50'C進行反轉錄反應30 min。 PCR條件 為40個循環的94。C變性20 s， 56。C退火30 s和72。C延伸l min，接著最後 72"C延伸10 min。將PCR產物在P/。的瓊脂糖凝膠中電泳分離並用溴化乙 錠染色。
為了擴增激活蛋白gA,激活蛋白(3B和(3激活蛋白設計的引物: 上遊-激活蛋白A5'-TGC TGC AAG CGA CAA TTT TA -3' 下遊-激活蛋白A5'-CAT TCG TTT CGG ACT CAA G -3'
上遊-激活蛋白B5'- CAACTTAGATGG ACACGC TG-3' 下遊-激活蛋白B5'- GTG GAT GTC GAG GTC TTG TC-3' 上遊-卩肌動蛋白5'- CCC CTT GTT CAC AAT AAC CT畫3' 下遊-(3肌動蛋白5'-TCT GTG GCT TTG GGA TTC A-3'
鰻魚中穩定細胞系的移植
將穩定細胞系腹膜內移植到鰻魚。將鰻魚麻醉並在腹部切一個小切 口。移植可產生恆量激素的恰當量的細胞。作為陰性對照，移植不表達 激素以及只有空載體的細胞；作為陽性對照，用垂體提取物注射一組鰻 魚。
成熟過程和卵成熟的測定
為了定量雌性鰻魚的最終成熟，隨成熟過程有不同的特徵的變化， 即體重顯著增加、眼直徑增加和在卵母細胞的發育期間的形態變化。在 垂體提取物處理期間觀察到最終卵母細胞成熟的7個形態階段。非透明 卵母細胞(階段O)仍然小並完全充滿脂肪滴。最終水合發生發育成階段 1，示出卵母細胞透明性增強和中心核。在階段2，卵母細胞完全透明並 且脂肪滴聚集並位於中心。在階段3，發生生發泡(GV)遷移。在階段4， 在外周發現生發泡且脂肪滴位於對側。在階段5，脂肪滴由於脂肪融合 而減少，結果成為較大脂肪滴。在階段6完成減數分裂I1，生發泡消失並 且觀察到少量的大脂肪滴。在階段7卵母細胞具有單一脂肪滴。在最初 的兩個階段卵母細胞的直徑有變化；這是由於水合作用的過程所致。這 些卵母細胞成熟的形態變異允許我們確定細胞移植的效果。在細胞移植 後，定期對鰻魚稱重，以及測定眼直徑。在處理期間，取卵母細胞樣品 以確定卵母細胞是否對所述處理有反應。
激素生成細胞的植入
引言
進行了實驗以比較激素生成ZF4細胞移植與標準注射CPE (鯉魚垂體 提取物)的效果。如Palstra等(2005)最近已經描述地，重複注射CPE可獲 得性成熟。重複注射不能產生高質量的卵和有活力的子代，可能由於誘 導了應激。因此如本實施例描述地，CPE注射方法不得不由較小應激的 方法代替。由於在鰻魚中CPE的效果可在幾周後通過形態學、組織學和 內分泌學變化觀察到，因此用雌性銀鰻進行了4周的試驗。注射細胞的 量與實驗鰻魚的垂體的估測重量有關。(大約6pl組織/kg鰻魚)。
材料與方法 激素生成細胞
根據上述方法(用Fugene 6轉染和用G418篩選)，將三個不同的穩定 細胞系獨立地培養將FSHP、 LH(3和FSH/LHa基因插入CMV-啟動子並 在ZF4細胞中穩定轉染。
GFP-(3-半乳糖苷酶穩定細胞系
用pMP2838質粒來製備表達綠色螢光蛋白(GFP)和(3-半乳糖苷酶蛋白 的融合蛋白的ZF4穩定細胞系。Bakkers (2000)描述了該質粒。簡而言 之去掉pUAS-gf^N—LacZ質粒的gfpN-LacZ基因並作為pEGFP-C3質粒 的gft)基因的替代物。因此，具有(3-半乳糖苷酶活性的綠色螢光融合蛋白 (g^5N-LacZ)在CMV啟動子控制下表達。pMP2838質粒也包含如上所述 的用於製備穩定細胞系的新黴素抗性(Neor)基因，可用遺傳黴素(G418) 篩選陽性克隆。以如上所述的相同的方法(用Fugene 6轉染和用G418篩 選)產生ZF4穩定細胞系。
在注射當天，收穫細胞並將各細胞系定量為共108個細胞。將4個細 胞系混合到等細胞濃度，並在無血清的DMEM-F12培養基中稀釋至終濃 度為2千萬個細胞/ml。
P-半乳糖苷酶組織染色
將組織簡要地在PBS (磷酸鹽緩衝鹽水)中漂洗並立即於室溫用含 MgCl2 2mM、 EDTA 5mM和NP-40 0.02%的多聚甲醛1%-戊二醛0.1% PBS固定30 min。然後於室溫用洗液(含MgCl2 2mM、 EDTA 5mM、 NP-40 0.02%和脫氧膽酸鈉0.0ln/。的PBS)在5分鐘內洗滌2次。其後將組織於 37。C用染液(含MgCl2 2mM、 NP-40 0.02%、脫氧膽酸鈉0.01%、 K3Fe(CN)6 5mM、 K4Fe(CN)6 5mM和X-gal lmg/ml的PBS)染色12小時。 然後將染色的組織用PBS洗滌並在石蠟中包埋。
動物和方法
在其從Grevdingen湖(荷蘭)向海遷徙過程中，捕獲野生條件下的60 條雌性銀鰻(900-1600g)。抵達後所有鰻魚裝備了用於鑑定的微晶片 CTrovan:)，並測定了外部參數。將10條鰻魚立即殺死作為對照動物。剩 餘的雌性鰻魚在18t:的3000升人工海水(35 promille)的再循環系統中飼 養。為了防止處理日的細菌感染，將動物在大的單獨的槽中暴露於抗生 素Fluniequine (50mg/L) 3小時。根據以前描述的方法(Palstra等2005)，對 一組24條鰻魚每周注射鯉魚垂體提取物(CPE: 20-mg/kg)，另一組只在 實驗開始時注射lml 4種類型細胞(卩-gal， LH卩、FSH卩、LH/FSHa)的混合 物。將細胞作為懸浮液在背鰭的開始以下和側線以上皮下注射。
每周處死來自各組的6條鰻魚以分析處理效果。這些包括總重 量、眼指數、性腺重量和胸鰭長度。此外，取組織樣品(血液、垂體、肝 髒、性腺)用於以後的分析。另外獲得來自注射部位的樣品以檢測P-半乳 糖苷酶陽性細胞的存在。從相同的鰻魚對照中獲得來自沒有注射細胞區 域的樣品。
結果與討論
細胞植入物
檢測了J3-半乳糖苷酶染色來對皮下植入物進行組織學分析。所有樣 品顯示了存在細胞(

圖12)。著色最初發生在皮下層典型的脂肪/膠原組 織。然而，許多情況下也可觀察到肌肉層周圍的浸潤。比較1周和4周之 間的樣品，甚至P-半乳糖苷酶染色細胞的總量常常增加，這清楚地表明 那些細胞能浸潤宿主組織。沒有顯示排斥反應，由於ZF4細胞來自與鰻 魚進化關係非常遠的斑馬魚，所以這是顯著的觀察結果。
形態學變化
表明開始成熟的最顯著和接近的變化是銀鰻眼尺寸的增加(Dmif等 2004)。從圖13清楚地觀察到細胞植入物誘導的[相對於長度的表面積， Pankhurst 1982]的眼指數的變化與通過CPE注射誘導的變化幾乎相同。 該結果清楚地顯示了細胞植入物的效果。從應該導致最終成熟的於3 4 月刺激的銀鰻可獲得進一步的證據。
結論
上述實驗至少可以得出兩個結論1)在4周期間，銀鰻沒有排斥斑馬 魚ZF4細胞(成纖維細胞系)，甚至發現了增殖現象。2)植入的細胞的混 合物與用CPE的標準方法對眼指數具有相似效果，因此顯示了激素刺激 的跡象。
使用上述的方法和構建體產生鰻魚細胞系並移植到鰻魚。進一步產 生了表達兩個單位((1+ P)的魚細胞。
參考文獻
Palstra, A.P.， Cohen, E.G.H.， Niemantsverdriet, RR.W,， van Ginneken， V..T" van den Thillart， GE.E丄M. (2005) Artificial maturation and reproduction of European silver eel: Development of oocytes during final maturation. Aquaculture, 2005.
Durif， C, Dufour， S.， Elie, P. (2005) The silvering process of the eel: a new classification from the yellow resident stage to the silver migrating stage, J. Fish Biol. 66， 1-19
Pankhurst, W.N. (1982) The relation of visual changes to the onset of sexual maturation in European eel, Anguilla anguilla L. J. Fish Biol. 21， 179-196
Bakker J. (2000) Chitin oligosacharides in Zebrafish development. Investigations at the molecular and cellular level. (Thesis University of Leiden). 附圖簡述
圖l.基於來自(a)人(Hs)、小鼠(Mm)、大鼠(Rn)、斑馬魚(Dr)和鰻 魚(Aj)的LH卩(LH卩),FSH卩(FSH(3)的比對的系統樹圖。 圖2. p3XFLAG-CMV-9表達載體。 圖3.LH卩表達的克隆策略。
圖4.預測的LHb的胺基酸序列給出分子量為20593.8的187個胺基酸 的蛋白質。
圖5.FSH P表達的克隆策略。
圖6.對兩個不同的克隆策略，預測的FSHbblu和FSHb的胺基酸序列 給出分子量分別為19062.24/19965.21的174/183個胺基酸的蛋白質。 圖7. (x表達的克隆策略。
圖8.預測的胺基酸序列給出分子量為21083.24的1卯個氮基酸的蛋 白質。
圖9.pEYFP-Nl轉染ZF4細胞，轉染24h後觀察轉染。 圖IO.在用pEYFP-Nl共轉染細胞中抗-FLAG抗體的免疫組織化學。 圖ll.用抗-FLAG的蛋白質印跡。抗體識別預計大小為FLAG-BAP 的蛋白質。
圖12. P-半乳糖苷酶染色表明在銀鰻中皮下注射出現P-gal-ZF4細 胞。從相同的鰻魚，從注射部位和朝尾部較遠的部位，解剖皮膚/肌肉 組織。如真皮和肌肉層，在圖中容易識別皮下脂肪組織。
圖13.在用激素生成細胞(HPC)或用鯉魚垂體提取物(CPE)處理的4周 (Wl-W4)期間關於最初階段眼指數(EI)變化(n/。)。對於最初階段和每周， 取6條完全生長的雌性銀鰻(重量1300士 300g)。
權利要求
1、一種通過施用激素以改善魚中卵和/或精子的發育和/或成熟的方法，其包括向所述魚提供產生所述激素的細胞。
2、 根據權利要求l所述的方法，其中，所述激素包括促黃體激素 (LH)、促卵泡激素(FSH)或絨毛膜促性腺素(CG)、或它們的功能性部 分、衍生物和/或類似物。
3、 根據權利要求1或權利要求2所述的方法，其中將所述細胞進行 遺傳修飾以表達所述激素。
4、 根據權利要求l-3任一項所述的方法，其中所述激素來自與所述 魚相同的屬。
5、 根據權利要求l-4任一項所述的方法，其中所述細胞已被提供了 一個或多個編碼所述激素的基因。
6、 根據權利要求l-5任一項所述的方法，其中所述細胞為克隆群。
7、 根據權利要求l-6任一項所述的方法，其中選擇的細胞在所述魚 中具有降低的免疫原性。
8、 根據權利要求l-7任一項所述的方法，其中所述魚為海河洄遊魚。
9、 一種分離的和/或重組的魚細胞，其產生生育激素。
10、 根據權利要求9所述的魚細胞，其中所述的細胞經遺傳修飾以 表達所述激素。
11、 根據權利要求9或權利要求10所述的魚細胞，其中所述細胞為 鰻魚細胞。
12、 一種魚，其包含根據權利要求9 11任一項所述的細胞。
13、 根據權利要求12所述的魚，其為食用魚。
14、 根據權利要求13所述的魚，其為鰻魚。
15、 根據權利要求14所述的魚，其中所述的鰻魚屬於鰻鱺屬。
全文摘要
本發明涉及用於通過施用激素改善魚卵和/或精子發育和/或成熟的手段和方法，其包括向所述魚提供產生所述激素的細胞。優選的激素為生育激素(如促黃體激素(LH)、促卵泡激素(FSH)或絨毛膜促性腺素(CG))或其功能部分、衍生物和/或類似物。
文檔編號C12N15/85GK101180399SQ200680009894
公開日2008年5月14日 申請日期2006年1月26日 優先權日2005年1月26日
發明者D·施納貝爾佩拉薩, G·E·E·J·M·范登蒂爾拉特, H·P·斯佩因克 申請人:萊頓大學