靶細胞的定向細胞溶解、引起細胞溶解的試劑和組合物以及可用於製備這些試劑的化合物的製作方法

2023-09-16 17:16:15

專利名稱：靶細胞的定向細胞溶解、引起細胞溶解的試劑和組合物以及可用於製備這些試劑的化合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及由有功能的超級抗原活化的T細胞所引起的靶細胞失活/細胞溶解。細胞溶解可用於治療和體外分析。定義超級抗原根據最先的定義(大約1988-1993年)，超級抗原是事先未經細胞內加工而能夠與MHC II類抗原結合併且通過與T細胞受體(TCR)的Vβ鏈可變區(Vβ)結合活化T細胞的細菌或病毒蛋白。此結合導致T細胞的相對大部分/亞群的Vβ家族限定的活化和表達MHC II類的細胞的溶解(超級抗原依賴型的細胞介導的細胞溶解＝SDCC)。一般超級抗原活化的T細胞亞群構成個體T細胞總數的約1-30％。
符合上述定義的眾所周知的野生型超級抗原有葡萄球菌腸毒素(SEA、SEB、SEC1、SEC2、SED、SEE和SEH)。進一步的實例有毒性休克綜合症毒素1(TSST-1，也是葡萄球菌來源)、剝脫性毒素(ExfoliatingToxin)(Exft)、葡萄球菌致熱性外毒素A、B和C(SPE A、B和C)、小鼠乳房腫瘤病毒蛋白(MMTV)、葡萄球菌M蛋白、產氣莢膜梭菌(clostridialperfringens)外毒素(CPET)、支原體關節炎超級抗原等。對於超級抗原及其特性的綜述，參見Kotzin等1993。
也已將野生型和嵌合超級抗原突變成具有降低的或無MHC II類結合和/或TCRVβ結合(Kappler等WO9314264；Kappler等1993；Blanco等；Abrahmsen等，WO9601650；Antonsson等WO9736932；Antonsson等1997)。此類超級抗原毒性變得更小。在它們完全缺乏與MHC II類或TCRVβ結合的能力時，它們不再是有功能的超級抗原，因為它們隨後喪失了其活化T細胞的能力。
通過突變結構上類似的野生型超級抗原構建嵌合的有功能活性的超級抗原(雜合超級抗原)已是可能的(Lamphaer等，1996和Antonsson等WO9736932)。
已發現在野生型超級抗原與能結合細胞表面結構的尋靶部分連接的情況下，活化和隨後的細胞溶解可以MHC II類非依賴型方式發生(Dohlsten等WO9201470)。這種新的作用機理已稱為超級抗原抗體依賴型的細胞介導的細胞溶解(＝SADCC)。它包括針對靶向部分而不是抗體的類似機理(Abrahmsen等，WO9601650；Antonsson等WO9736932)。
因此，當今的超級抗原概念包括任何未經細胞內加工而能夠與細胞表面結構(靶結構)和一種或多種多態性TCR鏈、特別是Vβ鏈結合，由此活化表達參與結合的特異性TCR鏈的T細胞亞群的化合物(優選地多肽結構)。然後這些T細胞變成細胞毒性的T細胞並且介導它們針對帶有表面結構的細胞(靶結構，靶細胞)的細胞毒性。如果沒有另外說明，本發明上下文中使用的超級抗原(SAG)定義將包括靶向部分與游離超級抗原之間的綴合物，如上面對於SADCC所述的。
對於涉及到的術語超級抗原，如果沒有另外說明，僅指有功能的超級抗原。
游離超級抗原(Sag)是未與靶向部分或免疫調節劑結合的野生型、可能經突變或其它修飾的超級抗原。游離超級抗原的MHC II類結合能力是固有的靶向特性。因為游離超級抗原缺乏結合的靶向部分，所以它們將僅產生SDCC。
綴合超級抗原是游離超級抗原與靶向部分或免疫調節劑之間的綴合物。綴合超級抗原產生SDCC和SADCC中的任意一個或二者。
免疫調節劑(IM)是能夠調節免疫系統的化合物。在本發明上下文中，單獨對待超級抗原，並且當使用免疫調節劑時不包括超級抗原在內。免疫調節劑經常例如對於對應的淋巴細胞受體有固有的靶向能力。除非另有說明，否則免疫調節劑是非結合的形式。
靶向部分(T)是能與細胞表面結構和/或組織結構結合的部分。
綴合物是由彼此共價連接的兩個或多個部分Sag、IM、T等組成。
活性成分的可溶形式是指溶於來自身體的液體如血清和血漿中的形式。背景領域-超級抗原的治療用途已經提出非綴合的野生型和突變的超級抗原用於治療，其治療效應可能通過免疫系統在與待治療疾病有關的表達II類的細胞局部活化或作為系統性活化來實現(Kalland等WO9104053；Terman等WO9110680和WO9324136；Antonsson等WO9736932和Newell等1991)。由於野生型超級抗原的極大毒性，此方法對於癌症治療來說應該僅適用於所有癌症中很少的一部分。
也提出使用與尋靶部分結合的超級抗原(Dohlsten等WO9201470；Abrahmsen等，WO9601650；Antonsson等WO9736932和Ochi等1993)，所有這三篇公開文獻引用作為參考)。
在關於通過IL-2在體內防止超級抗原誘導的T細胞介導的細胞毒性活性的下調的研究方面，已推測同時施用IL-2與非綴合的野生型超級抗原和與抗體結合的野生型超級抗原應該是有利的(Belfrage論文1996年8月/9月；Belfrage等1994；Belfrage等1995；Belfrage等1997a；Belfrage等1997b(野生型超級抗原))。
也已證明細胞膜錨定的CD80在無MHC II類抗原存在的情況下在T細胞的超級抗原活化中有作用(Lando等1993和1996)。
Lando等1996中的圖4顯示了分析只與抗體結合的超級抗原或與IL-2聯合誘導靜止人T細胞增殖的能力的實驗。在此4天實驗中，將結合的超級抗原呈遞到親本CHO細胞和經轉染表達II類或C215或II類加C215的CHO細胞上。IL-2的影響不明顯。
Kapper等(WO9314634)提出經突變喪失其Vβ或MHC II類結合能力的非綴合的野生型SEB(在疫苗中並且作為中和超級抗原的毒性效應的試劑)。Abrahmsen等(WO9601650)提出用具有修飾的、優選地降低的與II類抗原結合的能力的結合的超級抗原進行癌症治療。Antonsson等(WO9736932)提出使用具有降低的血清反應性的嵌合超級抗原和超級抗原的治療(也參見Abrahmsen等)。Abrahmsen等(WO9601650)和Antonsson等(WO9736932)所述的突變涉及在待治療的哺乳動物中具有更低的系統毒性、降低的免疫原性和/或降低的血清反應性的超級抗原。
已經提出施用編碼野生型超級抗原的核酸的治療(Terman等WO9110680，WO9324136和Dow等WO9636366)。Dow等走得更遠並提出編碼細胞因子或趨化因子的核酸與編碼超級抗原的核酸的共施用。雖未能有實驗的支持，WO9636366也提出雙順反子基因構建體形式的構建體，其中一個順反子含有編碼超級抗原的基因並且另一個順反子含有編碼細胞因子或趨化因子的基因。
雖未能有實驗的支持，但Pouletty P(Sangstat，EP510949)推測靶向部分如IL-2和野生型超級抗原之間的綴合物對於使表達IL-2受體的細胞失活可能是有用的。背景領域-免疫調節劑與對要使之失活的細胞特異的抗體聯合時的治療用途以前已經提出帶有生物反應性調節物，例如趨化因子或細胞因子如白細胞介素2的綴合抗體(Fell等EP439095；Rosenblum等EP396387，Pancook等1996和Becker等1996)。本發明著手解決的問題本發明著手提供對於涉及免疫系統活化的、為了使待治療哺乳動物中不需要的靶細胞失活的超級抗原治療的改進。具體地，這些改進涉及1.在第一個治療周期過程中，例如在腫瘤中，局部延長活化時間；2)阻礙由於活化的T細胞轉變成無反應狀態的趨勢而出現的低反應性；3)促進腫瘤區域中MHC II類非依賴型的T細胞活化；和4)通過超級抗原活化拓寬細胞溶解的治療窗口。現已發現如果超級抗原(SAG)的施用與可溶形式免疫調節劑的施用結合，超級抗原和免疫調節劑中至少一種是以帶有具有針對要使之失活的細胞的靶向特性的部分的綴合物形式，那麼這些改進可完全或部分實現。本發明的第一個主要方面使靶細胞失活的方法本發明的第一方面包括治療和體外分析，並且是一種通過在不是超級抗原(Sag)的免疫調節劑(IM)存在的情況下使兩種類型的細胞與超級抗原(SAG)、特別是通過與TCR Vβ結合活化T細胞的超級抗原接觸從而在T細胞存在的情況下使不需要的靶細胞失活的方法。在其最廣的方面，此方法的特徵在於超級抗原與免疫調節劑中的至少一種是以帶有具有針對要使之失活的細胞的靶向特性的部分(T)的綴合物形式。在子方面中，此方法特徵在於a.超級抗原(SAG)和免疫調節劑以包含超級抗原(Sag)、針對靶細胞的靶向部分(T)和免疫調節劑(IM)的三體綴合物形式(T，IM，Sag-綴合物)使用；b.超級抗原(SAG)以超級抗原(Sag)和針對靶細胞的靶向部分(T)之間的二體綴合物結合免疫調節劑(IM)和針對靶細胞的靶向部分(T』)之間的二體綴合物的形式(T，Sag-綴合物+T』，IM-綴合物)使用；c.超級抗原(SAG)以超級抗原(Sag)和針對靶細胞的靶向部分(T)之間的二體綴合物形式使用並且免疫調節劑(IM)以游離形式，即未與針對靶細胞的靶向部分結合的形式(T，Sag-綴合物+IM)使用；d.超級抗原(SAG)以自由形式(Sag)使用並且免疫調節劑以綴合物形式，即免疫調節劑(IM)與超級抗原(Sag)之間的二體綴合物形式(Sag+T，IM-綴合物)使用；以及e.超級抗原(SAG)與免疫調節劑以超級抗原(Sag)與免疫調節劑(IM)之間的二體綴合物形式(Sag，IM-綴合物)使用；超級抗原和免疫調節劑可靶向相同類型的細胞，例如靶向相同或交叉反應性結構/表位或相同組織內不同類型的細胞。靶向可以針對與一種和相同組織有關的正常細胞或患病細胞。超級抗原和免疫調節劑中一種或二者可用同一種或多種抗體靶向。本發明方法要治療的疾病。
要治療的疾病原則上與以前提出的超級抗原治療的那些疾病相同。參見例如上述標題「背景......」下的內容。例證性實例有癌症、自身免疫疾病、寄生蟲感染、病毒感染和其它與在其表面表達對各個疾病特異的MHC II類抗原和/或其它結構的並且與插入符合本發明概念(化學式I)的超級抗原的尋靶部分結合的細胞有關的疾病。另外，通過使用本發明也可抵抗細菌感染。
本

發明內容
中重要的癌症形式有黑素瘤、癌、造血細胞瘤和纖維肉瘤並且包括具體的形式如鱗狀細胞癌、乳腺癌、頭頸部癌、甲狀腺癌、軟組織癌、骨肉瘤、睪丸癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、皮膚癌、腦癌、血管肉瘤(angiosarcomas)、血管肉瘤(hemangiosarcomas)、肥大細胞瘤、早期肝癌、肺癌、宮頸癌、腎細胞癌、白血病和淋巴瘤。包括的是任何類型的惡性或良性腫瘤以及多藥抗性腫瘤、轉移的腫瘤、各種形式的化學或病毒(皰疹病毒、SV40、HIV等)誘導的癌症。本發明的第二主要方面本發明的超級抗原綴合物本發明的這方面包括符合化學式(I)(T)x(Sag)y(IM)z的綴合物。T是靶向部分，Sag對應於游離超級抗原並且IM是非超級抗原的免疫調節劑。T，Sag和IM通過在一種和相同綴合物分子或物質內不同或相同的有機接頭B連接在一起。符合化學式I的綴合物包括化學綴合物以及重組合成的綴合物(融合蛋白)。x，y和z是一般選自0-10的整數如0-5，並且分別代表T、Sag和IM部分在給定綴合物分子中的數目，其中y＞0並且同時x和z中的一個或二者＞0。化學綴合物一般是含有不同綴合物分子混合物的綴合物物質。因此，在化學綴合物中x，y和z也可能是0-10範圍如0-5範圍內的非整數。
在化學式I的第一個子方面中，Sag和IM和T存在於綴合物中(x和y和z＞0；T，Sag，IM-綴合物)。x，y和z一般為整數1-3，優選1-2。x，y和z之間的典型關係是x＝y＝z；x＝y＝0.5z；x＝0.5y＝0.5z和x＝0.5y＝z。
在符合化學式I的綴合物的第二個子方面中，靶向部分缺乏(IM，Sag-綴合物，x＝0)。y和z一般是整數1-3。X和y之間優選的關係為x＝y；x＝0.5y；0.5x＝y；x＝1/3y和1/3x＝y。
在兩個子方面中，整數或關係主要指這樣的融合蛋白，其中靶向部分可能是含有1、2、3或4條多肽鏈的蛋白並且其中每個綴合分子中有一個T。
根據第二個子方面，綴合物的化學式I縮減為(Sag)y(IM)z化學式II這種綴合物主要適於治療與表達MHC II類抗原的細胞有關的疾病、特別是表達II類的癌症如造血系統癌症以及一些自身免疫疾病、病毒感染和寄生蟲感染，並且適於治療與免疫調節劑的細胞膜錨定受體有關的疾病，表達例如IL-2受體的T細胞淋巴瘤。A.化學式I中的免疫調節劑IMIM代表不是游離的或結合的超級抗原的免疫調節劑。
免疫調節劑可以是細胞因子或趨化因子。舉例說明的細胞因子有粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子α或β(TNFα或TNFβ)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18和IGF。舉例說明的趨化因子有C5a、IL-8、單核細胞趨化蛋白1α(MIP1α)或單核細胞趨化蛋白1β(MIP1β)、單核細胞化學吸引劑蛋白1(MIP-1)、單核細胞化學吸引劑蛋白2(MIP-2)、單核細胞化學吸引劑蛋白3(MIP-3)、血小板活化因子(PAFR)、N-甲醯基-甲硫氨醯基-亮氨醯基-苯丙氨酸(FMLPR)、白三烯B4(LTB4R)、胃泌素釋放肽(GRP)、RANTES、eotaxin、淋巴細胞趨化因子、IP10、I-309、ENA78、GCP-2、NAP-2、MGSA/gro、DC-CK1、Flt3L(異位結構域)、fractalkin、PF-4等。
另一種類型的免疫調節劑是那些源自參與調節激發的免疫反應如共刺激的細胞膜錨定受體/配體對的免疫調節劑(例如淋巴細胞表面結合的受體和相應的細胞結合的配體)。舉例說明的實例有選自配對CD40L/CD40、4-BB1/4-BB1L、CD28/B7、CTLA-4/B7等的成員。B7包括變異體如CD80和CD86，其中前者是優選的。優選的形式是可溶的，含有胞外部分(異位結構域)並且沒有細胞內和膜錨定的部分。
特別優選的免疫調節劑能夠例如通過阻礙超級抗原活化的T-細胞轉變成無反應狀態在體內增強超級抗原的效應。典型的適當的細胞結合的受體/配體是CD28/B7，包括上述類似物和片段。此組典型的細胞因子有作為CD28/B7信號途徑下遊主要效應物的IL-2以及IL-2樣細胞因子IL-7和IL-15。在T細胞表面結合的受體/配體對中，優選將不與待活化T細胞結合的成員插入根據本發明所述的綴合物中。對於CD40L/CD40、4-BB1/4-BB1L和CD28/B7，這意味著有上述優選的可溶形式的CD40、4-BB1L和B7。本文的實驗部分說明在本發明中於優先權日發現為最佳的免疫調節劑變體。
免疫調節劑優選地應該是與要治療的個體相同的品種來源。天然免疫調節劑如細胞因子和趨化因子通常在哺乳動物中表現高系統毒性和相對短的半衰期。有很多文獻是關於如何將免疫調節劑修飾成相對於氧化有增強的穩定性、更長的體內半衰期、更低的毒性和通過重組技術製備時改進的摺疊等。例如美國專利US5,229,109(Gram等)描述了由於缺乏與受體的p55α亞單位的結合而對高親和性IL-2受體(IL-2R)具有下降親和性的IL-2的低毒性類似物。這些類似物主要通過突變IL-2中33-46位胺基酸(例如Arg38Ala和Phe42Lys或Phe42Ala)的密碼子加以製備。Asp20Lys突變體具有對IL-2受體的p75/β鏈100-500倍降低的親和性而不影響對p55的結合(Collins等1988)。其它突變如Asp20Ser程度較輕(Berndt等1994)。對鼠IL-2的研究表明人IL-2的Asp84和Asn88也參與p75結合(Zurawski等1993)。這通過模擬人IL-2與其受體間的結合而得到支持(Bamborough等1994)。這些突變親和性預期的下降是Asp20＞Asn88＞Asp84。
結合Arg38與Phe42中的突變與位置88和20中突變將導致對IL-2R更低的親和性。另一種有效的並且在優先權日優選的IL-突變是得到具有更低的細胞內化率和更長的免疫調節效應持續時間的IL-2類似物的Thr51Pro(Chang等1996)。
胺基酸位置的編號根據Taniguchi等1983。
Grimm等；Collins等1988；Berndt等1994；Zurawski等1993；Bamborough等1994；Chang等1996和Taniguchi等1983在此引用作為參考。
上述對其正常受體有降低的親和性的細胞因子和趨化因子類似物在綴合物中的應用將增強它們靶向預定的靶細胞。可以想像與帶有天然形式的免疫調節劑的相應綴合物相比，經突變在結合其各自細胞受體時表現降低的細胞內化率並且插入符合化學式I的綴合物的細胞因子和趨化因子將導致更長的超級抗原活性。
因此術語免疫調節劑(IM)包括能興奮或拮抗免疫調節劑的相應天然形式效應的任何修飾形式，例如任何突變形式。B.化學式I中的超級抗原部分SAG化學式I中的Sag代表在上述標題「背景...」下對游離超級抗原定義的超級抗原，即野生型超級抗原可能例如通過突變而修飾成a.與相應的野生型超級抗原相比，具有降低的與MHC II類抗原結合的能力(參見例如Abrahmsen等(WO9601650))；b.與相應的野生型超級抗原相比，在人血清中具有降低的血清反應性(參見例如Abrahmsen等(WO9601650)和Antonsson等WO9736932和Antonsson等1997)；c.與相應的野生型超級抗原相比，在人類中具有降低的免疫原性(參見例如Antonsson等WO9736932和Antonsson等1997)；d.是兩種或多種類似野生型超級抗原之間的嵌合體，其中第一種野生型超級抗原中的一個區域已用第二種類似超級抗原中的相應區域替換。所述區域可以是決定與TCRVβ結合的區域，例如對SEE/SEA和SEA/SEE嵌合體所述的(參見例如Antonsson等WO9736932；Antonsson等1997和Lamphaer等1996)。
發現適當的其它修飾/突變也包括在內從而例如在真核細胞中合成時避免不想要的糖基化。
以前SEA/SEE樣超級抗原的典型突變有(編號如Antonsson等1997和Antonsson等WO9736932所用的)a.降低的MHC II類結合Asp227Ala(＝SEAm9)，Phe47Ala和/或Asp70Arg。突變體Phe47Ala/Asp227Ala＝SEAm23。
b.和d.SEA和SEE間的嵌合體，旨在降低人體中的血清反應性，同時維持相應結合的超級抗原的SADCC能力SEE具有以下的替換Gly20Arg，Thr21Asn，Gly24Ser，Lys27Arg。
用於實驗部分的突變體是SEA(Asp227Ala)＝SEAm9，SEA(Phe47Ala/Asp227Ala)＝SEAm23和SEA(Phe47Ala/Asn102Q/Asn149Asp/Thr218Val/Asp227Ala)＝SEAm57。以前提出的優選的超級抗原選自1.表現2個MHC II類結合位點的超級抗原(Sag)(例如葡萄球菌腸毒素A和E)，2.與MHC II類的最佳結合需要Zn離子的以其未突變形式的超級抗原(Sag)(例如SEA、SEE和SEH)，3.葡萄球菌腸毒素。
待插入根據本發明所述的綴合物中的Sag分子不必須是有功能的超級抗原，主要問題是最終的綴合物產生上述的SADCC和SDCC中的一個或二者。C.化學式I中的靶向部分T。
T原則上可以是任何能與細胞表面結構、優選地疾病特異性結構結合的結構。T靶向的結構通常不同於(a)Sag結合的多態性TCR鍊表位和(b)Sag結合的MHC II類表位。尋靶部分可選自白細胞介素(例如白細胞介素2)、激素、抗體包括抗體的抗原結合片段、生長因子等。參見例如Woodworth 1993(在此引用作為參考)。
因此靶向部分可以是含有1、2、3或4條多肽鏈的蛋白。
在優先權日，優選T細胞是抗體(全長抗體、Fab、F(ab)2、Fv、ScFv(單鏈抗體)、多個單鏈抗體(ScFv)n和任何其它結合抗原的抗體片段)，包括上述抗體的任何有功能活性的截短形式。其它變體是單特異性和雙特異性的。抗體原則上可以針對任何疾病相關/特異的細胞表面結構，例如與上述任何給定腫瘤形式連接的結構，其中特別強調抗體活性片段(如Fab)。通常抗體可針對結腸和/或胰腺特異性表位如所謂的C242表位(Lindholm等WO9301303)、肺癌特異性表位如5T4抗體的表位(Stern等WO8907947)、淋巴瘤特異性表位如CD19上黑素瘤特異性表位，例如HMW-MAA等。
術語「抗體」包括單克隆以及多克隆變體，其中優選單克隆製劑。
在靶向部分是Fab片段時，通常將使重輕鏈Fab鏈連接在一起的半胱氨酸殘基優選地用不允許二硫橋形成的胺基酸如絲氨酸替換。也參見Antonsson等WO9736932。
上面所述的也包括T可能針對或多或少的調節或控制疾病發生的健康細胞上的獨特結構。D.接頭B接頭B可按前述(Dohlsten等WO9201470；Abrahmsen等WO9601650和Antonsson等WO9736932)選擇；即B優選地應是親水性的並且表現選自醯胺、硫醚、二硫化物等的一種或多種結構。最重要的接頭是通過重組技術得到的那些接頭，即結合發生在基因組水平從而得到寡肽接頭。通常，接頭含有1-30個如1-20個胺基酸殘基，優選地選擇這些胺基酸殘基使得接頭總體上為親水性。因此接頭殘基優選地選自親水性胺基酸殘基如Gln、Ser、Gly、Glu、Pro、His和Arg。典型的寡肽接頭包括三肽GlyGlyPro或所謂的在氨基末端可能用gly-pro修飾的Q接頭(Wootton等1989，在此引用作為參考)。E.T、SAG和IM的結合點化學綴合物通常將含有連接位點不同的綴合物分子的混合物。綴合物物質將含有異型以及同型綴合物。
對於重組綴合物(融合蛋白)，得到的綴合物物質在連接位點上將是相同的。對於每個單獨的亞單位(T，Sag，IM)，氨基末端優選地通過插入的寡肽橋與另一亞單位的羧基末端融合或者反之亦然。在綴合物含有T，Sag，IM每種各一個時，組合將是T-IM-Sag，IM-T-Sag，Sag-IM-T，Sag-T-IM，T-Sag-IM，IM-Sag-T(B接頭結構的存在未顯示)。在一個或多個亞單位含有兩條或多條多肽鏈時，可能性的數目增加。對於T為抗體Fab片段時，可能性將是(寡肽接頭B未顯示)1.Sag-Fab(輕鏈)-IM 2.Fab(輕鏈)Fab(重鏈) Sag-Fab(重鏈)-IM3.Sag-Fab(輕鏈) 4.Fab(輕鏈)-IMFab(重鏈)-IM Sag-Fab(重鏈)5.Sag-Fab(輕鏈) 6.IM-Fab(輕鏈)IM-Fab(重鏈) Sag-Fab(重鏈)7.Fab(輕鏈)-Sag 8.Fab(輕鏈)-IM
Fab(重鏈)-IMFab(重鏈)-Sag在進一步的變異體中，免疫調節劑和超級抗原可依次在抗體任何鏈的任何末端融合。
在優先權日，重組綴合物是優選的，其中最優選的是Fab片段作為靶向部分以及使游離超級抗原的氨基末端與抗體重鏈(CHl)或輕鏈的第一個恆定區連接並使免疫調節劑與剩下的羧基末端連接(對化學式I-IV有效)。
為了最佳的製備與功能，將融合蛋白重組表達為兩條鏈的產物，其中超級抗原通過可彎曲的3-11個殘基的親水性胺基酸接頭在C-末端與抗體Fab片段的CHl-結構域融合。此接頭可以具有序列Gly-Gly-Pro或Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro(SEQ IN NO19)或基於SEQ IN NO19的4-9個殘基，其中SEQ IN NO19是優選的。免疫調節劑部分通過10-20個殘基的親水性並且中性或帶正電的接頭(接頭Q)在C-末端與輕鏈融合。優選，接頭Q可具有以下序列Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Asn-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg(SEQ ID NO23)、Gly-Pro-Arg-Gln-Ser-Asn-Glu-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg(SEQ ID NO20)、Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Thr-Thr-Arg(SEQ ID NO21)和Gly-Pro-Thr-Glu-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Glu-Glu-Glu-Thr(SEQ ID NO22)，其中SEQ IN NO20和21是最優選的(更多細節參見實施例2)。
據信此時氨基末端的類似組合或在VH和VL結構域氨基和羧基末端的結合的組合導致有活性但是效率更低的綴合物。F.不符合化學式I但根據本發明方法中上述組合a-e使用的活性整體。
游離超級抗原(Sag)參見標題「定義」。典型的Sag列於標題「背景」和「B.化學式I中超級抗原部分Sag」。
非結合的免疫調節劑參見標題「定義」。原則上可使用與在標題「A。化學式I中的免疫調節劑IM」下給出的相同的免疫調節劑。細胞因子和趨化因子是優選的，其中強調IL-2和IL-2樣細胞因子。
定向免疫調節劑(T，IM-綴合物)這些綴合物符合基本化學式(T』)x(IM』)z化學式III其中T』和IM』通過有機接頭B』連接在一起。T』、IM』和B』選自與T、IM和B相同組的化合物/結構。x和z以與化學式I相同的方式定義(y＝0)，其中每個T』和綴合物分子優選一個或兩個IM』。T』和IM』之間的結合點如化學式I中所定義。也參見標題「E.結合點......」，其中化學式1-8及對其的註解除了省略Sag外也適用於T，IM綴合物。化學式III的綴合物可根據已知技術即常規化學連接或重組技術(融合蛋白)製備，其中後者是優選的(Fell等EP439095；Rosenblun等EP396387)。特別重要的T，IM-綴合物包括已經修飾如突變而具有上述降低的親和性和/或降低的內化率的IM』-部分。
定向超級抗原(T，Sag-綴合物)這些綴合物符合基本化學式(T』)x(Sag』)y化學式IV其中T』和SAG』通過有機接頭B』連接在一起。T』、Sag』和B』選自與T、IM和B相同組的化合物/結構。x和y以與化學式I相同的方式定義(z＝0)，其中每個T』和綴合物分子優選一個或兩個Sag』。T』和Sag』之間的結合點如化學式I中所定義。也參見標題「E.結合點......」，其中化學式1-8及對其的註解除了從化學式省略IM外也適用於T，Sag綴合物。化學式IV的綴合物可根據已知技術即常規化學連接或重組技術(融合蛋白)製備，其中前者是優選的。參見例如Dohlsten等WO9201470；Abrahmsen等WO9601650；和Antonsson等WO9736932。本發明的第三主要方面含有修飾的免疫調節劑的綴合物。
這些新的綴合物符合化學式(T)x(Sag)y(IM)z化學式V其中T和Sag選自與化學式I的T和Sag相同的化合物。IM是經修飾如通過突變而對其細胞膜錨定的受體表現降低的親和性和/或降低的通過結合其受體的內化率的免疫調節劑(與相應的天然形式相比)。IM優選地是細胞因子或趨化因子。進一步參見標題「A.化學式I中的免疫調節劑IM」。本發明這方面的一個重要免疫調節劑是修飾的IL-2。x，y和z以與化學式I相同的方式定義。
在符合化學式V的綴合物的第一個子方面中，T、Sag和IM總是存在(所有x和y和z＞0)，即T，Sag，IM-綴合物。x，y和z一般是整數1-3，其中優選1-2。x，y和z之間的典型關係為x＝y＝z；x＝y＝0.5z；x＝0.5y＝0.5z和x＝0.5y＝z。
在符合化學式V的綴合物的第二個子方面中，超級抗原部分缺乏(y＝0)，即T，IM-綴合物。x和z一般是整數1-3。x和z之間的優選關係為x＝z；x＝0.5z；0.5x＝z；x＝1/3z和1/3x＝z。
在符合化學式V的綴合物的兩個子方面中，給定的整數範圍或它們的相互關係主要指這樣的融合蛋白，其中靶向部分可能是含有1、2、3、4條多肽鏈的蛋白並且其中每個綴合分子中有一個T。化學式V的融合蛋白的結合點與符合化學式I的相應融合蛋白相同。也參見標題「E.結合點......」，其中化學式1-8及對其的註解除了對於第二個子方面省略Sag外也適用於T，IM綴合物。上述綴合物的製備。
綴合物的製備原則上可根據兩個主要途徑進行1.將各個亞單位T、Sag和IM化學連接在一起。每個單獨亞單位或其組合可通過重組技術加以製備。
2.如上述任何化學式中定義的直接提供綴合物的重組技術。
實際方法對於普通技術人員是眾所周知的並且包括大量變化。
化學連接一般利用通常天然存在於超級抗原、蛋白性免疫調節劑和蛋白性靶向部分的多個位置中的官能團(例如伯氨基、羧基、巰基、碳水化合物基團)。這些技術在本領域中是眾所周知的。
本發明超級抗原與免疫調節劑之間的綴合物(融合形式以及非綴合形式)的大規模重組製備的主要宿主細胞是大腸桿菌。此宿主原則上提供兩條途徑細胞內合成和分泌。後一種變化形式是優選的，因為它提供來自周質和培養基的正確摺疊蛋白的純化。上述並不排除有可能在其它宿主，例如真核細胞如酵母或哺乳動物細胞中製備有活性的綴合物。到目前為止的初步結果已經表明真核細胞如哺乳動物細胞對於插入與CD28相互作用的免疫調節劑如B7及其類似物可能是優選的。本發明的第四方面編碼新發明綴合物的基因構建體。
本發明的第四方面是編碼上述超級抗原和免疫調節劑、優選地編碼上述IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、RANTES、CD80異位結構域、CD86異位結構域、4-BB1L和Flt3L及它們的類似物的重組核酸分子、優選地DNA如cDNA或RNA。在本發明的這一方面，核酸一般應該含有與免疫調節劑和超級抗原要在其中表達的宿主細胞相容的用於免疫調節劑和超級抗原等中的一個或二者的調控序列如翻譯調控序列、複製起點、分泌信號序列。編碼超級抗原與免疫調節劑的序列部分間的區域可包含編碼核糖體進入位點的序列如雙順反子基因構建體。後者將允許包括在綴合物中的每條多肽鏈的分別表達。在含有IM，Sag，靶向綴合物和適當信號序列的多鏈綴合物中，雙順反子構建體將促進摺疊並且裝配成有完全活性的綴合物，其中IM與其中的一條鏈結合。在其中靶向部分是兩條鏈的抗體分子並且超級抗原(Sag)和免疫調節劑中的至少一個與抗體鏈的末端融合的情況下，這將是重要的。參見上述。藥物組合物、劑量和施用途徑。
本發明的第五方面是含有本發明超級抗原(Sag)、靶向部分(T)和免疫調節劑(IM)組合的藥物組合物。本發明的此方面的典型特徵是超級抗原和免疫調節劑中的至少一個以上述允許靶向待失活細胞的綴合物形式。
所討論的組合物在本領域中已知，除了現在它們含有本發明的綴合物組合。在具體的組合物中，組合可包括a.包括超級抗原(Sag)、針對靶細胞的靶向部分(T)和免疫調節劑(IM)的三體綴合物(T，IM，Sag-綴合物)；b.兩種二體綴合物一種在靶向抗體(T)與超級抗原之間而一種在靶向抗體(T』)與免疫調節劑之間(即T，Sag-綴合物+T』，IM-綴合物)。根據表位的特異性，T和T』可以是不同或相同的；c.一種超級抗原(Sag)和靶向部分(T)之間的二體綴合物以及游離形式的免疫調節劑(IM)(T，Sag-綴合物+IM)；
d.一種免疫調節劑(IM)和靶向部分(T)之間的二體綴合物以及游離形式的超級抗原(Sag)(T，IM-綴合物+Sag)；或者e.以二體綴合物形式的超級抗原(Sag)和免疫調節劑(IM)(Sag，IM綴合物)；進一步參見上述本發明方法的內容。在組合物含有兩種活性組分時(上述b-d)，組合物可允許在給藥前分開保存這些成分。
這些組合物可以是凍幹顆粒狀物質、無菌或無菌製備的溶液、片劑、安瓿等形式。可以存在賦形劑如水(優選地通過例如PBS緩衝至生理上可接受的pH值)或其它惰性固體或液體物質。一般而言通過將綴合物(可能結合非結合的活性組分)混合於、溶解於、結合到或以別的方式合併到一種或多種水溶性或水不溶性的水性或非水性賦形劑中(如果必要與適當添加劑和佐劑混合)來製備這些組合物。這些賦形劑和條件必須不能對上述a-e中定義的活性組分的活性有不利影響，這是必不可少的。
通常用於本發明的超級抗原(SAG)將以預先分裝的劑量出售和給藥，根據現在所有的結果，每劑量含有據信在1pg-50mg範圍內的有效量的SAG。確切的劑量將在不同病例間不同，取決於患者的體重和年齡以及對所用SAG特異的抗體的預滴定、給藥途徑、疾病類型、尋靶部分、超級抗原、連接(-B-)、免疫調節劑等。
決定用於本發明方法的組合的劑量的重要因素是超級抗原和免疫調節劑發揮作用的最佳劑量範圍。太低的劑量將導致無效應或低於最佳效應而太高的劑量將產生不能接受的副作用如可能致死的毒性。因此不得不強調上面給出的寬範圍試圖包括對本發明方法所有變化可能的範圍。因此，根據本發明方法所述的每個具體組合具有0.1pg-50mg範圍內的劑量子範圍。這不排除將來的開發和結果可能導致此範圍外的劑量水平。
給藥途徑將是本領域中常用的那些，即使殺死目標有效量或有治療活性量的根據本發明所述的超級抗原-免疫調節劑組合與靶細胞接觸。對於上述適用症，這最可能意味著腸道外施用如(皮下、靜脈內、動脈內、肌內、腹膜內)注射或灌注給哺乳動物如人類。本發明的綴合物組合可局部或系統給藥。
術語「殺死目標有效量」是指活化和介導T細胞破壞靶細胞時有效的量。
在優先權日，優選的給藥途徑與對於根據Dohlsten等WO9201470；Abrahmsen等WO9601650和Antonsson等PCT/97/00537所述的超級抗原綴合物所用的相同。這意味著每天1-5小時(優選地4小時)結合退熱劑(撲熱息痛)的靜脈內灌注。給藥在一些天如5-8天內重複，同時認真考慮增強針對綴合物的抗體的風險。最好進行多個治療周期，每個周期含有一天或多天時間的治療接著一天或多天時間的停止期，例如分別為5天和2天時間的治療和休息。
本發明的組合物可作為主要療法或在優選模式中作為輔助療法與手術或其它藥物結合。實驗部分圖解

圖1.用CD80-C215Fab，CD80-C215Fab-SEAm57或C215Fab-SEA染色後與PE標記的抗小鼠κ鏈mAb一起培養的CHO-CD28細胞的FACS分析。染色在4℃進行而不進行任何洗滌。縱軸平均通道。
圖2.用CD80-C215Fab，CD80-C215Fab-SEAm57或C215Fab-SEA染色後與PE標記的抗小鼠κ鏈mAb一起培養的Colo205細胞的FACS分析。染色在4℃進行並在每個染色步驟之間進行三次洗滌。縱軸平均通道。橫軸效應器(E)對靶細胞(T)的比例。
圖3.增殖將T細胞與Colo205細胞和4uM C242Fab-SEA以及不同量CD80-C215Fab一起培養4天後計數摻入的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷。無任何CD80-C215Fab時得到的活性是20039cpm+/-1750。
圖4.IL-2的製備將T細胞與Colo205細胞和4uM C242Fab-SEA以及不同量CD80-C215Fab一起培養4天後收集上清液並測定IL-2量。無任何CD80-C215Fab時得到的IL-2量是2849pg/ml。
圖5.將T細胞與Colo205細胞和不同量CD80-C215Fab-SEAm57或C215Fab-SEAm23一起培養4天後計數摻入的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷。
圖6.IL-2的製備將T細胞與Colo205細胞和不同量CD80-C215Fab-SEAm57或C215Fab-SEAm23一起培養4天後收集上清液並測定IL-2量。
圖7.與所示蛋白和照射的(irradiated)、轉染的CHO細胞(用於呈遞SEA)一起培養7天時人血T細胞的增殖能力。縱軸3H-胸腺嘧啶脫氧核苷的摻入(cpm)。
圖8.同時施用靶向的SEA和IL-2導致體內T細胞增強的活化。針對來自用C215FabSEA(FS)、C215Fab-Q-hIL2(FI)、兩個(FS+FI)的組合或C215FabSEA-Q-hIL2(FSI)的1次或3次注射處理的小鼠的脾細胞的SEA-包被的MHC II+類Raji細胞的細胞毒性(表示為百分率)。效應器靶細胞比例為30∶1，並且細胞毒性用標準的4小時51Cr釋放分析加以測定。
圖9.用C215FabSEA(FS)、C215Fab-Q-hIL2(FI)、C215FabSEA+C215Fab-Q-hIL2(FS+FI)或C215Fab-Q-hIL2(FSI)的三次注射(腫瘤接種後5、6和7天)對C57B1/6小鼠中第5天B16-C215腫瘤的治療。使用等摩爾量的FabSEA和Fab-Q-hIL2。橫軸注射蛋白的量。縱軸以百分率表示的腫瘤減少。
圖10.C215Fab-SEA(FS)、C215Fab-Q-IL2(FI)或C215Fab-Q-IL2治療後CD25+T細胞增加的腫瘤浸潤。浸潤到帶有確定的B16-GA733肺癌的小鼠肺中的CD25陽性細胞通過免疫組織化學法評估。縱軸染色面積的百分比。橫軸1＝PBS；2＝第一次注射；3＝第二次注射；4＝第三次注射；5＝第四次注射。
圖11.每日一次(37mg/注射)四次注射C215FabSEA-Q-hIL2(FSI)(37mg/天)後幹擾素γ的持續水平。最後一次注射後4小時收集血液並用重組鼠幹擾素γ(Pharmingen)作為標準通過ELISA測試測定幹擾素γ的含量(縱軸中)。相似實驗用等摩爾量(30mg/注射)的C215FabSEA(FS)進行。
圖12.針對來自用PBS或C215FabSEAD227A-Q-hIL2(＝FSm9-Il2)的1、4或6次注射處理的小鼠的脾細胞的SEA-包被的MHC II+類Raji細胞的細胞毒性(縱軸中表示為百分率)。細胞毒性用標準的4小時51Cr釋放分析加以測定。PBS用作陰性對照。
圖13.用C215FabSEAD227A(＝FSm9)或C215FabSEAD227A-Q-hIL2(＝FSm9-Il2)的8次注射處理後C57B1/6小鼠中第3天B16-C215腫瘤的治療。連續8天每天進行治療。在21天殺死動物，並且計數肺部的轉移。縱軸以百分率表示的腫瘤減少。
圖14.用C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A(＝FSm9-IL2(F42A))，C215FabSEAD227A-Q-hIL2(＝FSm9-Il2)或C215FabSEAD227A(＝FSm9-IL2)的8次注射處理後Vb3 TCR轉基因小鼠中第3天B16-C215腫瘤的治療。連續8天每天進行治療。在21天殺死動物，並且計數肺部的轉移。縱軸以百分率表示的腫瘤減少。
圖15.用C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A(F42A)，C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42KF42K(＝FSm9-Il2)或C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A/D20S(＝F42A/D20S)的8次注射處理後Vb3 TCR轉基因小鼠中第3天B16-C215腫瘤的治療。連續8天每天進行治療。在21天殺死動物，並且計數肺部的轉移。縱軸以百分率表示的腫瘤減少。實施例1 CD80-C215FAB融合蛋白用於用SAG靶向的FAB進行腫瘤治療的共刺激的生物學活性。
概述已經構建CD80-C215Fab和CD80-C215Fab-SEAm57融合蛋白從而含有人CD80的胞外結構域。融合蛋白在哺乳動物細胞中合成，並且用CHO細胞轉染子測定對CD28的結合且用Colo205細胞測試對C215抗原的結合。兩種融合蛋白結合CD28和C215抗原，後一結合與C215Fab-SEA相比下降100倍。既然CD80與L-鏈的N-末端部分連接，那麼CD80部分幹擾C215Fab結合是可能的。兩種融合蛋白共刺激SAG活化的人T細胞，表明可溶性CD80保持了其生物學功能。材料和方法重組DNA技術和酶質粒DNA製備與其它操作基本上按照Sambrook等(Sambrook等1989)進行。大腸桿菌HB101(Boyer等1969)用作宿主菌株。限制性內切核酸酶和DNA聚合酶I的Klenow片段獲自BoehringerMannheim或New England Biolabs，並且按照供應商說明使用。Taq聚合物獲自Perkin Elmer。用GeneAmp RNA PCR試劑盒(Perkin Elmer)從總RNA中製備cDNA。寡核苷酸在Gene Assembler(Pharmacia Biotech AB)或ABI 392 DNA/RNA合成儀(Applied Biosystems)上合成，並且通過反相層析在FPLC系統(Pharmacia Biotech)上加以純化。測序根據雙脫氧鏈終止原理(Sanger等1977)用Applied BiosystemsTaq染料雙脫氧終止循環測序試劑盒進行並且將產物在DNA測序儀ABI 392(AppliedBiosystems)上分離和測定。在每升含有2 X YT和15g瓊脂基質並補加70mg/L卡那黴素或100mg/L氨苄青黴素的平板上選擇帶有不同質粒的細菌。液體培養基為2X YT(每升10g酵母提取物(Difco)，16g胰蛋白腖(Difco)和5g NaCl)。
表ILAKQ5 ATA TAA GCT TCC ACC ATG GGC CAC ACA CGG AGG(SEQ ID NO 1)LAKQ7 ACG CAG ATC TTT AGT TAT CAG GAA AAT GCT CTTGC(SEQ ID NO 2)LAKQ30TCA AAG CTT CTC GAG CGC GCT GTT ATC AGG AAAATG CTC(SEQ ID NO 3)LAKQ37CGC GCG TCA GGC TAA CGA ACT GCC AGG CGC CCCGTC ACA GAG ACG A(SEQ ID NO 4)LAKQ38AGC TTC GTC TCA CGC GCG TTC TTC CTG TGA CGGGGC GCC TGG CAG TTC GTT AGC CTG ACG(SEQ ID NO 5)LAKQ88TGG TAC ACC ACA GAA GAC AGC TTG TAT GTA TG(SEQ ID NO 6)LAKQ89CAT ACA TAC AAG CTG TCT TCT GTG GTG TAC CA(SEQ ID NO 7)LAKQ90CGA ATA AGA AAG ACG TCA CTG TTC AGG AGT TGG(SEQ ID NO 8)LAKQ91CCA ACT CCT GAA CAG TGA CGT CTT TCT TAT TCG(SEO ID NO 9)LAKQ92GAG ATA ATA AAG TTA TTA ACT CAG AAA ACA TG(SEQ ID NO 10)LAKQ93CAT GTT TTC TGA GTT AAT AAC TTT ATT ATC TC(SEQ ID NO 11)LAKQ108 CGC GGA TCC GCG CGG CAC CAG GCC GCT GTT ATCCGG AAA ATG CTC TTG C(SEQ ID NO 12)LAKQ117 CCG GAT AAC AGC GCG CGT CAG CTA ACG AAC TCCAGG CGC CCC GTC ACA GGA AGAA CGC CCG CAG GTCCAA CTG CA(SEQ ID NO 13)LAKQ118 GTT GGA CCT GCG GGC GTT CTT CCT GTG ACG GGGCGC CTG GCA GTT CGT TAG CCT GAC GCG CGC TGT TAT(SEQ ID NO 14)質粒構建按照以前所述(Dohlsten等1994)構建編碼含有鼠抗體C215可變區的Fab片段的基因。以前已描述葡萄球菌腸毒素A(SEA)基因的克隆和誘變得到替換F47A和D227A(Abrahmsen等1995)。用引物LAKQ88-93(使用的所有引物列於表I中)將其它3個突變導入SEA基因中以獲得SEA突變體57。將LAKQ5和LAKQ7用於RT-PCR以在上遊導入kozak盒，並且從人脾總RNA克隆編碼信號肽和人CD80胞外部分的基因。發現核苷酸序列對應於CD80的基因庫序列(錄入號M27533)。製備在3』末端具有不同克隆位點的兩個CD80基因變體在分開的PCR中，使用引物LAKQ30和LAKQ108以分別得到BssHII或MroI位點。通過在相關CD80基因與緊接κ基因前面的DsaI位點之間插入DNA接頭LAKQ37/38 BssHII-Esp3I來構建編碼通過Q-接頭在κ鏈前融合的CD80的基因融合。通過將編碼前面為CD80信號肽的CD80-(Q-接頭)-κ的基因融合插入除了CMV啟動子和polyA尾外還含有用於轉化子選擇的新黴素基因的載體中，獲得質粒pKGE987。將CD80基因的最後版本用於構建基因融合，其中此基因位於Fd-SEA突變體57基因融合前面將編碼Q-接頭的DNA片段(LAKQ117/118)插入CD80基因中的MroI位點與C215VH基因中密碼子4和5處的PstI位點之間。將此基因融合插入第二個CMV啟動子載體中以得到質粒pMB189，從而編碼通過三個殘基間隔GGP連接在Fd和SEA突變體57後的CD80信號肽和胞外部分。在質粒pKGE961中，Fd基因插入在信號序列(源自另一鼠VH基因)之後。質粒pMB156編碼前面為其天然信號肽的天然κ鏈，並含有新黴素基因。合成用pKGE961和pKGE987或pMb156和pMB189轉染倉鼠胚腎293細胞以得到分別產生CD28-C215Fab和CD28-C215Fab-SEAm57的細胞系。為了獲得穩定細胞系，選擇培養基為補加L-穀氨醯胺(GIBCO BRL no 25030-24)、10％小牛血清和1mg/ml遺傳黴素的無苯酚紅的DMEM(Pharmacia noMS 0127)。生產培養基是補加L-穀氨醯胺和0.1％HAS(Pharmacia UpjohnAB，瑞典)的無苯酚紅的DMEM。通過在蛋白G Sepharose FF(PharmaciaBiotech AB)上親和層析，然後通過抗-CD80親和純化(固定化的抗人CD80抗體；Camfolio L307.4)或在SP Sepharose FF(Pharmacia Biotech AB)上離子交換層析從過濾(Sartobran 0.65-0.4um)的培養基純化融合蛋白。
試劑將補加2mM L-穀氨醯胺(GIBCO，Middlesex，英國)、0.01MHEPES(Biological Industries，以色列)、1mM NaHCO3(Biochrom KG，柏林，德國)、0.1mg/ml硫酸慶大黴素(Biological Industries，KibbutzBeit Haemek，以色列)、1mM丙酮酸鈉(JRH Biosciences Industries，美國)和10％加熱滅活胎牛血清(GIBCO，Middlesex，英國)的RPMII 1640培養基(GIBCO，Middlesex，英國)用作所有細胞培養的完全培養基。
抗體針對人CD57(HNK1)和CD56(HB55)的mAb獲自產生mAb的雜交瘤細胞(美國典型培養物保藏中心，Rockville，ND)。用PE標記的抗小鼠κ鏈的mAb獲自Becton Dickinson(San Jose，CA)。
細胞用Pharmacia和Upjohn，Stockholm，瑞典的編碼CD28基因的人cDNA轉染中國倉鼠卵巢(CHO)K1細胞。常規分析轉染子的CD28表達並通過FACS分選在相似抗原表達水平維持轉染子。人直腸癌細胞系Colo205獲自ATCC。所有細胞系不含支原體。
T淋巴細胞增殖分析按照以前所述(Lando等1996)通過使用CD57、HLA-DR4、CD14和CD56 mAb的負選擇淘選從外周血單核細胞(PMB)得到T細胞。所有對T細胞的測試用平底96孔板(Nunc，Roskilde，丹麥)以200μl體積用0.1×106個細胞/孔進行。按照前述(10)使培養物暴露於[3H]-胸腺嘧啶脫氧核苷[3H]TdR(0.5mCi/孔)後研究DNA合成。
流式細胞計量術分析流式細胞計量分析和分選根據標準設置在FACStarPlus流式細胞計量儀(Becton Dickinson，Mountain View，CA)上進行。由於CD80對CD28的低親和性，用CD80-C215Fab融合蛋白對CHO-CD28細胞的染色通過省略細胞洗滌來進行。
細胞因子分析用IL-2 ELISA試劑盒(huIL-2 Duoset，Genzyme)分析IL-2的產量。結果CD80-Fab融合蛋白的描述Fab部分具有鼠IgG1/k的同種型，儘管它含有IgG2A/k單克隆抗體C215的可變區(Dohlsten等1995)。三肽序列GGP在CH1結構域中形成鏈間二硫鍵的鏈內半胱氨酸之後。在CD80-C215Fab-SEAm57三體融合蛋白中，它作用為Fd和具有5個替換的葡萄球菌腸毒素A之間的間隔(SEA；Betley等1988)。導入替換F47A和D227A以降低對MHC II類的親和性(Abrahmsen等1995)，並且導入替換N102Q、N149Q和T218V以避免在真核細胞中合成時偶然的糖基化。藉助X-衍射結構選擇後面的這些替換(Soundstrom等1996)。將最終的五突變體命名為SEA突變體57。兩種融合蛋白均含有人CD80的胞外結構域(限定為末端FPDN)。使用天然CD80信號肽，並且正如通過純化CD80-C215Fab的胺基酸測序測定的，發現成熟蛋白起始VIHV。18個胺基酸的間隔連接CD80與CD80-C215Fab中的κ鏈或CD80-C215Fab-SEAm57三體融合蛋白中的Fab片段的Fd部分。這些間隔象Q-接頭(Wooton等1996)並分別具有序列SARQANELPGAPSQEERA(SEQ ID NO 15)和SARQANELPGAPSQEERP(SEQ ID NO 16)。Facs分析CD80-C215Fab融合蛋白與CD28陽性細胞和C215陽性細胞的結合CD28陽性細胞CHO-CD28細胞用CD80-C215Fab，CD80-C215Fab-SEAm57或C215Fab-SEA染色後與PE標記的抗小鼠κ鏈mAb一起培養。染色在4℃進行而不進行任何洗滌。
CD80-C215Fab和三體融合蛋白以劑量依賴型方式與CHO細胞上表達的CD28結合。正如所預期的，用對照融合蛋白C215Fab-SEA未觀察到染色。
CD215陽性細胞融合蛋白對C215抗原的結合針對Colo205細胞來評估。Colo205細胞用CD80-C215Fab，CD80-C215Fab-SEAm57或C215Fab-SEA染色後與PE標記的抗小鼠κ鏈mAb一起培養。染色在4℃進行並在每個染色步驟之間進行三次洗滌。
結果(圖1-2)CD80-C215Fab和CD80-C215Fab-SEAm57均以劑量依賴型方式結合C215抗原陽性的Colo205細胞。此結合比C215Fab-SEA低50-100倍。這表明CD80在融合蛋白N-末端部分的導入可能干擾C215Fab部分與C215抗原的結合。二體融合超級抗原活化的T細胞的共刺激。
為了測定融合蛋白的生物學活性，對它們進行超級抗原活化的T細胞的共刺激測試。
增殖將T細胞與Colo205細胞和4uM C242Fab-SEA以及不同量CD80-C215Fab一起培養4天後計數摻入的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷以測定增殖。無任何CD80-C215Fab時得到的活性是20039cpm+/-1750。
IL-2的製備將T細胞與Colo205細胞和4uM C242Fab-SEA以及不同量CD80-C215Fab一起培養4天後收集上清液並測定IL-2量。無任何CD80-C215Fab時得到的IL-2量是2849pg/ml。
結果(圖3-4)正如在增殖和IL-2合成時觀察到的，CD80-C215Fab以劑量依賴型方式共刺激C215Fab-SEA誘導的T細胞活化。三體融合超級抗原活化的T細胞的共刺激。
為了測試三體融合蛋白的生物學活性，將純化的T細胞與Colo205細胞上呈遞的C215Fab-SEAm23(m23是用於三體融合蛋白影響MHC II類結合的相同突變體，即Phe47Ala/Asp227Ala)或CD80-C215Fab-SEAm57一起培養。增殖4天後計數摻入的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷。IL-2的製備4天後收集上清液並測定IL-2量。
結果(圖5-6)當呈遞於Colo205細胞上時，三體融合蛋白誘導T細胞活化和IL-2合成。用C215Fab-SEAm23時未見到這樣的活性，表明CD80共刺激對活化的重要性。由於三體融合蛋白更低的結合親和性(比C215Fab-SEA低50-100倍，參見FACS數據)，實際與細胞結合的C215Fab-SEAm23的量很可能實際上比三體融合蛋白更高。實施例2靶向的IL-2增強和延長了FabSEA對T細胞活化和腫瘤治療中的作用材料與方法IL-表達質粒的構建用從已用超級抗原SEA刺激24小時的人外周血單核細胞(PMB)分離的mRNA通過RT-PCR克隆IL-2 cDNA。用Dynal，Oslo的mRNA Direct試劑盒根據製造商說明從5×106個細胞分離mRNA。通過加熱到95℃洗脫退火到oligo(dT)26-包被的磁珠上的mRNA。隨後利用RT和Taq聚合酶的DNA聚合酶活性通過RT-PCR得到PCR產物。將洗脫的mRNA的1/10與PCR引物IL2-1和IL2-2混合併進行標準PCR反應(30個循環)。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，從凝膠中切下此條帶並用Prep-a-gene試劑盒(Bio-Rad)加以純化。用EcoRI和BamHI酶切後將片段克隆入EcoRI/BamHI酶切的pBluescript KS II中。對插入進行測序並且證實與以前報導的IL-2 cDNA(Taniguchi等1983)一致。然而，作為PCR反應，DNA片段編碼Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Asn-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg-(SEQ ID NO23)，「Gly-Pro-Q-接頭」已加到編碼成熟人IL-2片段的5』。將Q-hIL2作為RsrII-NheI片段克隆入來自保藏中心的質粒(用RsrII-XbaI切割)中。得到的質粒pMS306介導C215FabSEA-Q-hIL2分泌到大腸桿菌的外周質中。按如下進一步優化這些部分間的接頭。用定點誘變將編碼Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO19)的接頭編碼區(替代原來的Gly-Gly-Pro)導入超級抗原與Fab部分的編碼區之間。相似地，用接頭Gly-Pro-Arg-Gln-Ser-Asn-Glu-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg(SEQ ID NO20)、Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Thr-Thr-Arg(SEQ ID NO21)和Gly-Pro-Thr-Glu-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Glu-Glu-Glu-Thr(SEQ IDNO22)。替代IL-2與Fab部分之間原來的Q-接頭。對於二體融合蛋白組合，也分別比較IL-2與重鏈或輕鏈融合的構建體。
引物IL2-15′-GCG GAT CCC GGT CCG CGT CAG GCT AAC GAA CTG CCAGGA GCT CCG TCT CAG GAA GAG CGT GCA CCT AC TTCAAG TTC TAC AAA G-3′(SEQ ID NO 17)IL2-25′-CCG AAT TCG CTA GCT TAT CAA GTT AGT GTT GAG ATGAT-3′(SEQ ID NO 18)融合蛋白在發酵罐中的表達用帶有卡那黴素抗性基因和lacUV5啟動子的質粒在大腸桿菌菌株UL 635(xyl-7，ara-14，T4R，deltaompT)中表達融合蛋白。將來自冷凍原種的細菌於25℃在搖瓶中培養約21小時，搖瓶中含有(g/l)(NH4)2SO4，2.5；KH2PO4，4.45；K2HPO4，11.85；檸檬酸鈉，0.5；MgSO4·7H2O，1；葡萄糖一水化物，11；0.11mM卡那黴素和1ml/l微量元素溶液(Forsberg等，1989)，但是不含Na2MoO4·2H2O。將細胞培養至OD6001-2並且使用450ml培養物培養基接種發酵罐(Chemap，瑞士)至終體積5升。發酵罐培養基含有(g/l)(NH4)2SO4，2.5；KH2PO4，9；K2NPO4，6；檸檬酸鈉，0.5；葡萄糖一水化物，22；MgSO4·7H2O，1；0.11mM卡那黴素；1ml adecanol(Asahi Denka Kogyo K.K，日本)和1ml/l微量元素溶液。通過用25％氨水滴定將pH保持在7.0，溫度為25℃並且以5l/分鐘用大氣通氣。通過在間歇期將攪拌從300增加到1000rpm並且在進料間歇期調節60％(w/v)葡萄糖進料而將溶解的O2分壓控制在30％。通過加入0.1mM異丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷IPTG在OD60050時誘導產物形成。發酵後，通過在4℃以8000xg離心去除細胞。澄清的培養基或者直接分析和純化或者於-20℃保存。
融合蛋白的純化通過在30分鐘內用0.19％聚乙烯亞胺和0.2M NaCl沉澱來去除澄清培養基中存在的DNA(Atkinson和Jack，1973)。如上所述離心後，收集上清液並且將NaCl濃度調節到0.5M。將此溶液上樣到以含有0.05％ Tween 80的10mM磷酸鈉、150m NaCl(PBST』pH7.4)平衡的蛋白G Sepharose柱(Pharmacia Biotech AB，Uppsala，瑞典)上。然後用5倍柱體積的PBST洗柱並用pH3.2的0.1M乙酸、0.02％ Tween 80洗脫結合的蛋白。用pH8.0的1M Tris-HCl將樣品pH調節至5.0並上樣到以50mM乙酸胺、0.02％ Tween 80平衡的SP Sepharose HP柱(Pharmacia Biotech)上。然後用2倍柱體積的平衡緩衝液洗柱並用超過10倍柱體積的50到500mM的乙酸胺梯度洗脫融合蛋白。對於C215Fab-IL2融合蛋白，使用6.0的pH而對於C215Fab-SEA-IL2三體融合蛋白，在分離過程中pH為5.7。將融合蛋白通過0.22um濾膜過濾並保存於-70℃。如果稀釋度太大，就用Centricon(Amicon)根據製造商說明將洗脫物濃縮至0.5-1mg/ml。
細胞毒性分析按照前述(Dohlstein等1990)進行MHC II類依賴型和非依賴型細胞毒性分析。簡言之，對於MHC II類依賴型分析，將51Cr-標記的Raji細胞(每孔200μl終體積內2500個細胞)與通過在低水平重組hIL-2存在的情況下培養人PBM而產生的SEA依賴型效應細胞系混合。效應細胞∶靶細胞比例是30∶1。對於MHC II類非依賴型分析，將51Cr-標記的C215+colo細胞(2500)與SEA依賴型效應細胞以45∶1的E∶T比例一起培養。培養4小時後通過閃爍計數測定釋放到培養基中的51Cr。
對純化人T細胞的體外共刺激分析基本上按照Lando等(1993)所述純化天然的人T細胞。簡言之，通過Ficoll梯度離心，然後通過明膠柱分離，並且最後通過在含有HNK1和HLA-DR mAB的培養皿上淘選的負選擇從人血PBM純化天然的人T細胞。基本上按照Lando等(1996)所述的用天然的人T細胞進行增殖分析。簡言之，將天然的人T細胞(每孔100,000個細胞)在含有添加劑的200μl總體積RPMI-1640中與照射的CHO轉染子(每孔10,000個細胞)混合(Lando等1993)。對於含有IL-2的融合蛋白的實驗，將細胞在1nM所示物質存在的情況下培養7天。在實驗的最後一天，用3H-胸腺嘧啶脫氧核苷對細胞進行脈衝標記以測定向分裂細胞DNA中的摻入。
B16-C25腫瘤的治療基本上按照前述的(Dohlsten等1994；Hansson等1997)進行治療。在0天將75000-150000個同系B16-F10黑素瘤細胞靜脈注射入C57B1/6小鼠尾靜脈內。這些B16細胞表達由C215 mAb識別的人GA-733抗原。在21天時終止實驗，此時取出肺並且計數擴散的肺部腫瘤。
免疫組織化學基本上按照前述的(Dohlsten等1995)在帶有18天B16-C25腫瘤的動物肺上進行。最後一次注射後4小時提取樣品。人工測定染色的區域。
免疫藥理學基本上按照前述的(Rosendahl等1996)進行。最後一次注射後48小時從已每日一次接受1或3次注射的C57 B1/6小鼠取出脾臟並在前述的標準51Cr分析中用Raji細胞作為靶細胞測定SEA依賴型細胞毒性。E∶T比例為100∶1。結果和討論含有IL2的融合蛋白的合成和純化編碼C215FabSEA-Q-hIL2三體融合蛋白的大腸桿菌表達載體得到構建。此載體編碼位於從LacUV5啟動子轉錄的雙順反子mRNA上的三體融合蛋白的兩個亞單位。這兩個亞單位中的每一個前面是指導其轉送到大腸桿菌周質間隙的信號肽。第一個亞單位是C215Fab的VH，其後是Gly-Gly-Pro-接頭(VH-CHl-Gly-Gly-Pro-SEA)。另一個亞單位是C215Fab的VK，其後是通過Gly-Pro-Q-接頭與人IL2連接的C242Fab的CK(Vk-Ck-Gly-Pro-Q-hIL2)。Gly-Pro-Q-接頭序列(SEQ ID NO23)是OmpR大腸桿菌蛋白(Wotton等1989)中發現的天然接頭的略微修飾的版本。更完整的信息參見材料和方法。也製備了C215Fab-Q-hIL2融合蛋白。除了去除了蛋白的Gly-Gly-Pro-SEA部分之外，它與C215FabSEA-Q-hIL2相同。因此表達載體中相應的DNA序列缺失。用標準方法通過PCR介導的定點誘變產生C215FabSEA-Q-hIL2的突變衍生物以合成大量蛋白如C215FabSEAD227A-Q-hIL2和C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A。在三體融合蛋白的後一變體中，亞單位間的半胱氨酸用兩個絲氨酸殘基替換。
將編碼含有IL2的蛋白的質粒轉化入大腸桿菌生產菌株UL635中，並且然後進行發酵。用蛋白G親和層析從培養基中純化融合蛋白。用離子交換層析去除融合蛋白的降解變體。如通過SDS-PAGE(材料和方法)測定的，獲得的產物是至少90％全長的融合蛋白。用融合蛋白的最佳設計，在培養基中獲高達130mg/ml的融合蛋白並且一般從1升培養基中獲得70mg三體融合蛋白。
含有IL2的Fab融合蛋白的功能鑑定含有IL2的融合蛋白如C215FabSEA-Q-hIL2和C215Fab-Q-hIL2融合蛋白誘導IL-2依賴型鼠細胞系CTLL-2增殖的能力在摩爾基礎上基本上與重組人IL2類似(數據未顯示)。此外，發現C215FabSEA-Q-hIL2和C215FabSEA的抗原結合能力和SEA活性在眾多分析中是難以區分的，表明將IL2導入分子沒有不利影響。這些分析包括在4小時51Cr釋放分析中SEA反應性T細胞效應細胞系誘導MHC II類非依賴型殺死C215+人結腸癌細胞系colo205的能力。同樣SEA反應性效應T細胞的MHC II類依賴型殺死MHC II類+Raji(大鼠淋巴瘤)細胞以相似效率進行(數據未顯示)。通過FSCS分析到更直接的未損傷C215抗原和MHC II類結合的證據。發現C215FabSEA和C215FabSEA-Q-hIL2與Raji細胞結合的劑量依賴型在摩爾基礎上相似(數據未顯示)。同樣，發現C215FabSEA-Q-hIL2和C215Fab-Q-hIL2與colo205細胞的劑量依賴型結合與對C215FabSEA觀察到的相似(數據未顯示)，表明在含有IL2的融合蛋白中抗原結合沒有受到損傷。
FabSEA誘導的IL2依賴型增殖靜止人T細胞需要信號1和信號2激發最佳T細胞增殖和活化(Schwartz，1990)。如果呈遞到細胞上，超級抗原可傳遞信號1。預期作為B7/CD28信號轉導主要下遊效應器的IL-2產生信號2。
在此我們使用從人血純化的靜止T細胞表明C215FabSEA-Q-hIL2三體融合蛋白或C215FabSEA聯合C215Fab-Q-hIL2或重組人IL-2的確在體外誘導T細胞增殖(圖7)。
將靜止人T細胞在IL2(以C215Fab-Q-hIL2、C215FabSEA-Q-hIL2或重組人IL-2的形式)存在的情況下與靶向的SEA(C215FabSEA或C215FabSEA-Q-hIL2)一起培養。將SEA呈遞於用C251抗原(通過Fab部分)、結合SEA的MHC II類/Dr轉染的照射的CHO細胞上。未轉染的CHO細胞用作對照。T細胞與CH0轉染子和目的物質一起培養7天後通過3H-胸腺嘧啶脫氧核苷向DNA中的摻入測定增殖。
當呈遞於用Fab所針對的人C251抗原(CHO-C215)轉染的CHO細胞上時，C215FabSEA-Q-hIL2誘導人T細胞的增殖(圖7)。同樣，當將蛋白呈遞於CHO-Dr(人MHC II類)上時也誘導增殖，而在未轉染的CHO細胞(CHO)存在時或無CHO細胞(R10)存在時未觀察到增殖。當呈遞於CHO細胞上時C215FabSEA或C215Fab-Q-hIL2本身不誘導任何明顯的增殖，表明SEA和IL2二者對增殖的誘導的確是必須的。因為C215FabSEA和C215Fab-Q-hIL2或C215FabSEA和重組人IL2的組合誘導與C215FabSEA-Q-hIL2誘導的數量上相似的效應，這一點得到證實。這也表明在此分析中IL2是必須的，但是與SEA不同，它不需要不是細胞結合的。
C215FabSEA-Q-hIL2以及C215FabSEA和C215Fab-Q-hIL2的組合導致體內增強和持續的T細胞活化和改善的腫瘤浸潤正如通過誘導SEA依賴型殺死靶細胞的能力測定的，C215Fab-Q-hIL2+C215FabSEA和C215FabSEA-Q-hIL2均是比C215FabSEA更有力的T細胞活化誘導劑。簡言之，小鼠每日施用所示蛋白，共接受1或3次注射。最後一次注射2天後，從處理的小鼠取出脾並在標準4小時51Cr釋放分析中測定對SEA包被的Raji細胞的細胞毒性活性。
C215FabSEA-Q-hIL2和C215FabSEA/C215Fab-Q-hIL2不僅誘導增強的而且誘導持續的T細胞活化。在第四次注射C215FabSEA後徹底浸入的血清細胞因子如INFγ的水平即使在第四次注射C215FabSEA-Q-hIL2後仍維持在很高水平(數據未顯示)。一般地，INFγ和INFα的水平比C215FabSEA的情況高得多(高達10倍)。
用C215FabSEA和C215Fab-Q-hIL2聯合處理對確定的B16-C215腫瘤的改進治療在鼠B16黑素瘤模型中研究IL2增強FabSag腫瘤治療的效應(圖9)。在所示實施例中，在0天用150,000個轉染了C215 mAb所針對的人腫瘤抗原GA-733的B16細胞(下面的B16-C215)接種8-12周齡的C57 B1/6雌性小鼠。所示物質在5、6和7天注射。每個數據點相當於7隻動物。在第21天殺死動物，並且計數有黑色素形成的B16腫瘤建群的肺。與未處理的對照相比，在多個實驗中顯示C215FabSEA和C215Fab-Q-hIL2的組合比C215FabSEA誘導更好的治療(圖9)。在所示的實驗中，C215FabSEA和C215Fab-Q-hIL2的組合治療比C215FabSEA-Q-hIL2三體融合蛋白給出更好的治療效果。
隨後的免疫組織化學研究揭示只有C215FabSEA或C215FabSEA和C215Fab-Q-hIL2的組合得到相似數目的B16-C215腫瘤浸潤的CD4和CD8T細胞。然而，有趣的是CD25(IL2Ra)陽性細胞的數目(T細胞活化的良好標記)在第三和第四次注射C215FabSEA/C215Fab-Q-hIL2之間顯著增加(圖10)。相反，在C215FabSEA情況下則減少，表明開始無反應力。因此在組合治療時浸潤T細胞的質量看來比只有C215FabSEA時更高，這可能有助於解釋改善的治療效應。同樣，第四次注射FabSEA後T細胞活化之後產生的血清細胞因子如幹擾素γ顯著下降(圖11)。然而，用FabSEA-Q-hIL2三體融合蛋白，即使在第四次注射後幹擾素仍維持在高水平。此觀察結果提供了另外的提示，即在構建體中包含IL2可阻礙FabSEA誘導的T細胞無反應狀態。
用C215FabSEAD227A-Q-hIL2對B16-C215腫瘤的改進治療超級抗原在人類中比小鼠中的毒性更大，部分因為在人類中對MHC II類的親和性高得多(Hansson等1997)。因此預期FabSEA蛋白的系統毒性是用於人類治療的主要限制因素。與系統免疫活化(SEA-MHC II類依賴型)相對增加腫瘤中局部活化(Fab依賴型)的一種方法將是增加SEA對MHC II類的親和性。根據SEA的晶體結構，我們製備了對MHC II類的親和性減小100倍的C215FabSEA的突變體C215FabSEAD227A。與野生型C215Fab-SEA不同，它不具有結合MHC II類分子的能力，這種能力據信是SEA-介導系統毒性的主要原因(Hansson等1997)。
在治療Vb3 TCR轉基因小鼠中的第一天B16-C215腫瘤時，有效治療與毒性之間的窗口對於C215FabSEAD227A突變體要比C215FabSEA寬至少50倍(Hansson等1997)。根據此發現，免疫組織化學法揭示在導致相似治療的兩種蛋白劑量時，觀察到腫瘤中相似的免疫活化，而在含有C215FabSEAD227A的脾臟中觀察到小得多的系統免疫活化(Hansson等1997)。此外，在兔子中的藥物動力學研究中揭示與C215FabSEA相比，C215FabSEAD227A向大多數MHC II類+細胞定位的脾和其它淋巴器官的靶向顯著下降(數據未顯示)。
為了臨床使用，預期Fab-SEA-IL2三體融合蛋白含有突變的超級抗原。因此我們製備了C215FabSEAD227A-Q-hIL2三體融合蛋白。製備的蛋白能誘導靜止人類T細胞的增殖(數據未顯示)，並且在小鼠中誘導高達6次注射的持續的SEA依賴型CTL活性(圖12)。相反，用C215FabSEAD227A(＜10％-數據未顯示)和C215Fab-Q-hIL2(＜15％-數據未顯示)觀察到背景CTL活性。用每日施用的此蛋白的8次注射在正常C57B/6小鼠中對確定的(第三天)B16-GA733腫瘤的治療得到與最佳劑量C215FabSEA同樣好的治療(圖13)。在此系統中，設計為人而不是小鼠中最佳活性的C215FabSEAD227A的確僅具有較小的效應(圖13)。然而，在最高劑量時，發現C215FabSED227A-Q-hIL2的部分毒性。相反，多個治療實驗表明與只有C215FabSEAD227A相比，C215FabSEAD227A和C215Fab-Q-hIL2的組合(8次注射)的確也導致Vb3 TCR轉基因小鼠中第3天B16-GA733腫瘤治療的實質改善(數據未顯示)。在Vb3 TCR轉基因小鼠中，＞90％的T細胞與SEA反應，與正常小鼠中的10-20％不同。有趣的是，反覆注射(高達8次)C215FabSEAD227A-Q-hIL2(以20μg/kg反覆注射後0/4隻兔子死亡)的兔中沒有表現比無IL-2的C215FabSEAD227A(以20μg/kg反覆注射後0/4隻兔子死亡；以20μg/kg時4/4死亡)更高的毒性以及比C215FabSEA(以1μg/kg反覆注射後1/4隻兔子死亡)低得多的毒性。同時，只有在用C215FabSEAD227A-Q-hIL2才觀察到而用C215FabSEAD227A或C215FabSEA沒有觀察到持續的免疫活化(淋巴細胞反彈效應)，表明IL-2的包含的確有助於阻礙FabSEA誘導的T細胞無反應狀態(數據未顯示)。
用IL-2突變的C215FabSEAD227A-Q-hIL2蛋白治療B16-C215腫瘤含有IL2的三體融合蛋白的更高毒性和以C215FabSEA-Q-hIL2為例更低的治療效應可能部分是由於SEA活性「反覆靶向」到淋巴樣組織。這種反覆靶向效應是由於IL2對其受體的高親和性(Kd＝10pM)，這主要見於脾臟和其它淋巴樣組織中的T細胞。為了說明此問題，我們已製備了C215FabSEAD227A-Q-hIL2的衍生物，其中IL-2部分經突變以降低對IL2R+細胞的親和性並因而減少系統活化。原則上使用相同方法增大C215FabSEAD227A蛋白的治療窗口。
IL-2與其高親和性受體之間的相互作用已得到非常充分的研究。受體由三個亞單位a，b和g組成。B和g的結合對生物學活性是必須的，而亞單位a對最佳結合是必須的。我們的策略是按照需要通過去除亞單位a的結合，並且隨後降低但不排除亞單位b和g的結合來降低IL-2與其高親和性受體之間的親和性。
設計C215FabSEAD227A-Q-hIL2的三個這樣的突變體以去除IL2Ra結合(F42A，F42K)並且另外影響IL2Rb結合(F42A/D20S)。這些蛋白在誘導IL-2依賴型鼠細胞系CTLL-2的增殖時分別具有100(F42A)、1000(F42K)和3000倍(F42A/D20S)降低的活性。進行實驗以更詳細地測定這些蛋白，特別是關於結合活化人T細胞和IL2受體的親和性和比例的特性。起初的治療實驗表明這樣的策略是有希望的(圖14，圖15)。在所示的實施例中，對攜帶3天B16-GA733腫瘤的Vb3 TCR轉基因小鼠進行8次注射(其中SEA活化＞90％的T細胞)。雖然在最高劑量仍觀察到一些毒性，但是使用C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A或C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42K(8次注射)而不是C215FabSEAD227A-Q-hIL2(6次注射)時毒性變得更晚，並且在最高劑量的治療與PBS處理的對照相比導致多於90％的腫瘤減小(圖14)。目前我們正通過將其它突變導入SEA和IL2部分中來探索此高度有前途的方法以進一步改進對毒性窗口的治療。
此外，製備在IL-2部分中包含Thr51Pro突變的C215FabSEA-Q-hIL2三體融合蛋白(Chang等1996)的工作正在進行中。此突變可用於阻斷IL2R介導的融合蛋白的內化而不降低IL-2的生物學活性。這很可能是重要的，因為它將減少通過此途徑對融合蛋白的去除，並因此增加藥物的局部濃度和效力。Thr51Pro突變的蛋白可在SEA和IL-2中含有進一步的突變以分別降低對MHC II類和IL2受體的親和性。實施例3 證實(Sag，IM)-綴合物效應的實驗。靶細胞IM-受體陽性或MHCII類陽性細胞。
Sag-IM分子可與表達MHC II類的細胞結合，從而此促進SDCC。選擇性地，可以靶向表達IM受體的細胞。因此有可能Sag-IM分子可用於誘導殺死不利的表達IM受體的細胞。
在效應細胞和靶細胞均不表達C215Fab所識別的抗原時，C215FabSEA-hIL2三體融合蛋白可看作是Sag-IM分子。效應細胞將是正確Vβ亞型的T細胞。靶細胞可能例如是表達IL2受體如那些存在於某些白血病或淋巴瘤細胞上的受體的異常造血細胞。
實驗A概念的體外證據效應T細胞(反覆以SEA刺激的人T細胞)和靶細胞(例如人「Raji」B細胞淋巴瘤細胞)將與經突變而降低與MHC I類結合的C215FabSEA-hIL2三體融合蛋白一起培養。這是SDCC分析的標準設置(效應T細胞，Raji細胞，實驗物質)。我們實際上已發現具有嚴重下降的對MHC II類的親和性的C215FabSEAD227A-Q-hIL2蛋白在殺死Raji細胞方面具有比C215FabSEAD227A高約10倍的效力。對於增加的效力的明顯解釋是三體融合蛋白呈遞到Raji細胞上表達的IL2受體上。
實驗B概念的體內證據鼠淋巴瘤模型(如C57 B1/6小鼠中的RBL-5淋巴瘤)已很好地得到建立(Hoglund等，實驗醫學雜誌168，1469-1474)。在這樣的模型中用Sag-IM蛋白靶向IL-2受體或其它IM-R可提供體內靶向IM-受體陽性細胞的概念的證據。
Sag-IM靶向IM-R陽性細胞由於效應細胞和靶細胞均頻繁表達IM受體的事實而變得複雜化。不過，在有些情況下這種治療方式可能有效。諸如靶細胞上IM-R表達的密度、靶細胞的數目和位置等的因素很可能起作用。同時應該強調例如IL2Rα在T細胞活化時僅受到正調節-因此在IM-R在靶細胞上而不是在效應細胞上以高豐度表達時可能是暫時窗口。
可相似地使用SAG-IM融合蛋白，其中Sag代表經突變而具有降低的對MHC II類的親和性的野生型超級抗原。參考文獻*-標記的文章可能發現比其它文章與免疫調節劑更相關。
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序列表(1)基本信息(i)申請人(A)名稱ParmaciaUpjohn AB(B)街道Lindhagensgatan(C)城市Stockholm(E)國家Sweden(F)郵政編號(Zip)S-11287(G)電話+46 8 695 80 00(ii)發明名稱靶細胞的定向細胞溶解、引起細胞溶解的試劑和組合物以及能用於製備這些試劑的化合物(iii)序列數23(iv)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release #1.0，版本#1.30(EPO)(2)關於SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「寡核苷酸DNA引物」(xi)序列描述SEQ ID NO1ATATAAGCTT CCACCATGGG CCACACACGG AGG33(2)關於SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度35個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「寡核苷酸DNA引物」(xi)序列描述SEQ ID NO2ACGCAGATCT TTAGTTATCA GGAAAATGCT CTTGC 35(2)關於SEQ ID NO3的信息(i)序列特徵(A)長度39個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「寡核苷酸DNA引物」(xi)序列描述SEQ ID NO3TCAAAGCTTC TCGAGCGCGC TGTTATCAGG AAAATGCTC 39(2)關於SEQ ID NO4的信息(i)序列特徵(A)長度46個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型其它核酸
(A)描述/desc＝「寡核苷酸DNA引物」(xi)序列描述SEQ ID NO4CGCGCGTCAG GCTAACGAAC TGCCAGGCGC CCCGTCACAG AGACGA 46(2)關於SEQ ID NO5的信息(i)序列特徵(A)長度60個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「寡核苷酸DNA引物」(xi)序列描述SEQ ID NO5AGCTTCGTCT CACGCGCGTT CTTCCTGTGA CGGGGCGCCT GGCAGTTCGT TAGCCTGACG 60(2)關於SEQ ID NO6的信息(i)序列特徵(A)長度32個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「寡核苷酸DNA引物」(xi)序列描述SEQ ID NO6TGGTACACCA CAGAAGACAG CTTGTATGTA TG32(2)關於SEQ ID NO7的信息(i)序列特徵(A)長度32個鹼基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「寡核苷酸DNA引物」(xi)序列描述SEQ ID NO7CATACATACA AGCTGTCTTC TGTGGTGTAC CA 32(2)關於SEQ ID NO8的信息(i)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「寡核苷酸DNA引物」(xi)序列描述SEQ ID NO8CGAATAAGAA AGACGTCACT GTTCAGGAGT TGG 33(2)關於SEQ ID NO9的信息(i)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「寡核苷酸DNA引物」(xi)序列描述SEQ ID NO9CCAACTCCTG AACAGTGACG TCTTTCTTAT TCG 33(2)關於SEQ ID NO10的信息(i)序列特徵(A)長度32個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「寡核苷酸DNA引物」(xi)序列描述SEQ ID NO10GAGATAATAA AGTTATTAAC TCAGAAAACA TG 32(2)關於SEQ ID NO11的信息(i)序列特徵(A)長度32個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「寡核苷酸DNA引物」(xi)序列描述SEQ ID NO11CATGTTTTCT GAGTTAATAA CTTTATTATC TC 32(2)關於SEQ ID NO12的信息(i)序列特徵(A)長度49個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型其它核酸
(A)描述/desc＝「寡核苷酸DNA引物」(xi)序列描述SEQ ID NO12CGCGGATCCG CGCGGCACCA GGCCGCTGTT ATCCGGAAAA TGCTCTTGC 49(2)關於SEQ ID NO13的信息(i)序列特徵(A)長度77個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「寡核苷酸DNA引物」(xi)序列描述SEQ ID NO13CCGGATAACA GCGCGCGTCA GGCTAACGAA CTCCCAGGCG CCCCGTCACA GGAAGAACGC 60CCGCAGGTCC AACTGCA 77(2)關於SEQ ID NO14的信息(i)序列特徵(A)長度69個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「寡核苷酸DNA引物」(xi)序列描述SEQ ID NO14GTTGGACCTG CGGGCGTTCT TCCTGTGACG GGGCGCCTGG CAGTTCGTTA GCCTGACGCG 60CGCTGTTAT 69(2)關於SEQ ID NO15的信息(i)序列特徵(A)長度18個胺基酸
(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO15Ser Ala Arg Gln Ala Asn Glu Leu Pro Gly Ala Pro Ser Gln Glu Glu1 5 10 15Arg Ala(2)關於SEQ ID NO16的信息(i)序列特徵(A)長度18個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO16Ser Ala Arg Gln Ala Asn Glu Leu Pro Gly Ala Pro Ser Gln Glu Glu1 5 10 15Arg Pro(2)關於SEQ ID NO17的信息(i)序列特徵(A)長度84個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「寡核苷酸DNA引物」(xi)序列描述SEQ ID NO17GCGGATCCCG GTCCGCGTCA GGCTAACGAA CTGCCAGGAG CTCCGTCTCA GGAAGAGCGT 60GCACCTACTT CAAGTTCTAC AAAG 84(2)關於SEQ ID NO18的信息(i)序列特徵(A)長度38個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「寡核苷酸DNA引物」(xi)序列描述SEQ ID NO18CCGAATTCGC TAGCTTATCA AGTTAGTGTT GAGATGAT 38(2)關於SEQ ID NO19的信息(i)序列特徵(A)長度11個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO19Pro Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Pro1 5 10(2)關於SEQ ID NO20的信息(i)序列特徵(A)長度17個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型
(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO20Gly Pro Arg Gln Ser Asn Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ser Gln Glu Glu1 5 10 15Arg(2)關於SEQ ID NO21的信息(i)序列特徵(A)長度17個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO21Gly Pro Arg Gln Ala Lys Thr Leu Pro Gly Ala Pro Ser Gln Thr Thr1 5 10 15Arg(2)關於SEQ ID NO22的信息(i)序列特徵(A)長度17個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO22Gly Pro Thr Glu Ala Asp Glu Leu Pro Gly Ala Pro Ser Glu Glu Glu1 5 10 15Thr(2)關於SEQ ID NO23的信息(i)序列特徵
(A)長度17個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO23Gly Pro Arg Gln Ala Asn Glu Leu Pro Gly Ala Pro Ser Gln Glu Glu1 5 10 15Arg
權利要求
1.一種通過在免疫調節劑存在的情況下使兩種類型的細胞與超級抗原(SAG)接觸從而在T細胞存在的情況下使靶細胞失活的方法，其特徵在於超級抗原和免疫調節劑中至少一種以「游離」超級抗原(Sag)和將綴合物靶向靶細胞的部分之間的綴合物形式存在。
2.權利要求1的方法，其特徵在於a.超級抗原(SAG)和免疫調節劑以包含超級抗原(Sag)、針對靶細胞的靶向部分(T)和免疫調節劑(IM)的三體綴合物形式(T，IM，Sag-綴合物)使用；b.超級抗原(SAG)以超級抗原(Sag)和針對靶細胞的靶向部分(T)之間的二體綴合物結合免疫調節劑(IM)和針對靶細胞的靶向部分(T』)之間的二體綴合物的形式(T，Sag-綴合物+T』，IM-綴合物)使用；c.超級抗原(SAG)以超級抗原(Sag)和針對靶細胞的靶向部分(T)之間的二體綴合物形式使用並且免疫調節劑(IM)以游離形式，即未與針對靶細胞的靶向部分結合的形式(T，Sag-綴合物+IM)使用；d.超級抗原(SAG)以自由形式(Sag)使用並且免疫調節劑以綴合物形式，即免疫調節劑(IM)與超級抗原(Sag)之間的二體綴合物形式(Sag+T，IM-綴合物)使用；以及e.超級抗原(SAG)與免疫調節劑以超級抗原(Sag)與免疫調節劑(IM)之間的二體綴合物形式(Sag，IM-綴合物)使用。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於使用選擇性的a。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於使用選擇性的b，同時具有免疫調節劑綴合物中的靶向部分可能與超級抗原綴合物中的靶向部分不同的可能性。
5.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於使用選擇性的c。
6.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於使用選擇性的e並且其中IM和T是常見的，例如細胞因子受體、例如靶向帶有受體的綴合物細胞的IL-2。
7.權利要求1-6中任意一項的方法，其特徵在於在患有與靶細胞有關的疾病如癌症的個體中體內使細胞失活。
8.權利要求1-7中任意一項的方法，其特徵在於靶向部分是抗體，優選地其抗原結合片段如Fab或Fab2-片段或單鏈抗體。
9.權利要求1-8中任意一項的方法，其特徵在於超級抗原Sag例如通過突變而修飾成a.與相應的野生型超級抗原相比，具有降低的與MHC II類抗原結合的能力；b.與相應的野生型超級抗原相比，在人血清中具有降低的血清反應性；c.與相應的野生型超級抗原相比，在人類中具有降低的免疫原性；d.是兩種或多種游離超級抗原之間的嵌合體。
10.權利要求1-9中任意一項的方法，其特徵在於超級抗原例如通過在編碼對於MHC II類親和性重要的胺基酸殘基的密碼子中的突變而修飾成具有降低的MHC II類親和性。
11.根據權利要求1-10中任意一項所述的方法，其特徵在於免疫調節劑選自a.細胞因子如IL-2，或b.趨化因子，或c.結合淋巴細胞表面的受體和配體的胞外部分，例如B7分子的胞外部分如CD80和CD86。
12.權利要求1-11中任意一項的方法，其特徵在於免疫調節劑選自能夠例如通過阻礙超級抗原活化的T-細胞轉變成無反應狀態而在體內增強超級抗原效應的免疫調節劑。
13.權利要求1-11中任意一項的方法，其特徵在於免疫調節劑是B7配體的胞外部分如CD80和CD86或CD28/B7信號轉導的下遊效應器如IL-2。
14.權利要求11-13中任意一項的方法，其特徵在於免疫調節劑例如通過突變而修飾成與相應的天然形式相比表現對其淋巴細胞受體降低的親和性。
15.根據權利要求1-13中任意一項所述的方法，其特徵在於免疫調節劑是IL-2或CD80的胞外部分或其已按照權利要求14修飾的形式。
16.符合下面化學式的超級抗原(T)x(Sag)y(IM)z化學式Ia.T是靶向部分，Sag對應於游離超級抗原，IM是非超級抗原的免疫調節劑，並且T、Sag和IM通過在一個和相同綴合物分子內可能不同或相同的有機接頭B連接在一起；b.x，y和z是一般選自0-10的整數如0-5，並且分別代表T、Sag和IM部分在給定綴合物分子中的數目，其中y＞0並且同時x和z中的一個或二者＞0。
17.權利要求16的超級抗原綴合物，其特徵在於它是融合蛋白，其中x，y和z均是整數1-3、優選1-2，並且x，y和z之間的典型關係選自x＝y＝z；x＝y＝0.5z；x＝0.5y＝0.5z和x＝0.5y＝z。
18.權利要求16的超級抗原綴合物，其特徵在於它是表達為兩條鏈產物的融合蛋白。
19.權利要求18的融合蛋白，其中超級抗原部分SAG融合在靶向部分T』的C-末端上並且免疫調節劑IM融合在靶向部分T」的C-末端上。
20.權利要求19的融合蛋白，其中T』和T」如權利要求8中所定義，和/或SAG如權利要求9-10中任意一項所定義和/或IM如權利要求11-15中任意一項所定義。
21.權利要求20的融合蛋白，其中SAG是葡萄球菌腸毒素A(SEA)，T』是C215 Fab片段的CHl-結構域，T」是C215抗體的輕鏈而IM是白細胞介素2。
22.根據權利要求19-21所述的融合蛋白，其中SAG通過3-11胺基酸殘基的易彎曲親水性胺基酸接頭B』與T』融合併且IM通過10-20個胺基酸殘基的親水並且中性或帶正電的胺基酸接頭Q與T」融合。
23.權利要求22的融合蛋白，其中B』選自Gly-Gly-Pro和Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO19)，並且Q選自Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Asn-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg(SEQ ID NO23)、Gly-Pro-Arg-Gln-Ser-Asn-Glu-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg(SEQ ID NO20)、Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Thr-Thr-Arg(SEQ IDNO21)和Gly-Pro-Thr-Glu-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Glu-Glu-Glu-Thr(SEQ ID NO22)。
24.權利要求16的超級抗原綴合物，其特徵在於它是融合蛋白，其中靶向部分不存在(x＝0)，並且y和z是整數1-3、優選1-2，並且x和y之間的優選關係選自x＝y；x＝0.5y；0.5x＝y；x＝1/3y和1/3x＝y。
25.權利要求16的超級抗原綴合物，其特徵在於具有化學式(Sag)y(IM)z化學式II其中y＝z＝1。
26.根據權利要求16、17、24或25所述的超級抗原綴合物，其特徵在於靶向部分如權利要求8中所定義，和/或超級抗原部分如權利要求9-10中任意一項中所定義和/或免疫調節劑部分如權利要求11-15中任意一項中所定義。
27.一種定向免疫調節劑，其特徵在於作為靶向部分(T『』『)與經修飾例如通過突變而對其淋巴細胞受體有更低的親和性或在與其淋巴細胞受體結合時有更低的內化率(與相應的天然形式相比)的非超級抗原免疫調節劑(IM)之間的綴合物，所述綴合物符合化學式(T)x(Sag)y(IM)z化學式Va.T是靶向部分，Sag對應於游離超級抗原，IM是修飾的免疫調節劑，Sag和IM通過在一個和相同綴合物分子內可能不同或相同的有機接頭B連接在一起；b.x，y和z是一般選自0-10的整數如0-5，並且分別代表T、Sag和IM部分在給定綴合物分子中的數目，其中z＞0並且同時x和y中的一個或二者＞0。
28.權利要求27的定向免疫調節劑，其特徵在於它是融合蛋白，其中x，y和z均為整數1-3、優選1-2，並且x，y和z之間的典型關係為x＝y＝z；x＝y＝0.5z；x＝0.5y＝0.5z和x＝0.5y＝z。
29.權利要求27的定向免疫調節劑，其特徵在於它是融合蛋白，其中超級抗原部分不存在(y＝0)，並且x和z是整數1-3，並且x和y之間的優選關係選自x＝y；x＝0.5y；0.5x＝y；x＝1/3y和1/3x＝y。
30.權利要求29的定向免疫調節劑，其特徵在於它符合化學式(T)y(IM)z其中y＝z＝1。
31.編碼超級抗原和不是超級抗原的免疫調節劑如IL-2的DNA分子。
32.權利要求31的DNA分子，其特徵在於它是以雙順反子構建體形式，其中a.第一個順反子含有編碼包含可能經如權利要求9-10中定義的修飾的非綴合超級抗原(Sag)的多肽I的序列I，並且b.另一個順反子含有編碼包含可能如權利要求11-15中定義的得到修飾的免疫調節劑的多肽II的序列II。
33.權利要求32的DNA分子，其特徵在於序列I和II中的一個或兩個與各個編碼抗體的至少一部分的序列融合使得多肽I和II可結合併形成包含游離超級抗原、免疫調節劑和抗體的三體融合蛋白。
34.權利要求31的DNA分子，其特徵在於超級抗原是非綴合超級抗原並且編碼超級抗原的序列可能通過編碼寡肽接頭的序列與編碼免疫調節劑的序列融合。
全文摘要
一種通過在免疫調節劑存在的情況下使兩種類型的細胞與超級抗原(SAG)接觸從而在T細胞存在的情況下使靶細胞失活的方法,其特徵在於超級抗原和免疫調節劑中至少一種以「游離」超級抗原(Sag)和將綴合物靶向靶細胞的部分之間的綴合物形式存在。超級抗原符合化學式(Ⅰ):(T)
文檔編號A61K38/00GK1275085SQ98808475
公開日2000年11月29日 申請日期1998年7月2日 優先權日1997年7月21日
發明者M·索加爾德, L·阿布拉姆森, P·蘭多, G·福斯伯格, T·卡蘭德, M·多爾斯坦 申請人:法瑪西雅和厄普約翰公司