一種用cd的製作方法

2023-08-22 12:19:16 2

專利名稱：一種用cd的製作方法
技術領域：
一種用CD25/IL-2Ra抗體標記人肝組織毛細膽管的方法，屬於組織細胞染色表達技術領域。
背景技術：
近年來，隨著人們對肝臟疾病了解的深入，肝穿刺活檢已成為一種常規的診斷手段。穿刺器械和技術的進步，使肝穿刺更加安全，取材更滿意。日常工作中肝穿組織已常能達到2cm以上，使肝穿組織病理更有代表性和說服力，並進一步推動了肝病診治前進的步伐。
日常肝組織病理包括HE(蘇木素-伊紅染色)，網織纖維染色，Masson染色，免疫組化，特殊染色，原位雜交等。對肝細胞超微結構的觀察往往需要電子顯微鏡，如肝毛細膽管的觀察，為臨床病理診斷帶來了困難。
肝臟疾病種類繁多，有一部分疾病涉及肝毛細膽管(有人稱膽小管)，特別是一些有黃疸的病人尤為如此。肝毛細膽管在普通HE切片上是無法辨認的，因此，往往導致對其認識不足。國內有學者給剛離體的動物肝臟的膽總管內灌注墨汁以達到顯示毛細膽管的目的，但這在肝活檢標本上是無法使用的。成令忠等給兔肝予鍍銀染色以顯示兔膽小管[成令忠，馮京生，馮子強，等。組織學彩色圖鑑[M]。第1版。北京人民衛生出版社。2000，137。]，但對人肝毛細膽管未作進一步說明；石玉秀，鄧純忠等用ATP酶染色法顯示人肝膽小管[石玉秀，鄧純忠。組織學與胚胎學彩色圖譜[M]。第1版。上海上海科學技術出版社。2002，48。]，但結果並不理想；國外同行用CEA作標記物[駱抗先，B型肝炎臨床與活體組織病理[M]。第1版。北京科學出版社。2001，17。]，我們通過試驗也證實其往往有非特異性染色，部分血竇內皮細胞也呈陽性表達。
CD25/IL-2Ra[陳丙鶯，陳子興。分子生物學基礎與臨床[M]。第1版。南京東南大學出版社。2000，208。]，分子量為55KD，在部分T淋巴細胞上表達，這些細胞對自身反應性T淋巴細胞的活化和增殖起著負調節作用，在器官移植後排異等環節發揮一定作用。最近發現CD4+CD25+細胞可以直接作用於B細胞，抑制抗體類別重組轉換及抗體的產生。目前對於其他組織表達CD25/IL-2Ra的研究極少。CD25/IL-2Ra在肝毛細膽管表達，目前尚無文獻報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種用CD25/IL-2Ra抗體標記人肝組織毛細膽管的方法，通過免疫組化或免疫螢光均證實毛細膽管表達CD25/IL-2Ra，並通過阻斷試驗進一步證實CD25/IL-2Ra表達的特異性。
本發明的技術方案一種用CD25/IL-2Ra抗體標記人肝組織毛細膽管的方法，是以人肝穿刺活檢組織為標本，標本經抗原修復處理，以CD25/IL-2Ra為一抗，經免疫組化或兔疫螢光進行顯色攝片，再以阻斷試驗確定其特異性，確認CD25/IL-2Ra標記人肝組織毛細膽管，步驟為(1)標本抗原修復處理以人肝穿刺活檢組織為標本，標本用10％中性福馬林液固定，石蠟包埋，4μm薄切片，脫蠟至水，檸檬酸高壓鍋抗原修復，貼於玻片上用於免疫處理；(2)免疫組化或免疫螢光免疫組化抗原修復處理後的標本用0.3％過氧化氫祛除內源性過氧化物酶，保持10min，PBS衝洗保持3min，衝洗3次，甩幹；滴CD25/IL-2Ra一抗，室溫孵育1h，PBS衝洗保持3min，衝洗3次，甩幹；滴廣譜二抗Elivision A液保持20min，PBS衝洗保持3min，衝洗3次，甩幹；滴廣譜二抗Elivision B液保持30min，PBS衝洗保持3min，衝洗3次，甩幹；用DAB顯色劑於普通顯微鏡下控制顯色；或免疫螢光抗原修復處理後的標本，PBS衝洗保持3min，衝洗3次，甩幹；滴CD25/IL-2Ra一抗，室溫孵育1h，PBS衝洗保持3min，衝洗3次，甩幹；滴FITC螢光素標記山羊抗小鼠IgG，暗處孵育30min，螢光顯微鏡(波長465-495nm)觀察並攝片；(3)阻斷試驗抗原修復處理後的標本，先滴不帶FITC螢光素的CD25/IL-2Ra一抗使之與標本組織CD25/IL-2Ra抗原表位結合，洗滌後再滴CD25/IL-2Ra-FITC，由於先前標本組織CD25/IL-2Ra抗原表位已與不帶FITC螢光素的CD25/IL-2Ra一抗結合，使CD25/IL-2Ra-FITC無法結合，螢光顯微鏡下顯示陰性結果。
正常對照抗原修復後，PBS洗3min3次，滴CD25/IL-2Ra-FITC(美國BD公司，克隆號2a3)暗處孵育30min，螢光顯微鏡(波段488nm)觀察得陽性結果。
主要抗體來源CD25/IL-2Ra單抗(美國Labvision公司，克隆號IL2R.1；美國Zymed公司，克隆號4c9)；CD4單抗(美國ADI公司，克隆號1F6)；CD8單抗(美國ADI公司，克隆號1A5)；CEA多克隆抗體(美國Zymed公司，編號ZA-0063)；
FITC螢光素標記山羊抗小鼠IgG(美國Vactor公司，編號ZF-0312)；即用型第二代免疫組化ElivisionTMplus廣譜試劑盒(美國Labvision公司，編號KIT-9902)，又稱廣譜二抗。
其它試劑細胞通透劑Tritou-x100，PBS液，檸檬酸修復劑，DAB顯色劑等均購自邁新公司。
本發明的有益效果引用免疫組化方法觀察CD25/IL-2Ra分子在人肝毛細膽管上的表達，用二種不同克隆號的CD25/IL-2Ra作一抗，表達效果均優良。為了防止非特異性染色，我們設立陽性對照(扁桃體)和CD4、CD8之間的片間對照。結果顯示免疫組化顯色清晰，定位正確。通過同一組織分別用CD25/IL-2Ra和CEA作對照，證明CD25/IL-2Ra比CEA更有特異性，顯色效果優於CEA。通過免疫螢光肝毛細膽管呈綠色螢光，進一步確認其表達CD25/IL-2Ra。阻斷試驗進一步說明肝毛細膽管表達CD25/IL-2Ra特異性，用不帶FITC螢光素的CD25/IL-2Ra一抗先與肝組織毛細膽管上的CD25/IL-2Ra抗原位點結合，使後加入的CD25/IL-2Ra-FITC無法與之結合，顯示為陰性結果。通過不同病種間的比較，藥物性肝炎病人因為肝毛細膽管擴張使其CD25/IL-2Ra標記後呈腔隙狀顯色，與臨床病理一致，使之更具說服力；而肝移植後慢性排異的病例其毛細膽管表達CD25/IL-2Ra明顯低下，或許可以作為慢性排異的潛在診斷手段，但此類病人較少，需經更多的病例來證實。
至於肝毛細膽管表達CD25/IL-2Ra的機理，有待通過基因水平，RNA的轉錄或蛋白質的翻譯等水平進行深入研究。通過本發明我們可以觀察到CD25/IL-2Ra在肝毛細膽管上的表達，並通過多種方法證明之，其清晰度和定性均優於CEA，具有明確的特異性。
原發性肝癌和繼發性肝癌的病理學鑑別診斷主要標記，就是前者有毛細膽管的存在，而後者無此結構，因此，CD25/IL-2Ra標記肝毛細膽管在肝癌的鑑別診斷上有重要的臨床意義；對於某些先天性膽管疾病(如Caroli′s病)和黃疸的鑑別診斷(如硬化性膽管炎)也有非常重要的診斷價值。


圖1 CD25/IL-2Ra標記肝毛細膽管，毛細膽管呈棕黃色條索狀結構。1-a、克隆號IL2R.1，S-P法，×200；1-b、克隆號4c9，S-P法，×200。
圖2不同病例的CD25/IL-2Ra標記肝毛細膽管。2-a、PBC(原發性膽汁性肝硬化)肝組織CD25/IL-2Ra(毛細膽管呈陽性表達，S-P法，×200)；2-b、肝移植慢性排異肝組織CD25/IL-2Ra(毛細膽管表達CD25較弱，S-P法，×200)；2-c、正常肝(肝移植供肝標本，毛細膽管表達CD25/IL-2Ra，S-P法，×200)；2-d、藥物性肝炎肝組織(顯示毛細膽管強表達CD25/IL-2Ra，S-P法，×200)。
圖3標記對照。3-a、肝組織CD4表達(匯管區部分淋巴細胞胞漿陽性，部分血竇內皮細胞陽性表達，S-P法，×200)；3-b、肝組織CD8表達(匯管區部分淋巴細胞胞漿陽性，S-P法，×200)；3-c、扁桃體CD25/IL-2Ra(陽性對照，部分淋巴細胞胞漿陽性，S-P法，×200)。
圖4 CEA表達與CD25/IL-2Ra表達對照。4-a、肝毛細膽管CD25/IL-2Ra(毛細膽管呈陽性表達，克隆號4c9，S-P法，×200)；4-b、同一標本肝毛細膽管CEA(多克隆抗體)(部分毛細膽管呈陽性表達，部分血竇內皮細胞也呈陽性表達，S-P法，×200)。
圖5免疫螢光。5-a、肝組織CD25/IL-2Ra免疫螢光(免疫螢光毛細膽管呈索狀綠色螢光表達，×100)；5-b、肝組織CD25/IL-2Ra免疫螢光(免疫螢光毛細膽管呈索狀綠色螢光表達，×200)。
具體實施例方式
實施例1免疫組化毛細膽管CD25/IL-2Ra標記呈棕黃色條索狀結構，同一組織同時做CD4、CD8淋巴細胞對照，以扁桃體組織作陽性對照。所入選病例包括慢性B型肝炎、PBC(原發性膽汁性肝硬化)、肝移植二年後慢性排異、正常肝供體、藥物性肝炎等組織。以上組織均由二種不同克隆號的CD25/IL-2Ra作一抗，表達效果均優良。
實施例2用國際公認的CEA(多克降抗體)與CD25/IL-2Ra對照，同一肝組織CD25/IL-2Ra顯色效果優於CEA。
實施例3螢光免疫組化染色肝組織和正常人血自細胞塗片。
實施例4阻斷試驗正常對照抗原修復後，PBS洗3min3次，滴CD25/IL-2Ra-FITC(美國BD公司，克隆號2a3)暗處孵育30min，螢光顯微鏡(波段488nm)觀察得陽性結果。
阻斷試驗抗原修復後先滴CD25/IL-2Ra一抗(美國BD公司，克隆號2a3)孵育1h使之與組織CD25結合，PBS洗3min3次，再滴入CD25/IL-2Ra-FITC，由於先前組織CD25表位已與CD25/IL-2Ra一抗結合，使CD25/IL-2Ra-FITC無法結合，螢光顯微鏡下示陰性結果。
權利要求
1.一種用CD25/IL-2Ra抗體標記人肝組織毛細膽管的方法，其特徵是以人肝穿刺活檢組織為標木，標本經抗原修復處理，以CD25/IL-2Ra為一抗，經免疫組化或兔疫螢光進行顯色攝片，再以阻斷試驗確定其特異性，確認CD25/IL-2Ra標記人肝組織毛細膽管，步驟為(1)標本抗原修復處理以人肝穿刺活檢組織為標本，標本用10％中性福馬林液固定，石蠟包埋，4μm薄切片，脫蠟至水，檸檬酸高壓鍋抗原修復，貼於玻片上用於免疫處理；(2)免疫組化或免疫螢光免疫組化抗原修復處理後的標本用0.3％過氧化氫祛除內源性過氧化物酶，保持10min，PBS衝洗保持3min，衝洗3次，甩幹；滴CD25/IL-2Ra一抗，室溫孵育1h，PBS衝洗保持3min，衝洗3次，甩幹；滴廣譜二抗ElivisionA液保持20min，PBS衝洗保持3min，衝洗3次，甩幹；滴廣譜二抗Elivision B液保持30min，PBS衝洗保持3min，衝洗3次，甩幹；用DAB顯色劑於普通顯微鏡下控制顯色；或免疫螢光抗原修復處理後的標本，PBS衝洗保持3min，衝洗3次，甩幹；滴CD25/IL-2Ra一抗，室溫孵育1h，PBS衝洗保持3min，衝洗3次，甩幹；滴FITC螢光素標記山羊抗小鼠IgG，暗處孵育30min，螢光顯微鏡觀察並攝片；(3)阻斷試驗抗原修復處理後的標本，先滴不帶FITC螢光素的CD25/IL-2Ra一抗使之與標本組織CD25/IL-2Ra抗原表位結合，洗滌後再滴CD25/IL-2Ra-FITC，由於先前標本組織CD25/IL-2Ra抗原表位已與不帶FITC螢光素的CD25/IL-2Ra一抗結合，使CD25/IL-2Ra-FITC無法結合，螢光顯微鏡下顯示陰性結果。
全文摘要
一種用CD
文檔編號G01N21/78GK101021528SQ20071002072
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月21日 優先權日2007年3月21日
發明者陸忠華, 印永強, 黃利華, 居朝霞, 胡錫琪, 邢益平, 蔣祥虎, 華惠琦 申請人:無錫市傳染病醫院