一種微生物抗稻瘟病劑及其製備方法和應用的製作方法
2023-09-16 21:47:55
專利名稱：一種微生物抗稻瘟病劑及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物抗稻瘟病劑及其製備方法和應用，屬微生物農藥技術領域。
背景技術：
根據聯合國糧農組織(FAO)的統計，全球每年被病蟲害奪去的穀物佔收成的20％-30％，由此造成的經濟損失達1200億美元。我國是一個農業大國，每年由農作物病蟲害造成的經濟損失巨大。世界各國為了對付日益複雜的病蟲害，每年要生產各種化學農藥200多萬噸，現在農藥已廣泛應用於農業生產的全過程，是農業生產不可缺少的生產資料。但是，隨著化學農藥的長期大量使用，人畜中毒事件頻頻發生，生態環境遭到了嚴重破壞，環境汙染日趨嚴重。農藥的急性、慢性毒性、對環境的不良影響和防治對象的抗藥性現象日趨突出，隨著我國加入WTO和人們對環境生態保護的日趨重視，我國農藥業正面臨著嚴峻的形勢。生物防治以其無汙染，無殘留，無生態毒性和安全性好等優點在植物病蟲害的防治中起著主導作用。大力發展生物農藥對我國具有非常重要的現實意義。微生物源農藥是新農藥創製的重要源頭，具有研究周期短、投入低、易於工業化和商品化開發的優勢，且對人畜安全，易於分解，與環境相容，自上個世紀90年代以來，微生物農藥每年以20％的速度遞增，已成為農業生物技術產業中的研究開發熱點之一。
由稻瘟病病原菌[Pyricularia grisea(Cooke)Sacc.]引起的稻瘟病廣泛分布於世界各稻區，是世界水稻生產最具毀滅性的病害之一。我國微生物資源豐富，發展微生物農藥具有充分的優勢。在微生物中放線菌是一類很重要的農用抗生素產生菌，70％以上的農用抗生素均為放線菌產生，在植物病原真菌病害的生物防治中起著非常重要的作用。
發明內容
本發明的目的是通過對篩選到的一株具有防治稻瘟病活性的鏈黴菌進行研究，開發微生物抗稻瘟病劑。
本發明篩選到一株對稻瘟病具有很好防治作用的公牛鏈黴菌Streptomyces tauricusECO 00008，ECO 00008菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京；保藏日期2006年4月17日；保藏登記入冊編號為CGMCC No.1682。
本發明Streptomyces tauricus ECO 00008菌株形態特徵為菌落白色，圓形，表面毛絨狀，邊緣有較多菌絲生長，菌落中部突起，菌落不均勻突起，呈現出4瓣以上的花瓣狀；基內菌絲和氣生菌絲為絲狀，不規則分支，一般不斷裂；氣生菌絲上形成長孢鏈，直形或波形或螺旋，孢子圓形、橢圓形至杆狀。
本發明是這樣實現的製備微生物抗稻瘟病劑1、試管種培養將菌株ECO 00008接種到試管固體培養基斜面上，培養基配方為酵母膏4g；葡萄糖4g；麥芽膏5g；複合維生素1ml；瓊脂20g；水1000ml；pH 7.2，於28℃下培養6天，獲得試管種。(複合維生素組成為維生素B11.0mg/L，維生素B61.0mg/L，核黃素1.0mg/L，煙酸1.0mg/L，苯丙氨酸1.0mg/L，生物素1.0mg/L，丙氨酸0.3mg/L，下同)2、液體種子培養採用500ml三角瓶搖瓶培養，方法是先配製液體種子培養基，液體種子培養基配方為酵母膏4g；葡萄糖4g；麥芽膏5g；複合維生素1ml；水1000ml；pH 7.2，在每個三角瓶中裝入100ml液體培養基，120℃滅菌30分鐘，冷卻後接入1cm2大的試管種，28℃下於轉速為220rpm的搖床上培養2天。
3、製備微生物抗稻瘟病劑採用500ml三角瓶搖瓶培養，方法是先配製液體發酵培養基，液體發酵培養基配方為大豆粉20g；甘露醇20g；水1000ml；pH 7.8，在每個三角瓶中裝入100ml液體發酵培養基，120℃滅菌30分鐘，冷卻後接入10ml上述方法2中得到的種子液，28℃下於轉速為220rpm的搖床上培養6天得發酵液。在發酵液中加入等體積乙醇，經搖床振蕩8小時後，用轉速為3000rpm的離心機離心10分鐘，取上清液並在旋轉蒸發儀上50℃蒸去乙醇，用水稀釋到原發酵液體積，即成為可供使用的微生物抗稻瘟病劑。
將上述方法製備得到的微生物抗稻瘟病劑，採用室內毒力測定(抑制孢子萌發法、平板抑菌試驗法)及活體藥效試驗(溫室盆栽活體試驗)相結合的方法，試驗該製劑對稻瘟病的防治作用。
室內毒力測定結果表明用上述方法製備得到的菌株ECO 00008抗稻瘟病劑在抑制孢子萌發法試驗中，對稻瘟病病原菌孢子萌發的抑制率為100％；在平板抑菌試驗中，對稻瘟病病原菌的抑菌圈直徑平均為15.1mm(3次重複)，兩項試驗表明該製劑對稻瘟病病原菌具有較強的抑制活性。
溫室盆栽活體試驗結果表明菌株ECO 00008抗稻瘟病劑對盆栽水稻苗表現出了較好的防治效果，其對稻瘟病的防治效果經計算為94％。
利用本發明生產的製劑對稻瘟病具有較好的離體及活體防治效果，可用於稻瘟病的防治。本發明具有原料成本低，生產工藝簡單，防治效果好的優點，具有較好的應用前景。
具體實施例方式實施例一抑制孢子萌發法試驗1、製備試驗用抗稻瘟病劑本發明的微生物抗稻瘟病劑，由生產菌株(Streptomyces tauricus)ECO 00008菌株，按液體發酵生產方法製備。具體製備過程及條件與發明內容描述部分相同。
2、製備稻瘟病病原菌將公知的稻瘟病病原菌(Pyricularia grisea)接種到試管固體培養基斜面上25℃下培養6-8天，培養基配方為每1000ml水中含燕麥片50.0g；蔗糖15g；瓊脂粉15g；pH 7.2。待菌絲長滿培養基後用自來水洗去氣生菌絲，於400nm日光燈照射下培養產孢，2-3天後用蒸餾水洗下孢子，並加入0.02％Tween-20溶液，用蒸餾水稀釋成濃度為在10×10低倍顯微鏡下，每個視野30-40個孢子的稻瘟病病原菌孢子懸浮液備用。
3、抑制孢子萌發試驗方法將抗稻瘟病劑供試樣品與配製好的稻瘟病病原菌孢子懸浮液等體積混合，平鋪於水瓊脂培養基上，培養基配方為葡萄糖10g，瓊脂10g，水1000ml，pH自然，每處理3個重複，同時設清水為空白對照。在25℃下保溼培養18小時後察看空白對照孢子的萌發情況，以芽管長度超過分生孢子小端直徑一半時為萌發。當空白對照孢子的萌發率達到95％以上時，察看抗稻瘟病劑供試樣品對稻瘟病病原菌孢子萌發的抑制情況。
按以下公式計算孢子萌發抑制率孢子萌發抑制率(％)＝(對照孢子萌發率-處理孢子萌發率)/(對照孢子萌發率)×100實驗結果表明菌株ECO 00008抗稻瘟病劑供試樣品對稻瘟病病原菌孢子的萌發抑制率為100％。
實施例二平板抑菌試驗本發明的微生物抗稻瘟病劑，由生產菌株(Streptomyces tauricus)ECO 00008菌株，按液體發酵生產方法製備。具體製備過程及條件與發明內容描述部分相同，稻瘟病病原菌的製備同抑制孢子萌發法中的方法。
平板抑菌試驗將培養好的稻瘟病病原菌取0.5cm2大的試管種斜面與10ml燕麥片培養基(製法同抑制孢子萌發法中的方法)混合均勻，倒入內徑為9cm的已滅菌培養皿中製成帶菌平板，平板抑菌實驗採用常規的濾紙片法，即在每個帶菌平板上放置濾紙片，在濾紙片上滴加製備好的微生物抗稻瘟病劑供試樣品15μl，以無菌清水為空白對照，每處理3個重複，置25℃恆溫箱中培養72小時後，用十字交叉法測量抑菌圈直徑。
表1.微生物抗稻瘟病劑對稻瘟病病原菌的抑菌結果
實驗結果表明菌株ECO 00008抗稻瘟病劑供試樣品對稻瘟病病原菌的抑菌圈直徑平均值為15.1mm。
實施例三溫室盆栽活體試驗本發明的微生物抗稻瘟病劑，由生產菌株(Streptomyces tauricus)ECO 00008菌株，按液體發酵生產方法製備。具體製備過程及條件與發明內容描述部分相同，稻瘟病病原菌的製備同抑制孢子萌發法中的方法。具體試驗步驟為a.供試水稻苗本實驗採用的水稻品種為蒙古稻。
蒙古稻種子浸泡催芽後，播於裝有秧田土的長寬為5×15cm，深10cm的塑料育苗盒內，每盒50苗，在溫度為25-28℃的溫室內育苗，按0.2克/盒追施尿素，共2-3次。試驗用藥前一天選擇25-3.5葉期長勢一致的盆栽水稻苗，按序排放，供試驗用。
b.活體藥效試驗將菌株ECO 00008抗稻瘟病劑供試樣品噴施在盆栽水稻苗上，同時設清水為空白對照，以50％的三環唑可溼性粉劑為陽性對照在溫度為25-28℃的溫室內放置24小時後噴霧接種稻瘟病病原菌孢子懸浮液(製法同抑制孢子萌發法中的方法)，在25℃保溼培養箱中黑暗條件下培養20h，取出放入溫度為25-28℃的溫室內培育5-7天後，觀察發病情況，待空白對照葉片充分發病時，採用十字測量法測量每個病斑直徑，以病斑大小作為病害分級標準。病斑分級標準0級無病斑；1級病斑直徑0.1-5mm；3級病斑直徑51-7.0mm；5級病斑直徑71-90mm；7級病斑直徑9.1-11.0mm；9級病斑直徑111mm以上。
抗稻瘟病防效的計算採用下列兩公式病情指數＝[〔∑(各級病葉數×相對級數值)〕/(調查總葉數×最高級值)]×100防治效果(％)＝[(空白對照施藥後病情指數-藥劑處理施藥後病情指數)/空白對照施藥後病情指數]×100％溫室盆栽活體試驗結果表明菌株ECO 00008抗稻瘟病劑供試樣品在盆栽活體水稻苗上表現出了較好的防治效果，其對稻瘟病的防效經計算為94％。
權利要求
1.一種微生物抗稻瘟病劑，其特徵在於該製劑的生產菌株為公牛鏈黴菌Streptomycestauricus ECO 00008，ECO 00008菌株已於2006年4月17日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.1682。
2.權利要求1所述微生物抗稻瘟病劑的製備方法，其特徵在於(1)試管種培養為將菌株ECO 00008接種到試管固體培養基斜面上，培養基配方為酵母膏4g；葡萄糖4g；麥芽膏5g；複合維生素1ml；瓊脂20g；水1000ml；pH 7.2，於28℃下培養6天，獲得試管種；(2)液體種子培養為採用500ml三角瓶搖瓶培養，方法是先配製液體種子培養基，液體種子培養基配方為酵母膏4g；葡萄糖4g；麥芽膏5g；複合維生素1ml；水1000ml；pH 7.2，在每個三角瓶中裝入100ml液體培養基，120℃滅菌30分鐘，冷卻後接入1cm2大的試管種，28℃下於轉速為220rpm的搖床上培養2天；(3)製備微生物抗稻瘟病劑採用500ml三角瓶搖瓶培養，方法是先配製液體發酵培養基，液體發酵培養基配方為大豆粉20g；甘露醇20g；水1000ml；pH 7.8，在每個三角瓶中裝入100ml液體發酵培養基，120℃滅菌30分鐘，冷卻後接入10ml上述方法(2)中得到的種子液，28℃下於轉速為220rpm的搖床上培養6天得發酵液，在發酵液中加入等體積乙醇，經搖床振蕩8小時後，用轉速為3000rpm的離心機離心10分鐘，取上清液並在旋轉蒸發儀上50℃蒸去乙醇，用水稀釋到原發酵液體積，即成為可供使用的微生物抗稻瘟病劑。
3.權利要求1所述的微生物抗稻瘟病劑，其特徵在於該製劑對稻瘟病具有較好的離體及活體防治效果，可用於水稻稻瘟病的防治。
全文摘要
本發明涉及一種微生物抗稻瘟病劑及其製備方法和應用，屬微生物農藥技術領域。該製劑的製備工序包括微生物菌株試管種培養、菌株液體種子培養、菌株液體發酵培養。本發明的生產菌株為公牛鏈黴菌(Streptomyces tauricus)ECO 00008，該菌株已於2006年4月17日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.1682。利用本發明生產的製劑對稻瘟病具有較好的離體及活體防效，可用於水稻稻瘟病的防治。本發明具有原料成本低，生產工藝簡單，防治效果好的優點，具有較好的應用前景。
文檔編號C12R1/465GK1926994SQ20061004866
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月6日 優先權日2006年9月6日
發明者李銘剛, 楊佩文, 文孟良, 劉樹芳, 李一青, 李家瑞, 崔曉龍, 尚慧 申請人:雲南大學