一種具有胰島β-細胞保護作用的重組多肽的製作方法

2023-09-16 17:09:35 2

專利名稱：一種具有胰島β-細胞保護作用的重組多肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種具有胰島e-細胞保護作用的重組多肽，以及 該多肽的克隆、表達和純化。
背景技術：
肝臟不僅是機體最大的消化腺，還是一個重要的免疫器官，具有十分複雜的功能，包括 代謝，合成和儲存功能，以及調節機體內環境穩定，水電解質平衡，血容量、血糖水平功能。 肝臟可合成多種活性物質，其中活性多肽和蛋白的研究已引起國內外學者的廣泛關注，國內 外學者己經從多種動物以及人的肝臟中分離出一些具有不同生物活性的蛋白或多肽
(LaBrecque DR. Hepatic stimulator substance discovery, characteristics and mechanism of action[J].DigDisSci,1991,36:6692)，而這些活性多肽和蛋白均來源於陸地動物的肝臟，作為海 洋中最為活躍的動物之一鯊魚，其肝臟中同樣具有多種活性蛋白，吳梧桐課題組已經從鯊魚 肝臟中分離純化出多種具有生物活性的蛋白和多肽，包括具有肝臟保護作用的多肽
(CN1294134、 CN101041066),以及糖尿病保護作用的多肽(CN1680440)。
大腸桿菌表達系統被廣泛用於重組蛋白表達，利用大腸桿菌系統生產重組蛋白的一個主 要障礙就是重組蛋白往往會形成不溶的、沒有活性的包涵體，雖然現在已經發展了一些復性 的工藝，但耗時、費力、價格不匪，而且效果也不確定。許多方法用來防止包涵體的形成， 包括目的蛋白的分泌性表達，以及與分子伴侶(如GroEL/ES、 DnaK)、摺疊酶系(如DsbABC、 PPI)、分子內伴侶(如Thrx、 GST、 MBP)，甚至與一些短肽的共表達或融合表達。與胞漿內 表達相比，大腸桿菌中重組蛋白的分泌表達有其獨特的優勢，外源蛋白在細菌周質中的成功 分泌需要在其N端融合一段細菌蛋白的疏水性信號肽，融合蛋白跨膜後由細菌的信號肽酶將 信號肽切除，因而周質分泌可獲得具有天然一級結構的產物，同時，氧化性的周質間隙可以 模擬真核細胞的內質網環境，便於新生肽鏈摺疊成天然結構，從而獲得具有完全相同生物學 活性的重組蛋白。此外，周質間隙中蛋白水解酶與胞內比少得多，可以使表達的外源蛋白不 易降解，從而提高外源蛋白的穩定性。特別是對於一些分子量較小的新蛋白，分泌性表達幾 乎能夠保證蛋白的正確摺疊，以及避免小分子蛋白的降解，這樣通過分泌表達幾乎可以獲得 與天然蛋白具有完全相同生物學活性的重組蛋白。

發明內容
本發明的首要目的是提供一種具有胰島e-細胞保護作用重組多肽,包括該多肽的原核分 泌表達載體的構建以及該重組多肽的分離純化方法。
鯊肝活性肽(SHAP)是吳梧桐教授課題組從海洋動物紋斑竹鯊的肝臟中首次分離純化獲 得的一種多肽類物質。本發明根據的鯊肝活性肽N端序列LVGPIGAVGP，通過逆轉錄，獲得一 段編碼序列，通過將編碼序列與pelB信號肽序列相連，克隆至大腸桿菌表達載體pET-22b， 構建了重組鯊肝活性多肽(cSHAP)的分泌表達質粒pET22b-S，通過熱激法將質粒轉化到大
腸桿菌BL21 (DE3)中，進行誘導表達條件及純化條件進行摸索，建立了重組鯊肝活性肽(cSHAP) 在大腸桿菌中分泌表達、分離純化工藝。利用大鼠胰島細胞瘤NIT-1細胞株STZ損傷模 型檢測重組多肽cSHAP對NIT-1細胞的保護作用，結果顯示重組多肽cSHAP具有一定的抑制 STZ所誘導NIT-1細胞凋亡作用。


圖1:鯊魚肝臟cDNA RT-PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖(1: DL2000 DNA Marker; 2:陰性 對照；3: RT-PCR產物)圖2: cSHAP基因PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳3: pET22b-S/BL21誘導表達圖(1:溶菌酶Marker(14KD); 2:誘導後周質蛋白;3:除周質蛋白外的全菌體蛋白)圖4: DEAE S印harose Fast Flow分離後SDS-PAGE電泳圖(1:溶菌酶Marker (14KD); 2:誘導後周質蛋白；3: 0.05M NaCl洗脫；4: 0.1 M NaCl洗脫；1M NaCl洗脫)圖5: A: FPLC monoQ分離純化洗脫曲線圖(A280):B: FPLC monoQ分離洗脫峰SDS-PAGE圖(l:溶菌酶Marker (14KD); 2:峰1; 3: 峰2; 4:峰3)圖6:凝膠P10柱分離純化後主峰SDS-PAGE圖(1:低分子量Marker (Fermentas) ; 2:重 組蛋白cSHAP)圖7: NIT細胞流式細胞分析儀分析結果(A:STZ模型組；B: 15ng/ral cSHAP+STZ處理 組、C: 25iig/ml cSHAP+STZ處理組、D:空白對照組)具體實施方式
材料(1) 菌株與質粒大腸桿菌E c力er/c/w's co"' BL21(DE3)， fsc力aric力ia coh' DH5a為本實驗室保存。 質粒pET22b購自Novagen公司。(2) 工具酶Taq DNA聚合酶，DNA連接酶購自大連寶生物有限公司；限制酶T^el、 HindIII購自MBI Permentas公司(3) 其它主要試材和儀器DEAE S印harose FF購自Whatman公司；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工； 考馬斯亮蘭檢測試劑盒購自南京建成生物工程公司；AKTA explorer高效液相色譜工作站 (Pharmacia);流式細胞檢測儀 (5)主要溶液 平衡緩衝液30mmol/L Tris-HCl， pH8. 0;蔗糖緩衝液30mmol/L Tris-HC1， p朋.0, 25%(m/v)蔗糖，l鵬ol/L EDTA; 氯化鎂溶液30mmol/L Tris-HCl， 0.1,l/LMgCl2
PBS:取Na2HP04 12H20 3.582g， NaH2P04 2H20 L5605g，用適量雙蒸水溶解後分
別定容至500ml，按360mh 140ml的比例將兩種溶液混勻，高壓滅菌，4。C冰箱保存。
DMEM高糖培養液取DMEM乾粉10.4g，加適量雙蒸水溶解，加入3g NaHC03， 0.22g 丙酮酸鈉，3.58g Heps， 0.292g穀氨醯胺，100mg青黴素，100mg鏈黴素，溶解後用lmol/LNaOH 或HCl調節pH7.1，定容至1000ml，無菌條件下通過除菌濾膜(0.22um)，分裝於無菌瓶中， 存於4。C保存。
胰蛋白酶溶液取0.25g胰蛋白酶，0.02gEDTA,溶於100ml 0.02mol/L， pH7.2的PBS 緩衝液，0.22pm無菌濾膜過濾除菌，4°<:冰箱保存。
MTT溶液0.02 mol/L， pH7.2的PBS緩衝液配成5mg/ml的MTT溶液，0.22pm無菌濾
膜過濾除菌，4°<:冰箱避光保存。
實施例l重組cSHAP基因的克隆
(1) 鯊魚(Chiloscyllium Plagiosum)肝臟總RNA的提取
(2) 吳梧桐實驗室前期工作獲得天然鯊肝活性肽的N端序列LVGPIGAVGP，設計兼併引物 5' - AA (C) TIGTIGGGICCIATC(T)GGIGCIG-3'作為上遊引物，下遊引物為oligodT18;
(3) 以鯊肝cDNA為模板，通過PCR方法(94。C 45s， 56°C 50s, 72。Clmin， 30個循環； 72"C延伸10min擴增5^^編碼序列(附圖1 );獲得兩條基因片段，大小分別為350bp和610bp， 350bp基因偏碼蛋白的分子量與天然的活性蛋白相似，因此我們選用350bp的基因序列作為 重組蛋白的編碼序列；
(4) PCR產物克隆至載體pGEM-T-easy，獲得含SHAP編碼序列的載體pT-S股P,測序獲得 5E^編碼序列；
(5) 設計合成PCR引物，同時引入M c/和&oi /位點(下劃線)
Pl: 5' -GTGTGGCCATGCTGGTGGGGCCGATC-3'
P2: 5' -GGCCGAATTCTTGTCGACTTATCACC-3' 以pMD-T-57/力屍為模板，利用PCR方法(94。C預變性4min; 94°C 45s， 56°C 30s， 72°C lmin， 30個循環；72。C延伸7min)獲得SHAF編碼序列，並亞克隆入分泌表達載體pET-22b,獲得SHAF 分泌表達載體pET22b-S;
(6) 質粒pET22b-S轉化E. coli BL21 (DE3),用含AmpKan(100mg/L)的LB平板篩選陽性 克隆，對陽性克隆進行PCR鑑定(附圖2)， PCR陽性轉化子進行測序確證。
結果表明，獲得兩條基因片段，大小分別為350bp和610bp， 350bp基因偏碼蛋白的分子 量與天然的活性蛋白相似，因此我們選用250bp的基因序列作為重組蛋白的編碼序列。其氨 基酸序列為(從N端到C端)
CPKEGSSRST,ISCEAEWDMVNTVTFKKKSFK
實施例2 cSHAP分泌表達、分離純化工藝的建立
(1) cSHAP分泌表達條件的篩選
將克隆菌轉接入LB培養基，分別以不同的誘導物IPTG濃度(lmM、 0. 5raM、 0. lmM)於不
同培養溫度(37°C、 28°C)中誘導表達；收集上清，提取菌體周質蛋白，以及胞漿蛋白，經 15呢SDS-PAGE分析蛋白表達形式；SHAF在0.5mM， 28'C培養條件下，獲得分泌表達(附圖3); (2) cSHAP的分離純化A、 周質蛋白的提取誘導表達的菌液，4'C， 12000r/min，離心5min，收集菌體；菌體 用原菌液體積1/10的冰冷蔗糖緩衝液懸浮，冰浴緩緩攪動15min。然後於4°C， 12000r/min 離心5min，收集菌體;菌體再用原菌液體積1/10的冰冷氯化鎂溶液懸浮，冰浴劇烈攪動15min; 然後4。C， 12000r/min離心20min，上清為周質蛋白部分；B、 DEAE S印harose FF陰離子交換層析柱純化提取的周質蛋白上樣於DEAE S印harose FF 陰離子交換層析柱，分別利用含0. 05M、 0. 1M、 1MNaCl濃度的30畫1/L Tris-HCL緩衝液(pH 8.0)進行階段梯度洗脫，SDS-PAGE分析各洗脫峰((附圖4));C、 monoQ/AKTA explorer純化系統純化上步收集的目的蛋白峰，透析、濃縮後，上樣於 monoQ/AKTA explorer純化系統，洗脫洗脫梯度為0 8%B, 5個柱體積；8% 15%B，40 個柱體積，15% 20 XB，3個柱體積，20% 100%B， 5個柱體積，分段收集洗脫峰，SDS-PAGE 分析各洗脫峰(附圖5)。D、 取上步試驗中峰3樣品，上樣於P10柱，平衡緩衝液洗脫，收集主峰，SDS-PAGE分析 (附圖6)。實施例3取小鼠胰島素瘤e-cell株NIT-1為靶細胞，鏈脲黴素(STZ)對靶細胞具有損傷作用。 取對數生長期的NIT-1細胞，胰蛋白酶消化後均以5X10Vml， 3ml每孔的細胞濃度接種於6 孔板，培養24小時待細胞貼壁後，將STZ溶液以終濃度5mM/L加入各試驗孔中，1小時後試 驗組各孔同時加入終濃度為45 u g/ml、 15 u g/ml、 0 u g/ml的用DMEM高糖培養液(含0. 5%胎 牛血清)溶解的重組蛋白cSHAP，於37'C， 5XC02培養箱培養24小時後，消化收集各組細胞， 預冷PBS洗滌細胞後，冰冷70%乙醇固定細胞，過夜，收集細胞，預冷PBS懸浮各組細胞， 加入RNaseA， 37'C作用半小時後，加入染色劑PI置於室溫20分鐘後(避光)，流式細胞儀 檢測，結果表明體外細胞試驗中，重組蛋白cSHAP能夠顯著的抑制STZ誘導的NIT-1細胞凋 亡作用。(附圖7)
權利要求
1.一種具有胰島β-細胞保護作用的重組多肽，其特徵在於該重組多肽是根據天然鯊肝活性多肽的N端胺基酸序列LVGPIGAVGP，通過分子克隆方法獲得的重組多肽。
2. 按照權利要求1所述的重組多肽，其特徵在其偏碼序列是利用兼併引物5' -AA (C) TIGTIGGGICCIATC(T)GGIGCIG-3，作為上遊引物，下遊引物為oligodT18，以鯊肝cDNA為 模板，通過PCR方法獲得。
3. 按照權利要求1和2所述的重組多肽，其特徵在於利用原核分泌表達系統表達的重組多肽，該重組多肽的編碼序列插入在質粒pET-22b的Mscl和EcoRI位點，在大腸桿菌BL21 (DE3) 細胞內經IPTG誘導後分泌到宿主菌周質中。
4. 重組多肽的製備方法，重組蛋白表達質粒轉化大腸桿菌BL21 (DE3)細胞，並通過IPTG誘導 後提取周質蛋白，經DEAE S印harose FF陰離子交換層析柱、monoQ/AKTA explorer純化 系統、分子篩P10柱純化後，可得到純度為90%以上的重組多肽。
5. 按照權利要求3和4所述製備的重組多肽，其特徵在於體外細胞試驗中，可明顯抑制STZ 誘導的NIT-1細胞凋亡作用。
全文摘要
本發明提供一種具有胰島β-細胞保護作用的重組多肽，該重組多肽根據鯊肝活性肽N端序列LVGPIGAVGP，以鯊肝cDNA為模板，通過PCR方法獲得編碼序列，並構建了重組多肽的分泌表達載體，獲得的重組多肽於體外能夠抑制STZ所誘導的胰島細胞NIT-1的凋亡。
文檔編號C07K14/435GK101161677SQ200710190009
公開日2008年4月16日 申請日期2007年11月19日 優先權日2007年11月19日
發明者呂立力, 吳梧桐, 瑜 歐 申請人:中國藥科大學