用於分離靶細胞的方法

2023-09-16 17:04:50 2

專利名稱：用於分離靶細胞的方法
技術領域：
本發明涉及一種用於樣品中靶細胞的富集和/或分離的方法，所述樣品包括紅血球和/或血小板；所述方法包括(a)通過具有在O. 5 μ m和5 μ m之間的孔或目徑的濾器元件過濾樣品；(b)使在步驟(a)中被濾器元件保留下來的細胞與分離表面接觸，其中所述分離表面包括選擇性結合至靶細胞的親和分子；(C)在允許親和分子與靶分子結合的條件下孵育上述細胞和分離表面；及(d)把分離表面與任何沒有結合的細胞和材料分離。
背景技術：
已在臨床研究中示出了播散的腫瘤細胞(DTC)(即在癌症患者的外周血或骨髓中可檢測的腫瘤細胞)在癌症患者的診斷及治療結果的評價方面提供信息價值。除此之外，在很多情況中這些細胞具有在疾病的早期指示腫瘤發生的能力。
例如，對乳腺癌患者的研究顯示患者血液中的播散的腫瘤細胞的檢測與無進展的存活和完全存活的降低顯著相關(Gaforio等(2003) Int. J. Cancer, 107 (6) :984-90 ；Stathopoulou 等(2002) J. Clin. Oncol. ,20(16) :3404-12)。在其它類型癌症中進行的研究中獲得了類似的結果(Koch 等(2005)Ann. Surg. ,241(2) :199-205 ;Kinele 等(2003)Ann.Surg. , 238 (3) :324-30)。因此，在癌症患者的血液或骨髓中存在的播散的腫瘤細胞的準確監控提供了用於治療優化和預測病程的有用的參數。另外，從原發腫瘤的腫瘤細胞的血源性擴散也被認為在轉移灶的發展中起作用(Eccles S. A. & Welch D. R. (2007)，Lancet，369，1742-1757)。轉移灶的形成(而不是原發腫瘤本身的進展)是導致腫瘤疾病中的死亡的主要原因。因此，用於轉移灶形成的早期標誌的檢測對應用至癌症患者的治療方案極其重要。目前，通過使用包括結合至腫瘤細胞的確定的表面抗原的抗體的磁珠常規地進行播散的腫瘤細胞的檢測和分離。這些修飾的珠子與個體的血液樣品孵育以特異性結合樣品中存在的腫瘤細胞。但是，目前可用的技術與非特異的細胞吸附至珠子的高程度，以及腫瘤細胞的低檢測率相聯繫。已知由於樣品中的非靶細胞(尤其是紅血球細胞)的數量很大，因此不能確保在常規使用的方法中樣品中的每個腫瘤細胞均與珠子的抗體呈現表面相互作用足夠長的時間，以便發生固定的抗體和靶細胞之間的結合。相反，樣品中有效數量的腫瘤細胞將不用它們對應的捕獲分子接觸。因為該原因，現有技術中做了嘗試以移除紅血球，以便富集樣品中的腫瘤細胞。例如，使用了使用特異的密度梯度介質(諸如Ficoll、Nycodens、Nycoprep等)的密度梯度離心。為了該目的所採用的介質具有在紅血球和有核細胞的密度之間的密度。通過離心，紅血球和有核細胞變得富集在介質的不同的相中，且可通過移液管彼此分離。這種方法具有特定的缺點，即該方法是勞動密集型的且需要高度熟練的人員來進行分離。而且，播散的腫瘤細胞可能顯示寬密度範圍，這意味著這些細胞的一部分可能不可用於隨後的親和結合步驟。密度梯度離心的使用還需要腫瘤細胞的多次清洗步驟，這與若干不利影響諸如剪切應力和細胞非特異性吸附至反應管壁相關，其中剪切應力和細胞非特異性吸附至反應管壁可導致靶細胞的丟失。已證實通過密度梯度離心的腫瘤細胞的富集通常導致樣品中存在的腫瘤細胞幾乎三分之二的丟失(Choesmel等(2004)，101,693-703)。進一步地，密度梯度離心不能進行更大樣品體積的處理，這在當考慮播散的腫瘤細胞以極低的濃度存在於血液或骨髓中時是明顯的不利因素。在目前使用的可選擇的方法中，通過向血液樣品中加入裂解緩衝液諸如氯化銨來裂解紅血球。通過加入裂解緩衝液，紅血球的膜破裂從而導致細胞死亡和細胞內組分的釋放。但是，已證實裂解緩衝液的使用還常常使樣品中存在的播散的腫瘤細胞的很大部分破裂。進一步地，可假設這些緩衝液的使用將有害地影響靶細胞的新陳代謝，這對進一步的處理步驟(例如培養分離的細胞)是不利的。

發明內容
根據上述問題，本發明的一個目的是提供一種用於富集和/或分離靶細胞的改進的方法，該靶細胞與紅血球和/或血小板一起存在於生物樣品中；所述方法具有高回收率 且同時包含對靶細胞的溫和處理，以便在處理過程中僅使少量的靶細胞破裂。尤其，該方法 將不會對靶細胞施加大量的機械或化學應力。本發明的另一目的是提供一種允許血液樣品中的靶細胞高度特異性的結合至分離表面的方法，該方法的特徵在於非靶細胞諸如紅血球與所述表面的非特異性附著減少。通過所附權利要求中定義的方法達到這些目標和其它優點。本發明已發現通過具有特別小孔徑的濾器元件過濾包含紅血球和/或血小板的樣品(諸如全血樣品)且隨後經由與靶細胞特異性結合的分離表面分離殘留物中的靶細胞的組合方法產生非常高的回收率。在本發明的實施例中，可回收幾乎100%的進行本發明方法的標記的靶細胞。通過初始的過濾步驟大大減少了可幹擾親和結合步驟的紅血球、血小板或白細胞對分離表面的非特異性吸附。此外，已發現當與參照樣品(其中通過密度梯度離心去除紅血球)中的白細胞相比，已通過根據本發明的過濾步驟分離的白細胞顯示出對分離表面低2級的非特異性結合親和性(factor 2 lower non-specific bindingaffinity)(見圖2)。因此,通過分離表面的祀細胞的回收率(也被稱為淘金法(panning))比通過現有技術中的方法實現的靶細胞的回收率高很多。因此，在第一方面，本發明公布了一種用於樣品中靶細胞的富集和/或分離的方法，其中，其中所述樣品包括紅血球和/或血小板，所述方法包括(a)通過具有尺寸在O. 5 μ m和5 μ m之間的孔、洞或縫隙的濾器元件過濾所述樣品;(b)使被步驟(a)中的所述濾器元件保留的細胞與分離表面接觸，其中所述分離表面包括選擇性結合至所述靶細胞的親和分子；(C)在允許所述親和分子與所述靶細胞結合的條件下孵育所述細胞和所述分離表面；以及(d)從任何未結合的細胞和材料中分離所述分離表面。本發明的方法可應用於包括紅血球和/或血小板的任何樣品。優選地，所述樣品包括來自個體的體液或組織提取液。優選地，樣品來源的個體為脊椎動物，且更優選地為哺乳動物。在特別優選的實施方式中，上述樣品來源於人。樣品通常為細胞懸浮液。上述樣品可包括以下物質或由以下物質組成血液(例如全血)或血液組分、尿液、胸腔積液、腹水、支氣管肺泡灌洗液、女性乳房腺體的乳頭抽吸液或骨髓。在優選方面，包括靶細胞的樣品分別為血液或骨髓樣品，例如來自人類個體的包括血液或骨髓或主要由血液或骨髓組成的樣品。可通過現有技術中任何已知的方法獲取樣品。例如，如果樣品為人的血液樣品，則可通過靜脈穿刺獲取樣品。用於獲得骨髓(例如人的骨髓)的方法在本領域中也是公知的。例如，可通過通常經由微創外科手術的介入治療從髂骨或從胸骨的隆起部位獲取混合有血液的紅骨髓。可選擇地，生物樣品可為腹水(即腹腔液體)、胸腔積液、來自女性乳頭的抽吸液、尿液或其它體液。
當要在根據本發明的方法中使用的樣品具有特別高的粘度時，可能有利地是在將樣品施加在濾器元件之前或同時稀釋該樣品。為了該目的，可使用任何生理上可接受的緩衝液，該緩衝液不會干擾靶細胞至親和分離表面的後續結合。用於樣品稀釋的適合的緩衝液為在生理pH內進行緩衝的等滲緩衝液，例如磷酸鹽緩衝液(PBS)、漢克(Hank’s)平衡鹽溶液、Tris緩衝鹽水、HEPES緩衝鹽水、MES緩衝液等。生理緩衝液的pH值優選在大約pH
6.O至大約pH 9. O的範圍內，更優選在大約pH 6. 5至大約pH 8. O之間，且最優選在大約pH 7. O至大約pH 7. 5之間(例如pH 7. 4)。本發明的方法的一個特別的優點是可處理相當大體積的樣品。可將至少5ml或更多(例如 8ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、35ml、40ml、45ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml或甚至100ml、150ml、200ml、500mlUOOOml或更多)的樣品體積進行過濾步驟，然後使殘留物與分離表面接觸。以這種方式，可適用過濾步驟以濃縮殘留物，從而減少樣品處理時間，且增強本方法的整體性能。相反，目前可用的方法依賴於磁珠的使用，其中磁珠被加入懷疑包括靶細胞的樣品中。在這些方法中，僅有2 5ml之間的小體積的樣品流體可與磁珠孵育，因為否則靶細胞和顆粒表面上的抗體的接觸的可能性顯著降低，從而導致低回收率。根據本發明，初始的過濾步驟富集靶細胞，且同時去除大量的紅血球和/或血小板，否則紅血球和/或血小板會干擾後續的靶細胞和分離表面上的親和分子的結合。在本發明的第一步驟中，通過具有尺寸在O. 5 μ m和5 μ m之間的孔、洞或縫隙的濾器元件過濾樣品。通過使用濾器元件可從樣品中去除紅血球和/或血小板，否則紅血球和/或血小板會干擾靶細胞(例如播散的腫瘤細胞)和分離表面上的靶細胞對應的親和分子的結合。紅血球(紅細胞)是負責在血液中運輸氧的具有平均直徑為5 8 μ m的無核血細胞。已發現由於這些細胞高度的可變形性，具有小至O. 5 μ m孔徑的濾器元件可有效用於去除這些細胞的絕大多數。紅血球具有扁平的形狀且可形成管狀結構，能夠穿過具有尺寸顯著小於紅血球在它們的放鬆、扁平狀態下的平均直徑的縫隙。類似地，血小板是沒有細胞核的細胞，常常具有在I 2μπι之間的平均直徑且具有某種程度的可變形性，這意味著血小板也能夠穿過具有上述孔徑的濾器元件的孔。相反，有核細胞諸如白細胞或腫瘤細胞通常大於5 μ m，且具有有限的變形能力。因此有核細胞被濾器元件保留，從而被計劃用於本發明的方法中。如下面實施例6所示，通過選擇適當的濾器元件能容易地從人全血樣品中的大部分紅血球和血小板中分離腫瘤細胞和白細胞,而不會產生腫瘤細胞任何相當大的丟失。上面方法的步驟(a)中的過濾去除樣品中存在的相當大部分的紅血球。優選地，過濾步驟去除樣品中存在的紅細胞的大約30%、大約40%、大約50%、大約60%、大約70 %、大約80 %、大約90 %、大約95 %或甚至多達大約96 %、大約97 %、大約98 %、大約99%或更多。同樣地步驟(a)中的過濾步驟適於去除樣品中存在的相當大部分的血小板。優選地,過濾步驟去除樣品中存在的血小板的大約30%、大約40%、大約50%、大約60%、大約70 %、大約80 %、大約90 %、大約95 %或甚至多達大約96 %、大約97 %、大約98 %、大約99%或更多。有核細胞諸如白細胞或腫瘤細胞被濾器元件保留，這樣可使用過濾以相對於紅血球或血小板分別富集這些細胞部分。如本文所用的術語「濾器元件」指包括有規律或不規則分布的孔的介質或材料，所述孔允許小於某一臨界尺寸或直徑的細胞或化合物穿過該濾器元件，同時保留具有超過所述臨界尺寸或直徑的尺寸或直徑的其它細胞、聚集物或化合物。在實施本發明中使用的濾器元件可包括所有類型的常用濾器介質或材料，且具有任何形狀或尺寸。例如，優選為薄片狀的本發明的濾器元件可由以下物質組成或包括以下物質一種或多種織物或無紡織物，一個或多個穿孔的薄片，一個或多個篩網或網狀結構，一種或多種微多孔材料，一個或多個膜，或這些材料的兩種或更多種的組合。如通常在過濾技術中所使用的，術語「孔」表示在所有上述材料中設置的洞、開口和縫隙。因此，例如在金屬絲網或織物結構的情況中，孔為單個的網眼或網眼縫隙，同時孔徑為目徑；且在篩網的情況中，孔為單個的篩網縫隙。優選地， 濾器元件包括這些材料中的一種的單層或由這些材料中的一種的單層組成，或者濾器元件包括這些材料的至少兩層或由這些材料的至少兩層組成。例如，濾器元件可包括一個或多個膜或膜濾器，或由一個或多個膜或膜濾器組成，諸如通常用於從液體或氣態流體中過濾微粒物質的那些膜或膜濾器。根據本發明，在任何情況中，濾器元件的孔徑在O. 5 μ m和5 μ m之間，例如O. 5、I、
2、3、4或5μπι。優選地，濾器元件的孔徑在I μ m和2 μ m之間。在這個方面，特定的孔徑被理解為橫過該孔的最小直徑。換而言之，本文所使用的孔徑與仍能夠穿過孔的最大球體的直徑相同。上述濾器元件尤其可包括織物或無紡織物或由織物或無紡織物組成。如本文所使用的術語「無紡織物」指類網狀結構，其中隨機定向的纖維、細線或細絲以非對齊或隨機的方式被夾在中間。無紡織物濾器可包括不會實質幹擾從靶細胞分離紅血球和血小板的目標的任何材料。濾器的材料尤其不應出現紅血球或血小板的任何實質的粘附，這樣會防止紅血球或血小板有效穿過濾器元件。類似地，濾器的材料還不應允許靶細胞例如播散的腫瘤細胞與濾器材料的任何實質的非特異性粘附，這樣會妨礙隨後靶細胞至分離表面的轉移。允許細胞分離的由無紡織物製成的濾器元件在本領域是公知的，且該濾器元件可由各種材料諸如纖維素或纖維素衍生物組成，包括醋酸纖維素、硝酸纖維素、羥丙基纖維素(HPC)、羥乙基纖維素(HEC)、羥丁基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素。無紡織物濾器的其它常用材料包括聚碳酸酯、羥乙基澱粉、聚碸、聚醚碸，聚醯胺、聚醚酮、聚醚醯亞胺、聚亞芳烴(polyarylene)、聚苯醚、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)等，以及玻璃。可通過各種已知方法製作無紡織物濾器材料，例如熔噴(meltblowing)、網狀結合(spunbonding)、氣流成網(air-laying)、溼法成形(wet-forming)和粘合的梳理成網(bonded cardedweb)方法。在例如美國專利號4，340，563和3，849，241中描述了無紡織物的生產。還可從多家不同的供應商，例如從Carl Roth (卡爾斯魯厄,德國)、Schleicher &Schuell (達瑟爾，德國)和Satorius (哥廷根，德國)獲得適合的無紡織物濾器。
在特別優選的實施方式中，在本發明的方法中使用的濾器元件包括織物或由織物組成。如本文所使用的，「織物」指已通過編織工藝，即通過經纖維和緯纖維、經細線和緯細線，或經紗和經紗的交織製備的材料。經纖維和緯纖維、經細線和緯細線，或經紗和緯紗優選以基本直角依次彼此上下交叉。這優選產生具有正方形或矩形網孔的紡織品，其中網孔具有確定的目徑，可用於分離具有確定尺寸的顆粒。根據本發明，織物濾器元件的孔徑或目徑在O. 5 μ m和5 μ m之間，例如為I μ m、2 μ m、3 μ m、4 μ m或5 μ m,其中本文中特定的網孔或縫隙的尺寸應理解為橫過該網孔或縫隙的最小直徑。換而言之，本文所使用的網孔或縫隙尺寸與仍能夠穿過該網孔或縫隙的最大球體的直徑。適於在本發明中使用的織物包括篩選織物(screening fabrics),如通常在絲印法(silk screen method)或膠印法(offsetprinting method)中使用的那些篩選織物。在本發明中使用的織物結構可具體包括以下物質或由以下物質組成聚醯胺、芳族聚醯胺、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、多氟烴、聚丙烯腈、聚氨酯、聚丙烯酸酯、尼龍、聚苯硫醚、聚四氟乙烯、聚苯並咪唑等。可從不同的供應商買到適合的織物濾器，例如從Schwegmann Filtrations-Technik GmbH(蓋爾斯多夫,德國)買到單絲紡織品 polyamid 6. 6 單絲；從 Franz-Eckert GmbH(瓦德奇，德國)買到 PA1/1-PA 5/1 ；從Sefar AG (海登，瑞士)買到 Sefar Nitex 03-1/1 或Sefar Nitex 03-5/1 或Sefar Petex 07-5/1。織物或無紡織物濾器元件可額外地包被有生物惰性層，該生物惰性層抑制與樣品中存在的細胞的任何相互作用。這些生物惰性層可包括例如適合的封閉蛋白(諸如BSA或酪蛋白)，或親水性包衣(諸如水凝膠)，或可通過有機濾器元件的(等離子)氧化製備的
親水性氧化層。可在本發明的方法中使用的進一步優選的濾器元件包括通過蝕刻基於矽片的材料(諸如氮化矽)製造的微篩網。通過先進的半導體方法製備上述篩網，該篩網提供非常薄的分離層和均勻尺寸的孔。通過使用這種技術，可製備具有O. 35μπι直徑的孔和縫隙。可例如通過 fIuXXion B. V.(埃因霍溫，荷蘭)或通過 Aquamari jn Micro Filtration B. V.(聚
特芬，荷蘭)買到商標名為 microsieve 的適合的濾器元件。其它適合的濾器元件包括通過相分離成型工藝製備的聚合物結構。這種技術使用在溶劑/非溶劑系統中的聚合物的混合物以在模具上形成三維結構。通過選擇聚合物和溶劑/非溶劑的合適的混合物，可生產具有孔徑在0.5μπι至Ιμπι範圍內的微孔結構。基於這種技術成型的濾器元件包括Aquamari jn Micro Filtraion B. V.(聚特芬，荷蘭)提供的那些濾器元件。可簡單地通過在濾器元件的兩側提供壓力差使樣品或稀釋的樣品過濾通過該濾器元件，使得在提供樣品和形成殘留物的一側壓力較高。例如，可通過適合地使用重力或適合地使用流體靜壓力差有利地造成這樣的壓力差。依賴於選擇用於過濾步驟的裝置，且依賴於濾器元件的參數(尤其是濾器元件的孔徑或目徑)，技術人員將能夠調整用於使樣品穿過濾器元件所施加的壓力。簡單講，壓力應足夠高以通過迫使紅血球和/或血小板穿過濾器元件有效地去除樣品中存在的紅血球和/或血小板。另一方面，壓力應足夠低，以便靶細胞不會被損害或被推動穿過濾器元件。可以各種形式使用濾器元件，條件是選擇的濾器元件可符合特定的過濾工藝。例如，如果使用如下面定義和圖8 9中示例的兩個腔體的組件，優選在兩個腔體之間使用包括一個或多個平薄片的濾器元件。同樣可使用其它形式的濾器元件，例如漏鬥形的元件或V-形的槽。可選擇地，還可僅在擴散的基礎上實現本發明方法的過濾步驟。例如，可選擇裝置，在該裝置中通過濾器元件從無血小板和/或紅血球的緩衝溶液分離包括血小板和/或紅血球的樣品。緩衝液例如可以是以上樣品稀釋的上下文中提到的任意緩衝液。如果孵育足夠的時間段，則樣品中存在的血小板和/或紅血球將穿過濾器元件以在樣品和緩衝液的不同濃度之間創建平衡。可通過持續從所述緩衝液移除透過濾器元件的任何血小板和/或紅血球(例如更換緩衝液)來保持和維持定向的擴散過程。在僅僅通過擴散實現過濾的實施方式中，還可能使用密封袋形式的濾器元件，其中密封袋中包含具有靶細胞的樣品。密封的濾器元件可被浸入沒有紅血球和血小板的適合的緩衝介質(例如PBS)中。袋狀濾器元件中的紅血球和/或血小板將逐漸透入周圍的介質中。優選地，例如通過重複或持續使用新鮮的介質更換包含血細胞的介質來移除進入介質的細胞。這可通過例如使用流速為5ml/min的螺動泵實現。為了進行預過濾，可在根據本發明的過濾步驟中使用具有孔徑為10 30 μ m的濾 器元件，尤其是如果生物樣品是血液樣品。使用用於預過濾的濾器元件以移除可能通過白細胞和血小板的聚集或通過纖維蛋白、纖維蛋白原和其他血液組分形成的細胞聚集物。因此，本發明的方法可包括在上述方法步驟(a)之前的步驟，在該步驟中樣品被過濾通過具有孔徑或目徑在10 μ m和30 μ m之間的預濾器元件。預濾器元件可包括上文結合濾器元件所述的材料或由其組成。本方法試圖富集和/或分離的靶細胞優選是在樣品中以低濃度存在的細胞。根據特別優選的實施方式，靶細胞是腫瘤細胞，優選為播散的腫瘤細胞，且更優選為人播散的腫瘤細胞。播散的腫瘤細胞是從原發腫瘤分離出來且在外周血中循環或逐漸在骨髓中富集的癌細胞。這些細胞以非常低的濃度存在於血液或骨髓中，因此它們的檢測和分離通常很複雜。例如，在血液中循環的腫瘤細胞正常以1(Γ6 1(Γ8個白細胞中有大約I個腫瘤細胞的濃度存在。相反地，紅血球的濃度在每毫升人血液中存在4 6χ109個細胞的範圍內。存在於血液中的血小板的濃度為每毫升血液存在大約I. 5 3. OxlO6個細胞。血液中大量的紅血球和血小板具有如下不利影響，因為大部分靶細胞不能充分地與它們對應的結合分子相互作用以結合至分離基質上，而使靶細胞(諸如在血流中浮動的腫瘤細胞)經由分離表面(例如磁珠或包被的支撐表面)上的特異性結合分子(例如抗體)的結合效率常常很低。通過本發明的方法檢測的播散的腫瘤細胞可源自任何癌症類型的原發腫瘤，例如來自以下原發腫瘤前列腺癌、宮頸癌、胰腺癌、乳腺癌、結腸癌、腦癌、肺癌、支氣管肺癌、肝癌、膀胱癌、皮膚癌、頭頸癌、血液學癌症、Hj頸癌、卵巢癌、胃癌、腎癌、子宮癌、骨癌、食道癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌、睪丸癌、外陰癌、肝細胞瘤、唾液腺癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、淋巴瘤、肉瘤、膽囊癌、胚細胞癌、多發性骨髓癌、小腸癌、胸腺癌等。優選地，播散的腫瘤細胞來源的癌症類型是癌(即上皮來源的腫瘤)，更優選地是乳腺癌、結腸癌、肺癌或前列腺癌。從本發明的意義上說，除了腫瘤細胞之外，在血液或骨髓中極少量存在的其它細胞類型可為靶細胞，諸如漿細胞、淋巴細胞的稀有亞型，例如記憶細胞、囊胚細胞、胚胎細胞、胎盤細胞等。當將靶細胞與紅血球和/或血小板分離後，已被濾器元件保留的細胞被轉移至或開始與分離表面相互接觸。可使用任何適用於在殘留物中的細胞和分離表面之間建立接觸的方法。例如，當分離表面是被包被的載片，則可將靶細胞重懸在少量的緩衝液(如果需要)中，且用移液管將重懸的靶細胞轉移至載片表面上。緩衝液可為例如在上面樣品稀釋的上下文中提到的任意緩衝液。包含殘留物的等分試樣通常具有O. 5ml和8ml之間的體積，例如為大約lml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml或7ml。如果需要,可使用上述討論的緩衝液稀釋等分試樣以使體積達到10ml、20ml、20ml、30ml、40ml或50ml。可選擇地，當親和分離表面是小的珠子(諸如抗體固定在上面的磁珠)，則可將靶細胞重懸在緩衝液中，且隨後將珠子加入細胞懸浮液以進行進一步的孵育。此外，分離表面可為顆粒形式，例如為玻璃顆粒或樹脂顆粒，以便可引導已重懸在小體積緩衝液中的靶細胞穿過被所述顆粒填充的層析柱。此夕卜，分離表面可具有毛細管的形式，包括靶細胞的懸浮液被引導穿過該毛細管。本文所使用的術語「分離表面」廣義上指任意表面，該表面攜帶至少一種類型的適用於選擇性結合靶細胞上的預定結構的親和分子。分離表面可為通過親和分子(諸如抗體)的固定被修飾的顆粒表面，例如為珠子(諸如磁珠或玻璃珠)的表面；其中親和分子被指向靶細胞的確定的抗原結構。可選擇地，分離表面可為基本平坦的支撐物的表面，諸如載片(例如載玻片或塑料載片)的表面。在優選實施方式中，分離表面是優選由玻璃或透明的塑料製成的生物晶片的一部分。分離表面還可呈現為層析樹脂材料。 上述支撐材料可被設置有包衣以提供分離表面的生物惰性。這意味著防止細胞被非特異性吸附至上述表面。根據特別優選的方面，分離表面被包被有天然或合成的親水聚合物層。優選地，親水聚合物在高度水合的支撐材料上形成三維結構。因此，這樣的聚合物網常常被稱為「水凝膠」。水凝膠可包含高達99%或更多的水，然而聚合物含量可為1%或甚至更低。例如在W002/10759中描述了在本發明使用的用於製備水凝膠的方法。該國際申請(其整體併入本文)描述了提供水凝膠聚合物與支撐物材料結合的粘附介質層的使用。W002/10759中提供的水凝膠包衣特別優選用於本發明的方法中。各種親水聚合物可被用於水凝膠包衣。例如，該包衣可包括以下物質或由以下物質組成多糖類、多元醇、聚醚類、聚醯胺類、多元羧酸、聚硫酸鹽(polysulfate)、聚磺酸鹽(polysulfonate)、聚磷酸鹽、聚膦酸鹽、和/或其組合或其官能化衍生物。所述官能化包括例如異硫氰酸鹽類、異氰酸鹽類、羧酸疊氮化物、N-羥基琥珀醯胺類、N-醯基咪唑類、磺醯氯衍生物、醛、酮、乙二醛、環氧乙烷、碳酸鹽、芳基滷化物、醯亞胺酯類、酐類、滷代烷基(halogenalkyl)、滷代醯基(halogenacyl)、馬來醯亞胺類、氮丙唳類、丙烯醯類、巰基類、二硫化物類、重氮烷、重氮乙醯類、咪唑氨甲酸酯類、醯肼類、重氮基、芳基疊氮化合物、二苯甲酮類、重氮丙酮酸鹽類或二氮呤類。進一步優選的官能化包括次氮基三乙酸(NTA)衍生物，以便配體或抗體可通過金屬螯合物被固定。鏈親和素和/或生物素衍生物也適用於官能化。根據優選的實施方式，水凝膠包衣包括或由聚羧酸鹽聚合物組成。根據進一步的優選實施方式，當例如通過 電勢測定測量時，水凝膠包衣具有輕微的負電荷。水凝膠包衣可具有允許在水凝膠表面上捕獲靶細胞的任何厚度。優選地，水凝膠包衣具有在大約IOOnm和大約5000nm之間、優選在大約500nm和大約3000nm之間的厚度，例如厚度為大約600nm、大約700nm、大約800nm、大約900nm、大約lOOOnm、大約llOOnm、大約 1200nm、大約 1300nm、大約 1400nm、大約 1500nm、大約 1600nm、大約 1700nm、大約 1800nm、或大約1900nm。可通過現有技術中可獲得的常規方法測定包衣的厚度，例如通過原子力顯微鏡或橢圓偏振技術測定包衣的厚度。
包衣優選提供了三維表面結構，在該結構中親水聚合物鏈在至少部分垂直於基質表面的方向上排列，即呈刷子狀。由於所述刷子狀的水凝膠表面與平面結構相比具有增大的表面，因此刷子狀的水凝膠表面示出對生物分子(諸如能夠結合靶細胞的抗體和其它親和分子)顯著增強的固定能力。已發現刷子狀結構的水凝膠包衣，特別是那些包括或由特定聚羧酸鹽聚合物組成的水凝膠包衣為選擇性使細胞吸附至固體支撐物以進行後續檢測和/或量化提供了極好的表面。可從XanTec bioanalytics GmbH(杜塞道夫,德國)獲得用於本發明的優選的水凝膠表面，例如為HC或HCX包被的載片。根據本發明，分離表面包括選擇性結合至樣品中的靶細胞的一種或多種不同類型的親和分子，從而允許靶細胞與在去除紅血球和/或血小板後從殘留物存在的其它細胞分離。「親和分子」廣義上被理解為結合至細胞的預定結構、優選結合至靶細胞表面上存在的蛋白或多糖結構的分子。親和分子優選為蛋白分子，諸如受體、凝集素、配體、抗體、抗體片段、核酸(諸如適體)、糖結構、或其組合。 根據本發明，抗體分子或其抗原結合片段的使用對靶細胞的結合是特別優選的。在本發明的上下文中，術語「抗體」包括單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、抗獨特型抗體(anti-idiotypic antibodies)、嵌合抗體和人源化抗體,只要這些抗體示出所需的免疫學活性，即特異性結合至靶細胞。具體地，該術語被理解為包括通過移植技術等製備的任何類型的人工抗體分子。在本方法中使用的抗體可具有任何同種類型，諸如IgG, IgM, IgA, IgE和IgD以及它們的亞類，例如IgGU IgG2等。除了完整的抗體之外，本發明還指特異性結合至靶細胞的抗體的抗原結合片段。如本文所使用的，抗體的抗原結合片段是如下的片段保留了用於靶細胞(例如播散的腫瘤細胞)特定抗原結構的完整抗體分子的至少一部分特異結合活性。本發明的抗原結合片段可包括Fv、Fab、F(ab')和F(ab' )2片段。術語「抗原結合片段」進一步包括單鏈Fv抗體片段和二硫鍵連接的Fv片段(dsFv)。在現有技術中已描述了用於抗體片段重組製備的方法,且包括例如噬菌體展示技術或核糖體展示技術。可純化通過這些方法製得的重組的抗體片段，且檢驗該抗體片段對靶細胞(例如腫瘤細胞)的結合親和性和特異性。可以不同方法進行特異性親和分子至水凝膠包被的分離表面的固定。適用於大部分應用的標準方法包括經由氨基或羥基官能團將親和分子共價聯結至使用N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)預活化的水凝膠。因為固定的親和分子是共價結合而不是吸附至水凝膠包衣，因此該固定過程同樣很適用於所有類型的親和分子，例如抗體、蛋白、多肽、低麗化合物、核酸等，只要這些親和分子具有適合的反應基團諸如氨基、(二)硫化物部分或醛部分。為了可選擇的聯結方案，鏈黴親和素、蛋白A、二硫化物或醯肼官能化的包衣也可在現有技術中獲得。包含親和分子的緩衝液可應用至整個分離表面或被點在所述表面的限定區域。能很容易地在一個基質上組合不同的親和分子。在優選實施方式中，水凝膠包被的分離表面包括兩種或更多種具有不同結合特異性的分子，諸如包括2、3、4或5種不同的抗體。當然，本發明的分離表面還可包括不同類型的親和分子，諸如針對相同靶細胞的相同或不同抗原結構的不同的抗體或抗體片段。可選擇地，當期望在相同的過程中同時富集不同類型的靶細胞時，則分離表面還可包括針對不同靶細胞的不同的抗體或抗體片段。優選地，本發明的分離表面上的親和分子的總密度在大約O. lng/mm2 大約100ng/mm2的範圍內，例如為大約0. 5ng/mm2、大約lng/mm2、大約5ng/mm2、大約8ng/mm2、大約10ng/mm2、大約15ng/mm2、大約 20ng/mm2、大約 30ng/mm2、大約 40ng/mm2、大約 50ng/mm2、大約 60ng/mm2、大約70ng/mm2、大約80ng/mm2、大約90ng/mm2、大約100ng/mm2或甚至更高的密度。尤其優選的是上述密度指為抗體或抗體片段的親和分子。還優選地是被固定在分離表面上的親和分子的結合能力實質上不受到聯結方法影響。固定至分離表面後，親和分子(例如抗體或抗體片段)保留聞於50%、優選聞於60*%、聞於70(%、聞於80(%、聞於90%且更優選聞於95%的它們對靶分子的原始結合能力，即對未固定的靶的結合能力。基於親和分子的能力選擇本發明的親和分子(例如抗體或該抗體來源的抗原結合片段)，以顯示選擇性結合至靶細胞(例如對腫瘤細胞)。如本文所使用的，選擇性結合意味著相對於結合至樣品中的非靶細胞，親和分子結合至靶細胞強至少約4倍、通常超過約5倍、超過約6倍、超過約8倍、超過約10倍，超過約15倍、超過約20倍、超過約50倍，或甚至超過約100倍，如例如通過親和分子/靶配體對的Kd值所反映。例如，當在本發明的方法中使用全血樣品，親和分子應不顯示出對在本發明步驟(a)中獲得的濾液中存在的白細胞的任何實質結合。在另一方面中，分離表面上的親和分子可為受體、凝集素、配體或其功能部分。此 夕卜，可採用對靶細胞上的結構具有低親和性的親和分子。雖然僅有一種相互作用將通常不會足以在分離過程中穩定，但在一個細胞與分離表面的接觸區域上分布的幾個弱相互作用的合作效應導致足夠強的特異性相互作用。這對現有技術基於納米顆粒的分離技術狀態而言是顯著有利的，因為那些顆粒的相對小的表面積太小以至於不能實現這樣的合作機理。在優選實施方式中，要富集和/或分離的靶細胞是經由抗體或其片段結合至分離表面(例如水凝膠包被的支撐表面)的播散的腫瘤細胞，其中抗體或其片段對於這些腫瘤細胞的細胞表面標記具有特異性結合親和力。播散的腫瘤細胞的適合的表面標記在本領域是公知的，包括表皮生長因子受體(EGFR)、表皮細胞粘附分子(EpCAM或CD326)、胰島素生長因子-I受體(IGF-IR)、表皮生長因子受體2 (Her2)、細胞角蛋白19 (CK19)、細胞角蛋白20(CK20)、粘蛋白I (MUCl)、粘蛋白2 (MUC2)、人表皮膜抗原(EMA)、表皮抗原(Ber_EP4)、葉酸受體a (FR α ) 0在文獻中廣泛討論了另外的標記,例如參見Pantel等(2008), NatureReviews,8,1-12 ;Pantel 等(2009), Nat Rev Clin Oncol. ,6(6) :339-51。因此，在本發明的方法中用作親和分子的抗體包括抗-EpCAM的抗體，諸如抗體克隆323A3(可從Kamiya Biomedical Company獲得，西雅圖，美國)、抗體克隆MK-1-25 (可從Acris獲得，黑爾福德,德國)、抗體克隆AUAl (可從Novus Biologicals獲得,利特爾頓，美國)、抗體克隆158206(可從R' n' DSystems GmbH獲得，威斯巴登，德國)、抗體克隆528 (可從Santa Cruz Biotechnology Inc.獲得，海德爾堡，德國)；抗-IGF-1R的抗體，諸如CP-751，871(可從Pfizer Pharma AG獲得，柏林，德國)；抗-⑶19的抗體，諸如可從 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Heidelberg, Germany)獲得的那些抗體，被稱為產品編號為 sc-70563、sc-18895、sc-70560、sc-70559、sc-70561、sc-21714、sc-65295、sc-52311 λ sc-69736、sc-65255、sc-8498、sc-52378、sc-20922、sc-18884、sc-18894、sc-19650、sc-51529、sc-8500-R、sc-13507、sc-53191、sc-8499、sc-18896 和 sc-69735)；抗-MUCl的抗體，諸如可從Santa Cruz Biotechnology Inc.(海德爾堡，德國)獲得的那些抗體，被稱為產品編號為 sc-71611、sc-71610、sc-71612、sc-71613、sc-59931、sc-71614、sc-59794、 sc-59795、 sc-59796、 sc-59797、 sc-52347、 sc-6827、 sc-53376、 c-59798、sc-52085、 sc-59799、 sc-53377、 sc-6826、 sc-59793、 sc-59800、 sc-15333、 sc-25274、sc-53379、 sc-52086、 sc-52087、 sc-52088、 sc-52089、 sc-52090、 sc-52091、 sc-52092、sc-52093、 sc-6825、 sc-53380、 sc-73595、 sc-53381、 sc-56441、 sc-65589、 sc-65220、sc-69644、sc-73606、sc-80889、sc-73605、sc-7313、和 sc-52094 ;抗-MUC2 的抗體，諸如可從Santa Cruz Biotechnology Inc.(海德爾堡,德國)獲得的那些抗體，被稱為產品編號為 sc-59859、sc-7314、sc-15334、sc-23170、sc-23171 和 sc-13312 ;抗-CK19 的抗體，諸如可從Santa Cruz Biotechnology Inc.(海德爾堡,德國)獲得的那些抗體，被稱為產品編號為 sc-53258、sc-53257、sc-33110、sc-33120、sc-25724、sc-33111、sc-33119、sc-53003、和 sc-56371 ;抗-CK20 的抗體，諸如可從 Santa Cruz Biotechnology Inc.(海德爾堡,德國)獲得的那些抗體，被稱為產品編號為sc-25725、sc-17112、sc-52320、sc-70918、sc-56522、sc-56372 和 sc-58730 ;抗表皮膜抗原的抗體，諸如 DakoDeutschland GmbH (漢堡，德國)的克隆E29 ;抗表皮抗原的抗體,諸如Dako Deutschland GmbH(漢堡,德國)的克隆Ber_EP4 ;抗-egfr的抗體,諸如可從Santa Cruz Biotechnology Inc.(海德爾堡,德國)獲得的sc-120。進一步適合的抗體為例如來自Novocastra Deutschland(柏林,德·國)的抗體VU-1D9,來自Progen Biotechnik GmbH(海德爾堡,德國)的抗體Ks5+8. 22/C22,來自 Micromet (慕尼黑，德國)的抗體 A45-BB3_Cy3,來自 Enzo Life Sciences GmbH(Ldrrach,德國)的抗體Movl8/Zel。本發明還考慮上述抗體的抗原結合片段的使用。在已公開的方法的一個實施方式中，在使靶細胞與分離表面接觸之前，樣品中的靶細胞可與適合的親和分子(例如上述抗體或抗體片段)預孵育。例如，靶細胞可在初始步驟中與一種或多種針對靶細胞某些表面標記的抗體或抗體片段預孵育。分離表面包括固定的親和分子，該親和分子反過來針對用於預孵育的親和分子。例如，當用於樣品中靶細胞的預孵育的親和分子是小鼠抗體時，則適合的分離表面應包括抗小鼠的抗體或其片段，其中抗小鼠的抗體或其片段捕獲已在預孵育步驟中連接至靶細胞的小鼠抗體。可使用相同的原理使包含靶細胞的樣品與針對各靶細胞特異的表面抗原的生物素化的抗體(諸如生物素化的IgG抗體)預孵育。可通過使用分離表面來捕獲這些標記的抗體，其中分離表面被修飾以包括選擇性結合至抗體的生物素殘基的親和分子(諸如鏈黴親和素)。優選地，在預孵育步驟後從樣品中去除任何未結合的生物素化的抗體，例如通過本發明的方法的過濾步驟。在使從殘留物中獲得的細胞與分離表面接觸後，在適於使細胞與它們對應的親和分子結合的條件下使細胞與分離表面孵育。取決於分離表面的性質和所選擇的用於捕獲靶細胞的親和分子，孵育條件可發生變化。技術人員將容易地確定要適用於給定分離表面的最佳參數。例如，孵育時間可在大約5分鐘至大約10小時之間變化,但一般應在大約30分鐘和大約8小時之間，優選在大約2小時和大約6小時之間的範圍內，例如3小時、4小時或5小時。溫度應在大約10°C至大約40°C、優選從大約20°C至大約40°C、更優選從大約32°C至大約36°C的範圍內。在尤其優選的方面，包含靶細胞的樣品的孵育應在室溫(例如在22°C至25°C )進行。在本發明的簡單實施方式中，例如通過移液管將包含從過濾步驟獲得的殘留物的液體等分試樣轉移至分離表面上，且隨後進行孵育。包含殘留物的液體等分試樣一般應具有O. 5ml和8ml之間的體積，例如大約lml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml或7ml。如果需要，可使用上面討論的緩衝液稀釋上述等分試樣以得到10ml、20ml、20ml、30ml、40ml或50ml的體
積。孵育沒有必要必需包含分離表面的搖動。但是分離表面的搖動對於改善靶細胞與分離表面的結合是優選的。例如，當分離表面是基本平整的載片時，可通過將載片放置在Petri培養皿或細胞離心管中進行孵育，其中Petri培養皿或細胞離心管以O. 2rpm至60rpm、優選在IOrpm至20rpm之間(例如15rpm)的旋轉速度在搖動平板搖床上搖動。可選擇地，分離 表面可在包含從過濾步驟獲得的殘留物的液體等分試樣中緩慢地旋轉，或分離表面可被放置在填充有所述液體等分試樣的旋轉管中。另一種選擇是(如果需要重複地)使樣品在平的、可選擇的傾斜的(例如大約30°至40°，優選大約35° )分離表面(例如包被的載片)上流動。在這樣的實施方式中，載片的表面可部分或完全浸入在適合的生理緩衝液(例如參見在上面與樣品稀釋有關的上下文中定義的緩衝液)中。由於樣品中的細胞具有比緩衝液大的比重，因此細胞將沿著傾斜的分離表面流進裝置底部的方向。在本發明的甚至更優選的實施方式中，孵育在流過式(flow-through)裝置(例如圖10中所示的裝置)中進行。在包被的顆粒的情況中，例如在低速旋轉的孵育器上的封閉的管中，顆粒懸浮液與純化的樣品混合且輕輕搖動。已在允許親和分子與靶細胞結合的條件下孵育上述細胞和分離表面後，去除任何未結合的細胞和未結合的材料。這通過使分離表面與所述未結合的細胞和材料分離來實現。優選地，該步驟還包括使用適合的洗滌緩衝液(諸如在上面與樣品稀釋有關的上下文中提到的等滲緩衝液)洗滌分離表面。根據本發明，能分離處於天然狀態的靶細胞，這樣允許細胞後續的下遊處理。例如，通過上述方法分離的細胞可被培養在標準細胞培養液中。這對於例如可在分離後進行進一步表徵的腫瘤細胞是特別的優點。作為另一優點，與根據現有技術中已知的方法分離的細胞相比，通過本文公開的方法獲得的細胞示出未受損害的細胞形態。如圖7所示，使用普通基於磁性顆粒的系統(例如Veridex)分離的細胞易於喪失細胞的球形形狀。結果，由於細胞核的丟失、不規則的漿-核比以及對用於抗體檢測的標記染色呈陽性的細胞碎片的出現，而使很多細胞不能確定，從而導致假陽性的結果。相反，由於上述細胞沒有聯結至任何鋒利邊緣的顆粒而是結合至在大分子頂部浮動的柔軟的表面，因此通過本發明的方法捕獲的腫瘤細胞的球形形態沒有改變。在又一方面中，本發明涉及一種用於樣品中的靶細胞的檢測和/或定量的方法，所述樣品包括紅血球和/或血小板。所述方法包括a)進行上面與靶細胞分離和/或富集有關的上下文中所描述的方法；以及b)通過適合的方式檢測和/或定量靶細胞。用於檢測已被捕獲的靶細胞的方法在現有技術中是公知的。例如，這些方法可基於對要檢測和/或定量的靶細胞是高度特異的標記分子(例如表面蛋白或糖結構或核酸序列)的檢測。適合的標記分子的選擇應依賴於特定的靶細胞，且技術人員應毫不費力地選擇適當的標記分子和特異性結合至這些標記分子的對應的親和分子。根據進一步的方面，可通過使用可檢測的標記的親和分子(諸如可檢測的標記的抗體或抗體片段)進行靶細胞的檢測和/或定量。在檢測和/或定量步驟中使用的親和分子可為例如在本文其它地方已描述的用於固定在分離表面上的相同的分子。例如，可使用被標記的或可通過標記的二抗檢測它們自身的抗體或抗體片段。根據另一方面，靶細胞的檢測和/或定量包含可檢測的標記的DNA探針。更優選地，檢測和/或定量包括螢光原位雜交(FISH)。本領域中可獲得在完整靶細胞中使用不同長度的標記探針進行FISH分析的各種方案，例如使用特異的DNA探針檢測egfr的放大。在原位雜交測試中，常規地對要被檢測和/或定量的靶細胞進行滲透，且這些細胞的DNA被部分解鏈。然後，在適度的溫度下DNA與雜交溶液接觸以使螢光標記的探針退火，該探針對選擇用於檢測靶細胞的特定核酸序列是特異的。例如，當期望檢測和/或定量來源於血液中上皮組織的腫瘤細胞時，可使用針對egfr、HER2、PI3-激酶、c_myc、akt等的標記的核酸探針。已雜交至腫瘤DNA的探針示出egfr斑點數量大於2(例如為3、4、5、6、7、8、10或更多)，可與來自可已吸附至分離表面的白細胞的DNA(最多有2個egfr斑點)區分。常規使用一個或多個報告螢光標記FISH探針。與探針雜交後，在預定的嚴格條件或在增強的嚴格條件下洗滌靶細胞，直至獲得適當的信噪比。然後例如通過螢光顯微鏡監控雜交的探針。通過使用具有不同螢光顏色的多條核酸探針，可在分離表面上的一個步驟中進行多顏色分析(即對不同序列)。FISH測試中使用的核酸探針通常長於例如在Southern印跡中使用 的那些核酸探針。FISH探針可具有大約Ikb、5kb、IOkb、20kb、30kb、40kb、50kb、60kb或多達IOOkb的大小，或具有甚至200kb、300kb或400kb的大小。可直接標記(例如通過使用螢光染料)或間接標記(例如通過半抗原，諸如地高辛或生物素)FISH探針。根據本發明，優選使用螢光標記，這樣可直接觀察與試驗樣品(例如來源於活檢的組織的細胞)的基因組DNA的雜交結果。用於螢光標記的標記試劑盒可從不同的製造商獲得，諸如通過Vysis Inc.(丹尼森市,伊利諾斯州，美國)購買的SpectrumOrange、SpectrumGreen和SpectrumRed標記試劑盒。當然，為了改善靈敏度可能組合上面用於檢測和/或定量靶細胞的方法的一種或多種。例如，檢測和/或定量可基於螢光原位雜交和基於抗體的檢測的組合方法，如下面在實施例中所描述的。根據一個方面，靶細胞的檢測和/或定量包含PCR，優選包含實時定量PCR(Real-Time PCR)。在該方法中，使用針對常用於各靶細胞的標記基因的引物以擴增指示樣品中這些細胞豐度的產物。例如，如果靶細胞是腫瘤細胞(諸如播散的腫瘤細胞)，則可使用上面討論的一種或多種編碼特異性細胞表面標記的基因作為PCR擴增的模板。對於播散的腫瘤細胞，編碼表面標記的適合的基因是編碼例如表皮生長因子受體(EGFR)、表皮細胞粘附分子(EpCAM或CD326)、胰島素生長因子-I受體(IGF-IR)、表皮生長因子受體2(Her2)、細胞角蛋白19 (CK19)、細胞角蛋白20(CK20)、粘蛋白I (MUCl)、粘蛋白2 (MUC2)等的那些基因。在特別優選的方面，針對不同標記基因的引物組合被用於靶細胞的檢測和/或定量。此外，可使用雙色光聲法實現腫瘤細胞的檢測。從而，作為第二對比劑的鍍金碳納米管的使用允許多重檢測(見例如Galanzha等(2009), Nat. Nanotechnol. 4, 855)。下面參考附圖更詳細地解釋本發明優選實施方式的示例性的優點方面。


圖I示出了表達EGFR的乳腺腫瘤細胞系MDA_MB_468在部分抗體衍生的水凝膠表面上的培養，其中MDA-MB-468存在於人血清中。左抗EGFR-IgG功能化的水凝膠表面。右上角空白的水凝膠表面(對照)。圖2示出了在聚羧酸鹽(HC)表面(有抗體和沒有抗體)上來自不同製劑的白細胞的非特異性結合(NSB)的比較。通過a)密度梯度離心或b)、c)細胞篩選從全血中製備白細胞部分。孵育在Cytospin離心管中、包含O. 96 I. 15X IO6個細胞的2ml PBS中使用EpCAM修飾的HCX-載片(XanTec bioanalytics GmbH,杜塞道夫,德國)和無反應性的HC-載片(XanTec bioanalytics GmbH,杜塞道夫,德國)進行。圖3示出了可在本發明的方法中優選使用的水凝膠包被(coating)的示意性描繪。襯底(3)包被有附著促進層(2)和親水聚合物(I)，其中親水聚合物(I)具有刷狀結構。親水聚合物(I)被垂直設置於襯底表面，以便許多的官能團(4)可用於親和分子的固 定。圖4示出了用於進行過濾步驟的裝置的實施方式的示例性示意圖。圖5示出了用於進行過濾步驟的裝置的另一實施方式的示例性示意圖。圖6示出了在使用抗體修飾的水凝膠載片進行親和分離後MDA-468腫瘤細胞的回收率。圖7示出了在不同的細胞分離過程後細胞形態的對比汸和B :被Veridex系統捕獲的腫瘤細胞被抗EpCAM抗體包被的磁性顆粒和聚集的血小板圍繞；被捕獲的細胞的球形形態消失；C :在抗EpCAM抗體包被的HC-載片上捕獲的腫瘤細胞。圖8示出了用於進行過濾步驟的裝置的又一實施方式的示例性示意圖。圖9a示出了使用圖8的裝置進行過濾步驟的第一方法。圖9b和圖9c示出了使用圖8的裝置進行過濾步驟的第二方法。圖10示出了用於進行分離步驟的裝置的實施方式的示例性示意圖。圖Ila和圖Ilb示出了用於進行分離步驟的裝置的另一實施方式的示例性示意圖。
具體實施例方式圖4中，用於進行過濾步驟的裝置包括樣品儲液器1，其中樣品儲液器I用於接收和容納可能包含靶細胞的稀釋或未稀釋的樣品。儲液器I具有出口孔2，在運行中，樣品通過出口孔2離開儲液器I而進入導管3。如圖4中所示，出口孔2優選被設置在儲液器I的底部中，且優選布置儲液器I和導管3以便通過重力實現或至少通過重力輔助樣品從儲液器I至導管3的傳送以及樣品在導管3內的運動。在附圖的全部現有描述中，術語諸如「底部」和「頂部」涉及附圖中示出的方向。除了儲液器I之外，可選擇地可提供另外的儲液器4用於接收和容納可用於稀釋樣品的溶液或緩衝液。儲液器4具有出口孔5，在運行中，溶液通過出口孔5離開儲液器4而進入導管6。同樣地，出口孔5優選被設置在儲液器4的底部，且優選地布置儲液器4和導管6以便通過重力實現或至少通過重力輔助樣品從儲液器4至導管6的傳送以及導管6內的樣品的運動。導管6連接至導管3以便樣品和溶液可混合。布置導管3的傳送端7，以便可選擇地與來自儲液器4的溶液混合的樣品可被連續地、不連續地或間歇地供應至大致為圓柱形的濾器組件8，濾器組件8被設置在容器9內。濾器組件8在它的底部縱向端包括板10並在它的上部縱向端包括環狀物11。板10和環狀物11通過多個縱向的杆(圖中未示出)相互連接。圍繞杆的裝置將薄片狀的濾器元件12設置為環形閉合的，以便濾器元件12形成圓柱形的濾器組件8的圓周表面。在這點上，還可能為通過將濾器元件12連接至每個杆的徑向內面，薄片狀的濾器元件12在這些杆限定的空間內部被設置為環形閉合的。板10和環狀物11可具有例如圓形、橢圓形、正方形、矩形、六邊形或其它形狀，同時圓柱形的濾器組件8具有對應的橫截面形狀。藉助於該結構，從導管3的傳送端7注入的樣品可通過環狀物11的開口進入濾器組件8，且濾液通過濾器元件12離開濾器組件8並被收集在容器9中。另一導管13被設置為例如連接至容器9的底部，例如通過重力的影響或通過使用合適的泵或抽吸設備可通過導管13從容器9移除濾液。提供另一容器14用於收集從容器9移除的濾液。在運行中，控制樣品進入濾器組件8的流動和/或從容器9移除濾液的速率，以便濾器組件8內的液體表面15的絕對水平高於容器9內的液體表面16的水平。以這種方 式，在濾器元件12的兩側有利地保持了流體靜壓力差，該流體靜壓力差迫使濾液通過濾器元件12。可選擇性地提供氣體導管17，用於向濾液中導入氣體，以在液體內有利地產生運動。在圖5示例性示出的可選擇的實施方式中，用於進行過濾步驟的裝置是錯流過濾裝置20。以通常的方式，錯流過濾裝置20包括彼此平行延伸且彼此接觸的兩個導管21、22，且濾器元件23被布置在導管21、22的側壁中的對齊的開口中以便液體能夠經由兩個導管21、22之間的濾器元件23穿過。在運行中，稀釋或未稀釋的樣品流24被導入導管21的一端，以便樣品流24切線地穿過濾器元件23。將生理介質的反向流25導入導管22的相反端，以便生理介質的反向流25切線地穿過濾器元件23的相反面。通過保持導管21內的較高的壓力，迫使濾液通過濾器元件23進入導管22，以便滯留物26離開導管21且濾液和生理介質的混合物27離開導管22。圖8中示例性示出了用於進行過濾步驟的裝置的又一可選擇的實施方式。在示出的實施方式中，該裝置30包括具有立方體形狀的兩個主體31和32。設置主體31和32，以便主體31和主體32的表面38a和38b分別彼此平行地延伸且彼此具有距離。以這種方式，在兩個主體31和32之間存在間隙或間隔39。在每個表面38a和38b中，凹槽31a和32a分別形成於各主體31和32中。在示出的實施方式中，凹槽31a和32a同樣具有立方體形狀。凹槽31a和32a的開口彼此面對，且被適當地設置在主體31和32之間的間隔39中的公共濾器元件33封閉。為了確保凹槽31a和32a的密封，濾器元件33可被承載在具有環形結構且提供有適當的密封元件的框架33a中，其中密封元件密封地嚙合表面38a和38b且圍繞凹槽31a和32a的開口。兩個導管34和36從凹槽31a延伸且從與表面38a相對的表面40a伸出，且兩個導管35和37從凹槽32a延伸且從與表面38b相對的表面40b伸出，這些導管34、35、36和37允許流體導入凹槽31a和32a的內部且允許從凹槽31a和32a內部移除流體。因此，通過適當地導入通過例如導管34的稀釋或未稀釋的樣品流和通過例如導管37的生理介質流，原則上有可能利用該裝置30以類似於參考圖5所描述的情況進行錯流過濾。
但是，圖8示出的裝置30尤其有利於進行過濾的兩種不同方法。圖9a中示例出了第一種方法，其中裝置30不移動，但被調整了方向，以便濾器元件33和間隔39在垂直平面上延伸。為了進行有效的過濾，首先凹槽31a和32a均被緩衝液填充至內部凹槽體積的約50%的水平。隨後，稀釋或未稀釋的樣品通過例如導管35被導入凹槽32a，從而相對於凹槽31a內的液體水平而升高了凹槽32a內的液體水平。以這種方式，在濾器元件33的兩側產生流體靜壓力差，該流體靜壓力差迫使濾液通過濾器元件33。當然還可能使用緩衝液和樣品直接填充凹槽32a至適當的水平。圖9b和9c中示例出了第二種方法，其中裝置30進行搖擺運動且被初始定向，以便濾器元件33和間隔39在水平平面內延伸。首先，凹槽31a和32a也均被緩衝液填充至內部凹槽體積的約50%的水平。隨後，稀釋或未稀釋的樣品通過例如導管35被導入凹槽32a中。從圖9b示出的水平定向開始，通過在兩個相反的方向使裝置30交替地傾斜而使裝置30進入優選的緩慢的搖擺運動，如圖9c示例的。優選最大的傾斜角度為25°。在裝置 30的搖擺運動的過程中呈現的傾斜位置處，兩個凹槽31a和32a中的液體體積通過濾器元件33的部分彼此接觸。由於搖擺運動，接觸的區域經過濾器元件33的整個表面區域。利用搖動搖床(rocking shaker)可有利地實現搖擺運動。圖10示出了用於使通過過濾步驟產生的滯留物與分離表面接觸的裝置50的橫截面圖。裝置58包括具有分離表面52的優選為矩形的載片51。進一步地，裝置50包括兩個主體53和54，主體53和54在示例的實施方式中為立方體形狀。在下主體54的上表面55中提供凹槽56，使凹槽56具有接收載片51及環形的密封元件59的形狀和尺寸，且以便至少密封元件59輕微地突出於表面55。對應的凹槽57被提供在上主體53的下表面58中。當兩個主體53和54彼此連接，同時兩個表面55和58彼此鄰近且彼此平行地延伸(如下面將詳細解釋的那樣)時，使後一凹槽57具有相配地接收從下主體54的表面55突出的密封元件59的部分的尺寸和形狀。在運行時，載片51位於凹槽56內部，且環形的密封元件59位於載片51的頂部。使該密封元件59具有如下尺寸和形狀，以使密封元件59在其邊緣區域環繞地嚙合載片51的上分離表面52。然後主體53以這樣的方式被放置在主體54的頂部以便環形的密封元件59被接收在凹槽57內部，且兩個主體53和54利用例如螺釘彼此穩固地固定；其中通過分別在主體53和54中的多個對應的孔60和61導入螺釘。使凹槽56和57具有如下尺寸，使得在該位置上，載片51的分離表面52與凹槽57的內壁62相距3 500 μ m。在上主體53中，兩個通孔提供為分別具有大直徑部分63a和63b，且分別具有小直徑部分64a和64b。小直徑部分64a和64b通向凹槽57。因此,有可能在運行中通過通孔63a、64a將滯留物在凹槽57的一端導入凹槽57，且在凹槽57的相對端經由通孔63b、64b從凹槽57移除濾液，同時滯留物沿分離表面52流動且與分離表面52接觸。由於分離表面52和凹槽57的內壁62之間的狹窄的間隔，流動基本上且有利地為層流。如圖Ila和Ilb示例性示出的，能將滯留物同時填充入通孔63a、63b和64a、64b，且使裝置進入搖擺運動。在這些附圖中，為了減少死體積，通孔63a、63b和64a、64b具有圓錐形的形狀。實施例實施例I
包含腫瘤細胞的試驗樣品的製備在未進行透化作用的情況下，使用4,6-二脒基-2-苯基π引哚(DAPI, Pierce/ThermoScientific)對已培養的來源於人乳腺癌的MDA-468細胞進行預染色。DAPI是結合至富含腺嘌呤-胸腺嘧啶的DNA的陽離子螢光染料。DAPI通常用於染細胞核。可通過視覺檢測或適當的自動設備對染色的細胞進行計數。使用達爾伯克改良伊格爾培養液(DMEM)清洗上述細胞兩次以移除多餘的染料。為了發螢光控制預染色細胞的每次懸浮。人工計數出人全血樣品中等量的腫瘤細胞，該人全血樣品通過靜脈穿刺從健康供血者收集在具有EDTA以防止凝固的收集管中。從收集開始4小時內使用這些血液樣品。為了進行回收試驗，將上述腫瘤細胞稀釋至每100 μ I的細胞數量在50和500個細胞之間以最小化稀釋和計數錯誤。實施例2用於細胞篩選的織物的製備 分離輸血套裝的濾器(Sarstedt AG & Co ；74. 4255)，且移除織物濾器。通過使用膠粘劑將具有 Iym 目徑的織物片(Sefar AG, Sefar Nitex 03-5/1，Sefar Petex 07-5/1)固定在濾器架(fliter rack)上。當將該織物固定至濾器架上後，在真空中移除源自膠粘劑的任何剩餘的溶劑達30分鐘。使用來自通過在濾器架總體積上離心500ml血液獲得的血沉棕黃色層的單核細胞的細胞懸浮液進行檢漏測試(leak test)。通過使用雙面醫用膠帶(50 μ m厚)將這樣製備的濾器架固定在燒杯的中間，以便濾器架的封閉的底部與燒杯的底部接觸。實施例3紅血球和血小板從樣品中的移除優選對在實施例2中製備的濾器架進行預溼以防止細胞至濾器構件的初始的非特異性粘附。因此，將10 15ml體積的生理等滲緩衝液加至濾器架。過濾在如圖4所示的結構中進行。通過導管將緩衝液施加至圓柱形濾器架的中心，其中導管定位於濾器架的開口上方I 2cm處。使用螺動泵設置lml/min的流速。如在實施例I中製備的在加入(spike in)實驗中每ml包含10 120個MDA-468細胞的血液樣品(室溫搖動下儲存24小時)以100 200 μ Ι/min的流速通過第二導管被施加至濾器架。通過這種方式，可獲得稀釋率大約為I : 5 I : 10的血液樣品。由於織物濾器元件的狹窄的目徑，在濾器架的內部隔室中的液體的彎液面高於圍繞濾器架的燒杯中的彎液面(見圖4)。產生的壓力導致紅血球和血小板的移除，其中紅血球和血小板穿過織物濾器元件的網孔並在燒杯中富集。為了保持燒杯中的彎液面，連接至蠕動泵的廢物導管被固定在燒杯的底部。廢物導管的流速被計算為樣品導管和緩衝液導管的流速的總和。當已施加了預定體積的全血樣品後，終止緩衝液至濾器架的添加。由於緩衝液通過廢物導管連續排出，濾器元件中的液體體積也同樣減少。當濾器元件中的剩下體積大約為I 3ml的細胞懸浮液時終止排出。然後用移液管將滯留的細胞懸浮液移至反應管。為了確保將濾器裝置中的所有細胞轉移至孵育室，用2ml的PBS洗滌濾器元件的內面5次，然後用移液管將洗漆後的PBS移至反應管。在使反應管在800rpm旋轉減慢2分鐘。丟棄9ml的上清液，且將具有剩餘體積的細胞團重懸在Iml的PBS中用於隨後轉移至水凝膠載片。
實施例4用於淘金的水凝膠包被的載片的獲得使用20 μ I 的 250 μ g/ml 抗-EpCAM/Trop-l 抗體溶液(AF960 ；RnD Systems,明尼阿波利斯，美國)覆蓋預活化的聚羧酸酯水凝膠載片(SL-HCX-5, XanTec BioanalyticsGmbH，杜塞道夫，德國)。在聯結前，該抗體用5mM乙酸鈉溶液(pH5. O)透析。在環境條件(室溫和相對溼度為50 75% )下乾燥抗體溶液，且乾燥後在所述條件下將該溶液進一步孵育另外20min。在下一步驟中，在溫和搖動的條件下整張載片被放置在Petri培養皿中，且被IM乙醇胺溶液(pH8. 5)覆蓋20min。使用磷酸鹽緩衝鹽水在Petri培養皿中搖動下進行兩次洗滌步驟，每次lOmin，以除去殘留的乙醇胺。為了隨後的儲存，載片用蒸餾水漂洗且在快速的氮氣流中乾燥。以這種方式製備的載片準備好與在實施例I 3中獲得的包含MDA-468細胞的血液來源的細胞懸浮液進行孵育。可選擇地，為了提供具有特別低的非特異性結合的非癌症細胞(例如血液白 細胞)的背景的用於淘金的水凝膠包被的載片，可將水凝膠載片(SL-HCX-5，XanTecBioanalytics GmbH,杜塞道夫,德國)放置在Petri培養皿或合適的載片架中。在使用前即刻製備具有O. 01 O. 025% (w/v)EDC的O. 5M MES,O. 05MNHS的活化溶液。使用該活化溶液覆蓋水凝膠載片，且在溫和搖動的同時孵育5分鐘，隨後在2mM乙酸中孵育至少30秒。然後用蒸餾水漂洗載片，且在快速的氮氣流中或通過離心乾燥。與上述HCX載片相比，根據該活化步驟製得的載片具有較低量的在水凝膠中形成的反應性琥珀醯亞胺酯，且由此對生物分子(例如抗體)具有較低的固定容量，該固定容量在孵育過程中減少非特異性結合的白細胞的背景。可如上面結合SL-HCX-5載片描述的那樣進行使用抗體對水凝膠的修飾。實施例5水凝膠表面上的腫瘤細胞的孵育然後將2ml上述實施例3中獲得的MDA-468細胞懸浮液轉移至細胞系統(cyto-system) (Hettich AG，德國)孵育室，在該孵育室中抗體包被的載片(SL-HCX-5，XanTec Bioanalytics GmbH，杜塞道夫，德國)已被安裝在上述細胞系統中。調整具有5°傾斜角度的搖動的平臺搖床(Heidolph Duomax 1030)為2循環/分鐘。細胞在室溫下孵育超過4小時。孵育後，丟棄上清液。在下面的洗滌步驟中，用移液管將2ml PBS移至孵育室中。在室溫下孵育4小時後，丟棄PBS緩衝液，且重複洗滌一次。實施例6篩選後回收率的確定將來自如實施例I所述的健康志願者的15ml血液分成5ml的等分試樣。將110(+/-2)個MDA-468細胞加入每個等分樣品中。如實施例3中所述的，使用三個等分樣品中的每一個進行篩選。篩選後，在濾器架中剩餘大約2ml殘餘體積的細胞懸浮液。然後小心地將包含細胞懸浮液的濾器架從燒杯中取出並轉移至細胞離心系統(Hettich)，以便濾器架子的開口以載玻片的方向定向；其中使用超冷凍載玻片根據製造商的指導說明製備細胞離心系統。通過突光顯微鏡(Ariol Platform,Genetix Ltd. New Milton,漢普郡，英國)人工或和自動地進行預染色腫瘤細胞的檢測。回收率達到99 100% (見下面的表I)。表I:篩選後的回收率
權利要求
1.一種用於樣品中的靶細胞的富集和/或分離的方法，所述樣品包括紅血球和/或血小板，所述方法包括 (a)通過具有尺寸在O.5 μ m和5 μ m之間的孔的濾器元件過濾所述樣品； (b)使被步驟(a)中的所述濾器元件保留的細胞與分離表面接觸，其中所述分離表面包括選擇性結合至所述靶細胞的親和分子； (c)在允許所述親和分子與所述靶細胞結合的條件下，孵育所述細胞和所述分離表面；以及 (d)將所述分離表面與任何未結合的細胞和材料分離。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述濾器元件的孔徑在1μ m和2 μ m之間。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述濾器元件是織物。
4.根據權利要求1 3中任一項所述的方法，其中所述靶細胞是腫瘤細胞。
5.根據權利要求1 4中任一項所述的方法，其中所述樣品包括全血、尿液、胸腔積液、腹水、支氣管肺泡灌洗液、女性乳房腺體的乳頭抽吸液或骨髓樣品。
6.根據權利要求1 5中任一項所述的方法，其中所述分離表面是在支撐材料上的包衣，諸如水凝膠包衣。
7.根據權利要求6的任一項所述的方法，其中所述支撐材料是載片、珠子或層析樹脂。
8.根據權利要求1 7中任一項所述的方法，其中所述親和分子是抗體、抗體的抗原結合片段、配體、凝集素或受體或適體。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述親和分子是從由抗-EpCAM的抗體、抗-EGFR的抗體、抗-CD19的抗體、抗-CK20的抗體、抗-MUCl的抗體、抗-MUC2的抗體，或它們的抗原結合片段所組成的組中選擇的抗體。
10.根據權利要求1 9中任一項所述的方法，其中在將所述樣品施加至所述濾器元件之前或在將所述樣品施加至所述濾器元件的同時，使用適當的緩衝液稀釋所述樣品。
11.根據權利要求1 10中任一項所述的方法，其中在步驟(C)中的所述孵育包括所述分離表面的搖動。
12.根據權利要求1 11中任一項所述的方法，其中步驟(d)包括用洗滌緩衝液洗滌所述分離表面。
13.一種用於樣品中靶細胞的檢測和/或定量的方法，所述樣品包括紅血球和/或血小板，所述方法包括 c)進行根據權利要求1 12中任一項所述的方法；以及 d)檢測和/或定量所述靶細胞。
14.根據權利要求13所述的方法，其中通過使用可檢測地標記的抗體或抗體片段，或通過使用可檢測地標記的DNA探針進行所述檢測和/或定量。
15.根據權利要求13所述的方法，其中所述檢測和/或定量包含PCR，優選包括實時定量 PCR。
16.根據權利要求13所述的方法，其中所述檢測包含雙色光聲技術。
全文摘要
本發明涉及一種用於樣品中的靶細胞的富集和/或分離的方法，所述樣品包括紅血球和/或血小板，所述方法包括(a)通過具有孔徑或目徑在0.5μm和5μm之間的濾器元件過濾所述樣品；(b)使被步驟(a)中的所述濾器元件保留的細胞與分離表面接觸，其中所述分離表面包括選擇性結合至所述靶細胞的親和分子；(c)在允許所述親和分子至所述靶細胞的結合的條件下，孵育所述細胞和所述分離表面；以及(d)將所述分離表面與任何未結合的細胞和材料分離。
文檔編號G01N33/49GK102892900SQ201180012177
公開日2013年1月23日 申請日期2011年3月1日 優先權日2010年3月2日
發明者N·丹克巴, B·布蘭特, E·T·哥迪 申請人:漢堡大學醫院埃佩多夫公司