一種赭色小莫勒菌發酵生產脂肪酶的培養基及方法

2023-09-17 10:44:00 2

一種赭色小莫勒菌發酵生產脂肪酶的培養基及方法
【專利摘要】本發明涉及真菌的發酵培養基及工藝。更具體地，本發明涉及一種赭色小莫勒菌發酵生產脂肪酶的培養基及方法。所述培養基的原料含有胰蛋白腖0.5g/L，α-乳糖2.5g/L，Zn2+1.3g/L，VB40.1g/L，乳化橄欖油50g/L(誘導產生脂肪酶），培養基初始pH=7.1。該方法通過將發酵種子液接種於上述產脂肪酶的培養基中培養，250mL的三角瓶裝液量為75mL，接種量10%，於25℃，轉速120r/min下培養。本發明的發酵方法有發酵周期短；條件溫和，易於控制；提供的用於赭色小莫勒菌發酵生產脂肪酶的培養基，具有脂肪酶產率高，脂肪酶活力高等優點。
【專利說明】一種赭色小莫勒菌發酵生產脂肪酶的培養基及方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及真菌的發酵培養基及工藝。更具體地，本發明涉及一種赭色小莫勒菌發酵生產脂肪酶的培養基及方法。
【背景技術】
[0002]莫勒菌(Moelleriella)系昆蟲病原真菌的重要成員，由於它能殺死粉風和介殼類昆蟲而控制種群數量，這使得它能成為有效的生物防治劑。隨著研究的不斷推進，近年來人們發現莫勒菌的代謝產物具有殺蟲、抑菌、抗腫瘤和抗瘧原蟲等活性，這表明該菌在生物農藥或醫藥上具有很大應用價值。[0003]脂肪酶(Lipase，E.C.3.1.1.3，甘油三酯水解酶)，能在油水界面催化甘油三酯形成甘油二酯、甘油單酯或甘油及游離脂肪酸脂肪酶系一類分解和合成脂肪的酶。脂肪酶不但能夠催化酯水解反應而且能催化酯合成反應和轉酯反應。微生物脂肪酶比動物脂肪酶解作用的PH和溫度範圍更為寬泛，以便工業化生產獲得高純度酶製劑。脂肪酶廣布於微生物界，據不完全統計，迄今有65屬微生物能夠產生脂肪酶。伴隨微生物脂肪酶研究的不斷深入，發現了多種具有不同酶學性質和底物特異性的微生物脂肪酶，它們在水解、酯化、轉酯及酯類手性合成等反應中均表現出較好應用前景。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在於提供一種赭色小莫勒菌發酵生產脂肪酶的培養基及方法。
[0005]本發明首先提供了一種赭色小莫勒菌發酵生產脂肪酶的培養基，所述培養基含有胰蛋白腖0.5g/L，α -乳糖2.5g/L，Zn2+L 3g/L，VB40.lg/L,乳化橄欖油50g/L,培養基初始pH=7.1。
[0006]其次，本發明還提供了一種赭色小莫勒菌發酵產脂肪酶的方法，所述方法包含以下步驟:
Ca)將赭色小莫勒菌活化後接種到種子培養基中培養，製得發酵種子液；搖床溫度:25V 土 1°C，種子培養周期為24h。搖床溫度:25°C 土1°C。所述種子培養基含有:土豆汁200g/L，葡萄糖20 g/L ;製備方法為準確稱取已削皮切塊的土豆200g，加熱熬汁，八層紗布過濾，向土豆汁中加入20g葡萄糖,並稀釋至1000ml。
[0007](b)將步驟(a)中製得的發酵種子液按接種於所述赭色小莫勒菌發酵生產脂肪酶的培養基，250mL的三角瓶裝液量為75mL，接種量10%，於25°C，轉速120 r/min下培養。培養時間為96h。
[0008]土豆200g，加熱熬汁，八層紗布過濾，向土豆汁中加入20g葡萄糖，並稀釋至1000ml。
[0009]本發明採用的赭色小莫勒菌為赭色小莫勒菌(#oe77erii?77a ocAracea)(邱君志等，赭色小莫勒菌在中國的發現.菌物學報，2009.28 (I): 148-150)。
[0010]採用本發明優化後的培養基，菌齡ld，發酵周期4d，發酵產生結果赭色小莫勒菌產酯酶為22U/mL左右。
[0011]本發明的發酵方法有發酵周期短；條件溫和，易於控制；提供的用於赭色小莫勒菌發酵生產脂肪酶的培養基，具有脂肪酶產率高，脂肪酶活力高(22U/mL)等優點。【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為脂肪酶酶活測定的對硝基苯酚標準曲線 。
【具體實施方式】
[0012]為了使本發明所述的內容更加便於理解，下面結合【具體實施方式】對本發明所述的技術方案做進一步的說明，但是本發明不僅限於此。
[0013]實施例1
單因素實驗確定培養基最優成分
(I)種子培養基:準確稱取去皮馬鈴薯切塊200g，熬汁過濾(八層紗布)，加入葡萄糖20g，再稀釋至1000ml，分裝於250mL的三角瓶中，每個三角瓶含100mL。0.1MPa，滅菌20min。使用前可加入抗生素對培養基預處理。
[0014](2)發酵種子的製作:將_80°C冰箱中儲存的赭色小莫勒菌接種於馬鈴薯瓊脂培養基(PDA)上，於25°C下培養120h，待其產孢子，即活化；將活化後的菌株用接種針將孢子粉接種至種子培養基，25°C，轉速120 r/min下培養24h，即為種子發酵液；將富集均勻的種子發酵液以10%的接種量接種至單因素篩選培養基，250C，轉速120 r/min下培養96h，即為發酵液。
[0015](3)酶液的製備:取步驟(2)下的發酵液在4°C下，8000 r/min離心lOmin，得上清液即為粗酶液待用。按酶活性測定在在波長410nm處測定吸光值。換算成酶活單位U/
mLo
[0016](4)脂肪酶酶活測定:在pH 8.0、50 °C條件下，每Imin水解p-NPP釋放I μ mol對硝基苯酹(p-nitrophenol)所需的酶量為I個脂肪酶活力單位(U)。
[0017]方法:溶液A: 150 mg p-NPP溶於50 mL異丙醇；溶液B:500 mL pH 8.0的Tris-HCl緩衝液中加入2.22 g Triton X-100和0.56 g阿拉伯膠。
[0018]取2個試管(分別是對照管和樣品管)，各加溶液B 2.85 mL和底物溶液A 0.1 mL(緩慢混合，該溶液至少可穩定2 h)。50 °C水浴中預熱5 min，然後在對照管中加入已滅活的酶液0.05 mL，樣品管中加入酶液0.05 mL，立即混勻計時。在水浴中準確反應10 min時馬上測定410 nm下酶水解產生的p-nitrophenol的吸光度值(OD41t!值)。酶活力(U/g或U/mL) =AXKXVXn/(tXm) (A為樣品的吸光度；K為吸光常數；V為反應試劑的總體積；n為酶液的稀釋倍數；t為反應時間；m為酶液質量或體積，g或mL)。
[0019](5)標準曲線的製作:精確配製p-nitrophenol 2mmol/L標準溶液；首先在試管中加入等體積的底物緩衝液以及不同體積的異丙醇，在50°C保溫5 min，再在加入不同體積的p-nitrophenol標準液。反應10min後立即在波長410處測定吸光度。反應體系為2.5mL(p-nitrophenol和異丙醇0.25mL，底物緩衝液為2.25mL)。每個濃度做3平行實驗，為空白對照。在波長410nm處測定吸光值，以OD41tl值為橫坐標,p-nitrophenol含量為縱坐標繪製標準曲線。，經統計處理得到的線性回歸方程，y=45.592x, R2=0.9940，結果見圖1。
[0020]標準曲線製作表格如下:
【權利要求】
1.一種赭色小莫勒菌發酵生產脂肪酶的培養基，其特徵在於，所述培養基含有胰蛋白腖0.5g/L，α -乳糖 2.5g/L，Zn2+L 3g/L,VB40.lg/L，乳化橄欖油 50g/L，培養基初始pH=7.1。
2.一種赭色小莫勒菌發酵產脂肪酶的方法，其特徵在於方法包含以下步驟: (a)將赭色小莫勒菌活化後接到種子培養基中培養，製得發酵種子液； (b)將步驟(a)中製得的發酵種子液按接種於如權利要求1所述的培養基，250mL的三角瓶裝液量為75mL，接種量為10%，於25°C，轉速120 r/min下培養。
3.如權利要求2所述的方法其特徵在於，所述種子培養基含有:土豆汁200g/L，葡萄糖。20 g/L ;所述培養條件為搖床溫度:25°C ±1°C，種子培養周期為24h。
4.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟(b)的培養時間為96h。
【文檔編號】C12R1/645GK103540577SQ201310440716
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月25日 優先權日:2013年9月25日
【發明者】邱君志, 塗潔, 李小霞, 孟麗雪, 曹麗萍, 何肖雲, 郭慶豐, 董冬, 張以盼, 姚靈丹 申請人:福建農林大學