壓力負荷恢復促進用藥物組合物以及新型松蕈株的製作方法

2023-09-17 08:04:30

專利名稱：壓力負荷恢復促進用藥物組合物以及新型松蕈株的製作方法
技術領域：
本發明涉及壓力負荷恢復促進用藥物組合物以及新型松蕈株。本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物不僅能夠作為藥品給予，而且也能夠以各種形態，例如作為功能性食品或健康食品(包括飲料)或者飼料以飲食品的形態給予。而且，也能夠以口腔衛生用組合物，例如雖然暫時含在口中，但幾乎將其全部從口中吐出的形態，如刷牙劑、漱口劑、口香糖或含嗽劑的形態給予，或者以由鼻腔吸入的吸入劑形態給予。
而且，本發明人已經發現松蕈熱水提取液、松蕈的鹼性溶液提取液或者松蕈熱水提取液或松蕈鹼性溶液提取液的陰離子交換樹脂吸附級分具有免疫增強活性(特願2000-374號)。
另外，已知壓力不僅會引起身心疾病等適應社會生活的障礙，而且也能夠成為生活習慣病等發病和發展的誘因。對於處在壓力之中時身心的變化，對症治療地配製了抗焦慮藥(安定藥)或中藥，但是對於壓力所伴隨的免疫功能變化的有效處置方法可以說現在仍處於摸索過程中。在本發明人了解的範圍內，既不知道從壓力負荷中解放出來後，顯示促進免疫力自發恢復作用(即壓力負荷恢復促進作用)的食品，也不知道食品中存在顯示上述壓力負荷恢復促進作用的物質。
本發明人對松蕈悉心探索了已知的上述抗腫瘤活性或免疫增強活性以外的其他生理活性，新發現松蕈中含有顯示上述壓力負荷恢復促進作用的活性成分。另外，悉心探索了本發明人發現的新型松蕈株的生理活性，發現了含有顯示很強的上述壓力負荷恢復促進作用的活性成分的新型松蕈株。本發明是基於這些發現完成的。
另外，本發明還涉及對於壓力負荷促進恢復用的功能性食品，其中單獨含有松蕈、松蕈的熱水提取液或其乾燥體、或者松蕈的鹼性溶液提取液或其乾燥體，或者根據需要還含有1種或1種以上的食品成分。
另外，本發明還涉及對於壓力負荷促進恢復用的口腔衛生用組合物，其中含有松蕈、松蕈的熱水提取液或其乾燥體、或者松蕈的鹼性溶液提取液或其乾燥體以及口腔衛生用組合物的載體。
另外，本發明還涉及對於壓力負荷的恢復促進方法，包括將松蕈、松蕈的熱水提取液或其乾燥體、或者松蕈的鹼性溶液提取液或其乾燥體以有效量給予必需促進對壓力負荷的恢復的對象。
另外，本發明還涉及松蕈、松蕈的熱水提取液或其乾燥體、或者松蕈的鹼性溶液提取液或其乾燥體在製備對於壓力負荷促進恢復用的藥物組合物、對於壓力負荷促進恢復用的功能性食品、或者對於壓力負荷促進恢復用的口腔衛生用組合物中的用途。
另外，本發明還涉及松蕈FERM BP-7304株，或者其菌絲體、培養物或子實體。
而且，本發明還涉及松蕈FERM BP-7304株的熱水提取液或其乾燥體，或者松蕈FERM BP-7304株的鹼性溶液提取液或其乾燥體。
圖2涉及表1記載的菌編號7～11表示的公知松蕈株，是表示按照RAPD法得到的PCR產物的電泳結果的照片。
圖3涉及表1記載的菌編號12～13表示的公知松蕈株和本發明的松蕈FERM BP-7304株，是表示按照RAPD法得到的PCR產物的電泳結果的照片。
圖4涉及本發明的松蕈FERM BP-7304株，是表示按照RAPD法得到的PCR產物的電泳結果的照片。
圖5是表示本發明的松蕈FERM BP-7304株的熱水提取液乾燥物粉末與鹼性溶液提取液乾燥物粉末的比率為3.2∶5.1的混合物的壓力負荷恢復促進活性的圖。
圖6是表示本發明的松蕈FERM BP-7304株和各種松蕈株的各乾燥物粉末的壓力負荷恢復促進活性的圖。
圖7是表示其它各種松蕈株的各乾燥物粉末的壓力負荷恢復促進活性的圖。
圖8是表示其它各種松蕈株的各乾燥物粉末的壓力負荷恢復促進活性的圖。
圖9是表示其它各種松蕈株的各乾燥物粉末的壓力負荷恢復促進活性的圖。
發明的最佳實施方式以下，詳細說明本發明。
本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物含有下述物質中的至少1種作為有效成分，(1)松蕈〔例如，松蕈的菌絲體、培養物(Broth)或子實體〕，(2)松蕈的熱水提取液〔例如，松蕈的菌絲體、培養物(Broth)或子實體的熱水提取液〕或其乾燥體，或者(3)松蕈的鹼性溶液提取液〔例如，松蕈的菌絲體、培養物(Broth)或子實體的鹼性溶液提取液〕或其乾燥體，而且還含有藥劑學或獸醫學上允許的通常的載體或稀釋劑。
作為用於製備本發明的有效成分，即松蕈、松蕈的熱水提取液或其乾燥體、或者松蕈的鹼性溶液提取液或其乾燥體的上述松蕈，例如天然松蕈的子實體或菌絲體，或者通過培養得到的松蕈的菌絲體(即培養菌絲體)、培養物(Broth)或子實體。從含有顯示很強的壓力負荷恢復促進作用的活性成分的觀點來看，優選使用本發明的新型松蕈株，即松蕈FERM BP-7304株〔Tricholoma matsutake(S.ItoImai)Sing.CM6271〕。
作為可以用作本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物的有效成分的松蕈菌絲體，在使用通過培養得到的菌絲體時，例如可以由通過培養得到的菌絲體(即培養菌絲體)和培養基的混合物，採用適當的除去方法(例如過濾)僅除去培養基後使用，或者也可以由除去培養基後的菌絲體，採用適當的方法(例如冷凍乾燥)除去水分，以菌絲體乾燥物的狀態使用，而且還可以將上述菌絲體乾燥物粉碎，以菌絲體乾燥物粉末的狀態使用。另外，使用天然菌絲體的場合，例如可以直接使用天然的菌絲體，或者也可以採用適當的方法(例如冷凍乾燥)由天然的菌絲體除去水分，以菌絲體乾燥物的狀態使用，而且還可以將上述菌絲體乾燥物粉碎，以菌絲體乾燥物粉末的狀態使用。
作為可以用作本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物的有效成分的松蕈培養物(Broth)，例如能夠以通過培養得到的菌絲體(即培養菌絲體)和培養基的混合物的狀態直接使用，或者也能夠採用適當的方法(例如冷凍乾燥)從上述混合物除去水分，以培養物(Broth)乾燥物的狀態使用，而且還能夠將上述培養物(Broth)乾燥物粉碎，以培養物(Broth)乾燥物粉末的狀態使用。
作為可以用作本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物的有效成分的松蕈子實體，例如可以直接使用天然的子實體或通過培養得到的子實體，或將上述子實體破碎後使用，或者也可以採用適當的方法(例如冷凍乾燥)由上述子實體除去水分，以子實體乾燥物的狀態使用，而且還能夠將上述子實體乾燥物粉碎，以子實體乾燥物粉末的狀態使用。
松蕈的熱水提取液例如可以通過用熱水提取天然松蕈的子實體或菌絲體，或者通過培養得到的松蕈的菌絲體(即培養菌絲體)、培養物(Broth)或子實體得到。
熱水提取時使用的熱水溫度只要是能夠將松蕈中含有的顯示壓力負荷恢復促進作用的成分充分提取到熱水提取液中的溫度即可，並沒有特別的限定，優選60～100℃，更優選80～98℃。
將菌絲體或子實體用於熱水提取時，為了提高提取效率，優選加工成破碎物或粉體的狀態。
另外，提取時，為了提高提取效率，優選在進行攪拌或振蕩的同時實施。提取時間可以根據例如松蕈的狀態(即，為子實體、菌絲體或培養物中的哪一種狀態，或者在加工成破碎物或粉體的狀態時其加工狀態)、熱水的溫度、或者攪拌或振蕩的有無或條件適當確定，通常為1～6小時，優選2～3小時。
得到的熱水提取液能夠以混有不溶物的狀態直接用作本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物的有效成分，或者也能夠在除去不溶物後，或除去不溶物，並除去提取液中的低分子級分後，用作本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物的有效成分。例如，可以通過將混有不溶物的熱水提取液離心分離除去不溶物，僅將得到的上清液用作本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物的有效成分。或者，也可以將混有不溶物的熱水提取液離心分離，將得到的上述上清液透析，除去低分子級分(優選分子量3500以下的級分)後，用作本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物的有效成分。而且，還可以採用適當的方法(例如冷凍乾燥)由熱水提取液(包括例如混有雜質的熱水提取液、將上述熱水提取液離心分離得到的上清液、或者上述上清液的透析物等)除去水分，以乾燥體的狀態作為本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物的有效成分使用。
作為本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物的有效成分的松蕈鹼性溶液提取液或其乾燥體的製備方法，可以按照以上說明的松蕈熱水提取液的製備方法實施。也就是說，除了用鹼性溶液代替熱水以外，可以按照與松蕈的熱水提取液的上述製備方法相同的方法進行製備。例如，可以通過用鹼性溶液提取天然松蕈的子實體或菌絲體，或者通過培養得到的松蕈的菌絲體(即培養菌絲體)、培養物(Broth)或子實體得到。
作為鹼性溶液提取時使用的鹼性溶液，沒有特別的限定，例如可以使用鹼金屬(例如鈉或鉀)的氫氧化物，特別是氫氧化鈉的水溶液。上述鹼性溶液的pH優選為8～13，更優選9～12。鹼性溶液提取優選在0～30℃下實施，更優選在0～25℃下實施。得到的鹼性溶液提取液可以在實施中和處理後用作本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物的有效成分，或者也可以不實施中和處理，直接用作本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物的有效成分。
本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物可以將松蕈〔例如松蕈的菌絲體、培養物(Broth)或子實體〕、松蕈的熱水提取液〔例如松蕈的菌絲體、培養物(Broth)或子實體的熱水提取液〕或其乾燥體、或者松蕈的鹼性溶液提取液〔例如松蕈的菌絲體、培養物(Broth)或子實體的鹼性溶液提取液〕或其乾燥體，與藥劑學或獸醫學上允許的通常的載體或稀釋劑一起給予動物，優選哺乳動物(特別是人)。
本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物的有效成分，即松蕈、松蕈的熱水提取液或其乾燥體、或者松蕈的鹼性溶液提取液或其乾燥體對壓力負荷具有促進恢復的活性。
因此，本發明的有效成分，即松蕈、松蕈的熱水提取液或其乾燥體、或者松蕈的鹼性溶液提取液或其乾燥體可以單獨，或者優選與藥劑學或獸醫學上允許的通常的載體或稀釋劑一起，以有效量給予必需促進對壓力負荷的恢復的對象。
另外，本發明的有效成分，即松蕈、松蕈的熱水提取液或其乾燥體、或者松蕈的鹼性溶液提取液或其乾燥體，可以用於製備對於壓力負荷促進恢復用的藥物組合物、對於壓力負荷促進恢復用的功能性食品、或者對於壓力負荷促進恢復用的口腔衛生用組合物。
一般，如果對於動物給予單發性的或者經過某一期間的壓力，通常該動物的免疫能力降低，如果從上述壓力負荷中解放出來，則免疫力自發地恢復。本說明書中的「對壓力負荷促進恢復的活性(壓力負荷恢復促進活性)」是指，由壓力負荷中解放出來後，與自發恢復相比，促進免疫力恢復期的免疫力恢復的活性。
本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物的給藥時間只要通過給予該藥物組合物能夠促進由於壓力負荷導致暫時降低的免疫力恢復即可，沒有特別的限定，例如可以在承受壓力前、承受壓力時和/或從壓力負荷中解放出來後的免疫力恢復期給藥。
另外，本發明的上述「壓力負荷恢復促進活性」與本發明人以前發現的上述單純的「免疫增強活性」不同。也就是說，「免疫增強活性」一般是指給予具有這種活性的有效成分時，與給藥前的狀態(可以是沒有壓力負荷，免疫力為通常的狀態，或者也可以是由於壓力負荷，免疫力降低的狀態)相比，可見免疫力提高的活性，因此是提高免疫力自身的活性。另一方面，本發明的「壓力負荷恢復促進活性」如上所述是指促進免疫力恢復期的免疫力恢復的活性，因此是提高免疫力恢復速度的活性。如果給予本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物，與不給予本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物的場合相比，免疫力的恢復速度上升。
而且，在「免疫增強活性」中，如果給予具有這種活性的有效成分，直接可見免疫力的提高，與此相對，如果在承受壓力之前預先將本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物的有效成分，即松蕈、松蕈的熱水提取液或其乾燥體、或者松蕈的鹼性溶液提取液或其乾燥體給予對象動物，則在承受壓力時和免疫力恢復期中，即使不給予松蕈、松蕈的熱水提取液或其乾燥體、或者松蕈的鹼性溶液提取液或其乾燥體，也能在免疫力恢復期促進免疫力的恢復。在這一點上，「免疫增強活性」與本發明的「壓力負荷恢復促進活性」是不同的活性。
作為本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物的給藥劑型，沒有特別的限定，例如散劑、細粒劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、懸浮液、乳劑、糖漿劑、浸膏劑或丸劑等口服劑，或注射劑、外用液體製劑、軟膏劑、栓劑、局部給藥的霜劑或滴眼藥等非口服劑。
這些口服劑可以使用例如明膠、海藻酸鈉、澱粉、玉米澱粉、白糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、羧甲基纖維素、糊精、聚乙烯吡咯烷酮、結晶纖維素、大豆卵磷脂、蔗糖、脂肪酸酯、滑石、硬脂酸鎂、聚乙二醇、矽酸鎂、矽酸酐或合成矽酸鋁等賦形劑、粘合劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、助流劑、稀釋劑、保存劑、著色劑、香料、矯味劑、穩定劑、保溼劑、防腐劑或抗氧化劑等，按照常規方法進行製備。
作為非口服給藥方法，例如注射(皮下、靜脈等)或者直腸給藥等。其中最優選使用注射劑。
在注射劑的製備中，除有效成分以外，可以任意使用例如生理鹽水或林格溶液等水溶性溶劑、植物油或脂肪酸酯等非水溶性溶劑、葡萄糖或氯化鈉等等滲劑、溶解助劑、穩定劑、防腐劑、懸浮劑或乳化劑等。
另外，本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物也可以使用緩釋性聚合物等，採用緩釋性製劑的方法進行給藥。例如，可以將本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物固定在乙烯醋酸乙烯酯聚合物的顆粒中，將該顆粒外科移植到需要治療或預防的組織中。
本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物可以含有松蕈、松蕈的熱水提取液或其乾燥體、或者松蕈的鹼性溶液提取液或其乾燥體O.01-99重量％，優選O.1～80重量％，但是並不限於此。
使用本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物時的給藥量可以根據疾病的種類、患者的年齡、性別、體重、症狀的程度或給藥方法等適當確定，能夠口服給藥或非口服給藥。
另外，給藥方式也不限定於藥品，也能夠以各種形態，例如作為功能性食品或健康食品(包括飲料)或者飼料以飲食品的形態給予。而且，也能夠以口腔衛生用組合物，例如雖然暫時含在口中，但幾乎將其全部從口中吐出的形態，如刷牙劑、漱口劑、口香糖或含嗽劑的形態給予，或者以由鼻腔吸入的吸入劑的形態給予。例如，可以將松蕈、松蕈的熱水提取液或其乾燥體、或者松草的鹼性溶液提取液或其乾燥體作為添加劑(例如食品添加劑)，添加到所需的食品(包括飲料)、飼料、刷牙劑、漱口劑、口香糖或含嗽劑等中。
本發明的松蕈FERM BP-7304株於平成12年9月14日保藏在獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物保藏中心〔(舊)工業技術院生命工學工業技術研究所(地址 305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)〕。該松蕈FERM BP-7304株是由京都府龜岡市採集的松蕈CM6271株切出子實體組織，在試管內培養得到菌絲體繼代株的物質，維持在吳羽化學工業株式會社生物醫學研究所。
本發明的松蕈FERM BP-7304株的子實體形態與今關六也·本鄉次雄編的「原色日本新茵類圖鑑(I)」，保育社(大阪)，昭和62年發行，圖版(Plate)15和77頁記載的松蕈子實體一致。本發明的松蕈FERM BP-7304株的繼代培養可以採用Ebios(乾酵母，エビオス)瓊脂斜面培養基實施。大量培養上述菌株的茵絲體時，可以攝取到液體培養基中，通過例如靜置培養、振蕩培養或罐(tank)培養實施。
將本發明的松蕈FERM BP-7304株的茵絲體接種在Ebios瓊脂平板培養基中，則白色的菌絲呈放射狀密集繁殖，形成大的菌落。如果用掃描型電子顯微鏡觀察，則存在無數粗度為1～2μm的枝狀菌絲體，在菌絲體側部經常可見數μm的突起物。另外，松蕈FERM BP-7304株能夠主要以菌絲體的形狀進行繼代維持或培養，但有時也形成子實體的形狀。
以下，說明本發明的松蕈FERM BP-7304株的菌學性質。
(1)麥芽提取物瓊脂培養基上的培養特性和形態特性本發明的松蕈FERM BP-7304株在麥芽提取物瓊脂培養基中，白色的菌絲呈放射狀密集繁殖，形成菌落。接種第30天的菌落直徑為約4cm。
(2)馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養基、恰佩克(Czapek)瓊脂培養基、薩布羅(Sabouraud)瓊脂培養基、燕麥片瓊脂培養基、合成ムコ-ル瓊脂培養基和酚氧化酶反應檢驗用培養基上的培養特性和形態特性本發明的松蕈FERM BP-7304株在馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養基、恰佩克瓊脂培養基、薩布羅瓊脂培養基、燕麥片瓊脂培養基、合成ムコ-ル瓊脂培養基或酚氧化酶反應檢驗用培養基中任意一種培養基上，接種後經過1個月，也幾乎見不到菌絲的生長。
(3)YpSs瓊脂培養基上的培養特性和形態特性本發明的松蕈FERM BP-7304株在YpSs瓊脂培養基中，具有白色光澤，繁殖成叢(マツト)狀。接種第30天的繁殖距離為約5mm。
(4)葡萄糖-乾酵母瓊脂培養基上的培養特性和形態特性本發明的松蕈FERM BP-7304株在葡萄糖-乾酵母瓊脂培養基中，具有白色光澤，繁殖成叢狀。接種第30天的繁殖距離為約2mm。
(5)最適繁殖溫度和繁殖的範圍在裝有滅菌處理後的液體培養基(3％葡萄糖、0.3％酵母提取液；pH7.0)10mL的100mL錐形瓶中，接種本發明的松蕈FERM BP-7304株的種菌約2mg，在5～35℃的各種溫度下分別進行培養，第28天由錐形瓶取出菌體，用蒸餾水充分洗滌後，乾燥，測定重量。結果，菌體重量在5～15℃的範圍內直線增加，在15～25℃的範圍內緩慢增加。在27.5℃以上幾乎不增加。最適繁殖溫度為15～25℃。
(6)最適繁殖pH和繁殖的範圍用1mol/L鹽酸或1mol/L氫氧化鉀調節液體培養基(3％葡萄糖、0.3％酵母提取液)的pH，配製pH在3.0～8.0範圍內的各種培養基，考察繁殖pH值。對各培養基進行濾器除菌，將培養基10mL分別注入滅菌後的100mL錐形瓶中。接種本發明的松蕈FERM BP-7304株的種菌約2mg後，在22℃下培養，第28天由錐形瓶取出菌體，用蒸餾水充分洗滌後，乾燥，測定重量。結果，菌體的繁殖界限為pH3.0～7.0，最適繁殖pH為4.0～6.0。
(7)通過對峙培養有無形成帶線在Ebios瓊脂平板培養基上以約2em的間隔對峙接種本發明的松蕈FERM BP-7304株的菌塊(約3mm×3mm×3mm)和下述表1所示的13種松蕈株的各菌塊(約3mm×3mm×3mm)，在22℃下培養3周後，判斷在兩種菌落的邊界部分是否產生帶線。
結果，本發明的松蕈FERM BP-7304株對表1所示13種松蕈株中的任意一種菌株均不形成明顯的帶線。另外，一般認為松蕈在異株間對峙培養時不產生帶線，在表1所示的13種松蕈株之間也不存在形成明顯帶線的組合。
(8)營養要求在裝有滅菌處理後的菌根菌用合成培養基(Ohta等，Trans.Mycol.Soc.Jpn.，31，323，1990)10mL的100mL錐形瓶中，接種本發明的松蕈FERM BP-7304株的種菌約2mg，在22℃下培養，第42天由錐形瓶取出菌體，用蒸餾水充分洗滌後乾燥，測定重量，得到菌體441mg。
在加入28種糖類相關物質中的任意一種代替上述菌根菌用合成培養基中的碳(C)源即葡萄糖的各種培養基中，接種本發明的松蕈FERMBP-7304株，培養，培養結束後測定菌體重量。
結果，按照菌體重量多的糖類相關物質到菌體重量少的糖類相關物質的順序表示如下。
小麥澱粉＞玉米澱粉＞糊精＞甲基β糖苷＞纖維二糖＞甘露糖＞果糖＞阿拉伯糖＞山梨糖醇＞葡萄糖＞乳糖＞糖元＞甘露糖醇＞核糖＞麥芽糖＞海藻糖＞半乳糖＞蜜三糖＞蜜二糖＞N-乙醯葡糖胺。
另外，使用纖維素、半乳糖醇(dulcitol)、蔗糖、木糖、甲基α糖苷、菊粉、肌醇或山梨糖，幾乎見不到菌的生長。
接著，在加入15種氮相關物質中的任意一種代替上述菌根菌用合成培養基中的氮(N)源即酒石酸銨的各種培養基中，接種本發明的松蕈FERM BP-7304株，培養，培養結束後測定菌體重量。
結果，按照菌體重量多的氮相關物質到菌體重量少的氮相關物質的順序表示如下。
玉米漿＞大豆蛋白腖＞乳蛋白腖＞硝酸銨＞硫酸銨＞酒石酸銨＞碳酸銨＞天冬醯胺＞磷酸銨＞氯化銨＞硝酸鈉＞肉汁＞酵母提取液＞水解酪蛋白胺基酸＞小球藻(クロレラ，Chlorella)＞胰蛋白腖＞硝酸鉀。
而且，在除去了上述合成培養基中的礦物和維生素類中特定的一種成分得到的培養基中，接種本發明的松蕈FBRM BP-7304株，培養，培養結束後測定菌體重量。
結果，缺少氯化鈣·二水合物、硫酸錳(II)·五水合物、硫酸鋅·七水合物、硫酸鈷·七水合物、硫酸銅·五水合物、硫酸鎳·六水合物、鹽酸硫胺、煙酸、葉酸、生物素、鹽酸吡哆醇、氯化肉毒鹼、硫酸腺嘌呤·二水合物或鹽酸膽鹼中任意一種時，對菌體重量幾乎沒有影響。另一方面，如果從培養基中除去硫酸鎂·七水合物、氯化鐵(II)或磷酸二氫鉀中的任意一種，則菌體重量顯著減少。也就是說，認為鎂、鐵、磷和鉀是本發明的松蕈FERM BP-7304株增殖所必需的。
(9)DNA的鹼基組成(GC含量)本發明的松蕈FERM BP-7304株的GC含量為49.9％(參照下述分析例2)。
(10)採用RAPD法產生的DNA圖案對於按照分別單獨使用6種不同PCR(聚合酶鏈反應，polymerasechain reaction)用引物(10mer；具體的鹼基序列參照下述分析例1)的RAPD(隨機擴增多態DNA，random amplified polymorphic DNA)法生成的DNA圖案，比較本發明的松蕈FERM BP-7304株和44種松蕈株(具體的菌株名參照下述分析例1)，結果本發明的松蕈FBRM BP-7304株顯示與44種松蕈株均不同的DNA圖案。
向沉澱部分加入純水300mL，進行與上述同樣的處理。該操作共計進行3次，將所有上清液合併，裝入透析膜(Spectra/Por3Membrane，分子量3500分級)中，在自來水的流水中透析2天。用旋轉蒸發器將透析膜內液濃縮後，進行冷凍乾燥，得到熱水提取液的乾燥物粉末3.2g。
向實施了熱水提取後殘留的沉澱部分加入0.5mol/L氫氧化鈉溶液400mL後，在攪拌器攪拌下，在25℃提取1小時。提取結束後，通過離心分離(12000rpm，20分鐘)，得到上清液。
向沉澱部分加入1.0mol/L氫氧化鈉溶液400mL，進行與上述同樣的處理。將2次的上清液合併，用1.0mol/L鹽酸將pH調節為7.0後，裝入透析膜(Spectra/Por3 Membrane，分子量3500分級)中，在自來水的流水中透析2天。周旋轉蒸發器將透析膜內液濃縮後，進行冷凍乾燥，得到鹼性溶液提取液的乾燥物粉末5.1g。實施例3巖手縣產松蕈於實體的乾燥物粉末的製備使用冷凍乾燥機(MINIFAST MOD.DO.5；Edwards社)將市售的巖手縣產松蕈子實體〔在黑潮市場(東京都新宿區北新宿)購入〕250g乾燥後，使用勻質混合機(Wonder Blender；大阪化學社)粉碎，得到乾燥物粉末35g。實施例4巖手縣產松蕈的熱水提取液和鹼性溶液提取液的各乾燥物粉末的製備將按照與上述實施例3同樣的步驟製得的市售巖手縣產松蕈子實體的乾燥物粉末20g移至1L的燒杯中，加入純水800mL後，在攪拌器攪拌下，在93～98℃的水浴中提取3小時。提取結束後，冷卻至室溫，通過離心分離(12000rpm，20分鐘)得到上清液。
向沉澱部分加入純水500mL，進行與上述同樣的處理。該操作共計進行3次，將所有上清液合併，裝入透析膜(Spectra/Por3Membrane，分子量3500分級)中，在自來水的流水中透析2天。用旋轉蒸發器將透析膜內液濃縮後，進行冷凍乾燥，得到熱水提取液的乾燥物粉末1.0g。
向實施了熱水提取後殘留的沉澱部分加入0.5mol/L氫氧化鈉溶液500mL後，在攪拌器攪拌下，在25℃提取1小時。提取結束後，通過離心分離(12000rpm，20分鐘)，得到上清液。
向沉澱部分加入1.0mol/L氫氧化鈉溶液500mL，進行與上述同樣的處理。將2次的上清液合併，用1.0mol/L鹽酸將pH調節為7.0後，裝入透析膜(Spectra/Por3 Membrane，分子量3500分級)中，在自來水的流水中透析2天。用旋轉蒸發器將透析膜內液濃縮後，進行冷凍乾燥，得到鹼性溶液提取液的乾燥物粉末5.1g。實施例5長野縣產松蕈子實體的熱水提取液的乾燥物粉末的製備除了用長野縣產松蕈子實體代替巖手縣產松蕈子實體以外，直接重複上述實施例4的步驟，得到松蕈子實體的熱水提取液的乾燥物粉末1.5g。比較例1Agaricus blazei子實體的熱水提取液的乾燥物粉末的製備除了用市售的Agaricus blazei子實體代替巖手縣產松蕈子實體以外，直接重複上述實施例4的步驟，得到Agaricus blazei子實體的熱水提取液的乾燥物粉末3.6g。比較例2靈芝子實體的熱水提取液的乾燥物粉末的製備除了用市售的靈芝子實體〔Ganoderma lucidum(Fr.)Karst〕代替巖手縣產松蕈子實體以外，直接重複上述實施例4的步驟，得到靈芝子實體的熱水提取液的乾燥物粉末2.4g。比較例3香蕈子實體的熱水提取液的乾燥物粉末的製備除了用市售的香蕈子實體〔Lentinus edodes(Berk.)Sing.〕代替巖手縣產松蕈子實體以外，直接重複上述實施例4的步驟，得到香蕈子實體的熱水提取液的乾燥物粉末1.4g。分析例1採用RAPD法對松蕈FERM BP-7304株的鑑定在本分析例中，將按照分別單獨使用6種不同PCR(聚合酶鏈反應，polymerase chain reaction)用引物(10mer)的RAPD(隨機擴增多態DNA，random amplified polymorphic DNA)法分別生成的本發明的松蕈FERM BP-7304株的DNA圖案與多種公知松蕈株的各DNA圖案相比較。
作為比較用的公知松蕈株，使用表1所示的13種。與上述實施例1同樣，得到乾燥菌絲體，再將其粉碎，得到乾燥物粉末。各松蕈株的菌絲體收量(每100mL培養基的乾燥菌體重量，10支的平均值)和各松蕈株的來源(建立設施)一併列於表1中。
表1菌編號 菌株名 收量(g) 來源(建立設施)1 IFO6915 0.67 (財)發酵研究所2 IFO6925 0.50 (財)發酵研究所3 IFO6930 0.72 (財)發酵研究所4 IFO6935 0.65 (財)發酵研究所5 CM627-2 0.79 吳羽化學工業(株)6 CM627-4 0.80 吳羽化學工業(株)7 IFO30604 0.49 (財)發酵研究所8 IFO30605 0.71 (財)發酵研究所9 IFO30606 0.35 (財)發酵研究所10 MAFF460039 0.56 農林水產省農業生物資源研究所11 KT0010.68 吳羽化學工業(株)12 IFO6920 0.72 (財)發酵研究所13 IFO6933 0.56 (財)發酵研究所作為上述PCR用引物，通過化學合成製備下述引物後使用。
引物RAPD1(序列表中序列號1表示的鹼基序列TGGTCACCGA)；引物RAPD2(序列表中序列號2表示的鹼基序列AGCGCCATTG)；引物RAPD3(序列表中序列號3表示的鹼基序列TTCGAGCCAG)；引物RAPD4(序列表中序列號4表示的鹼基序列TGCGTGCTTG)；引物RAPD5(序列表中序列號5表示的鹼基序列GACTAGCCTC)；以及引物RAPD6(序列表中序列號6表示的鹼基序列CTCACCGTCC)。
RAPD法中使用的DNA使用市售的DNA製備試劑盒(Dneasy PlantMini Kit；QIAGEN社)，根據其操作說明書〔Dneasy Plant Mini Handbookfor DNA isolation from plant tissue(March，1999，QIAGEN，K.K.，東京)〕，按照以下步驟製備。
也就是說，將除去了多餘水分的各松蕈菌株的菌絲體(約100mg)裝入試管後，用液氮冷凍，在-80℃下保存待用。將裝有試樣的試管解凍後，加入緩衝液AP1(400μl)和RNA酶A儲備溶液(RNase Astocksolution)4μl，使用渦流混合機將內容物充分混合。接著，將上述試管置於65℃的水浴中，溫育10分鐘。另外，在上述溫育過程中，將試管翻轉2～3次進行混合。反應結束後，在上述反應物中加入緩衝液AP2(130μL)，在冰冷條件下放置5分鐘。接著，將試管內容物裝入柱(QIAshredder spin column)中，將上述柱裝入2mL的試管中，以15000rpm離心分離2分鐘。離心分離後，將通過柱積存在試管底部的溶液移至另一試管中，測定液量。這時，注意絕對不要接觸試管底部的細胞片。
接著，在試管中加入與通過柱的液體等量的100％乙醇以及半量的緩衝液AP3，充分混合。將上述溶液650μL裝入另一柱(DNeasy minispin column)，將上述柱裝入2mL的試管中，以8000rpm離心分離1分鐘。在離心分離後的柱中裝入緩衝液AW(500μL)，將上述柱裝入2mL的試管中，以8000rpm離心分離1分鐘，廢棄試管底部的溶液。在上述柱中裝入緩衝液AW(500μL)，將上述柱裝入2mL的試管中，以15000rpm離心分離2分鐘，廢棄試管底部的溶液。接著，準備新的試管，安裝進行了上述洗滌處理後的柱，裝入保溫於65℃的緩衝液AE(100μL)，在室溫下放置5分鐘後，以8000rpm離心分離1分鐘，回收試管底部的DNA溶液。再重複一次同樣的操作，回收合計約200μL的DNA溶液。將所得DNA中的20μL用於1％瓊脂糖凝膠電泳，確認DNA的回收量以及純度。
PCR在表2所示的反應溶液(總體積＝25μL)中，在下述條件下進行，即循環實施94℃的改性步驟(30秒)、36℃的結合步驟(1分鐘)以及72℃的伸長步驟(2分鐘)構成的循環45次〔其中，在第1次循環前實施94℃的預備性改性步驟(2分鐘)，並且在最後的第45次循環後實施最終的伸長步驟(2分鐘)〕的條件。另外，表2所示的反應溶液通過將Ex TaqTM緩衝液、TaKaRa Ex TaqTM和Taq Start抗體混合，2～3秒後添加蒸餾水、10×Ex TaqTM緩衝液、dNTP和引物，最後添加DNA溶液製備。
表2反應溶液(每1支試管)Ex TaqTM緩衝液(寶酒造) 0.8μLTaKaRa Ex TaqTM(寶酒造) 0.2μLTaq Start抗體(寶酒造)0.2μL蒸餾水 8.3μL10×Ex TaqTM緩衝液(寶酒造) 2.5μLdNTP 2.0μL引物 1.0μLDNA 10μL將得到的PCR產物採用瓊脂糖凝膠電泳法分離，得到的DNA圖案如

圖1～4所示。圖1表示表1中菌編號1～6表示的比較用菌株的DNA圖案，圖2表示表1中菌編號7～11表示的比較用菌株的DNA圖案，圖3表示表1中菌編號12～13表示的比較用菌株的DNA圖案以及本發明的松蕈FERM BP-7304株的DNA圖案，圖4表示本發明的松蕈FERMBP-7304株的DNA圖案。
圖1中帶圈的數字「1」～「6」、圖2中帶圈的數字「7」～「11」和圖3中帶圈的數字「12」～「13」分別對應於表1中的菌編號1～13。例如圖1中帶圈的數字「1」所示的譜帶(line)表示表1中菌編號1的菌株，即IFO6915株的結果。另外，圖3中帶圈的數字「14」所示的譜帶表示本發明的松蕈FERM BP-7304株的結果。
圖1～圖3中的符號「RAPD1」～「RAPD6」表示引物RAPD1～RAPD6。
圖4中的各譜帶1～6分別表示使用各引物RAPD1～RAPD6時本發明的松蕈FERM BP-7304株的結果。
另外，圖1～圖4中的符號「M」表DNA分子量標記。在上述各電泳中，使用相同的DNA分子量標記(1kb DNA ladder，商品目錄編號15415-018，Life Technologies社，GIBCO-BRL，美國)。在圖4中，箭頭A表示的條帶(band)是4072bp的DNA片斷，箭頭B表示的條帶是3054bp的DNA片斷，箭頭C表示的條帶是2036bp的DNA片斷和1636bp的DNA片斷重疊而成的條帶，箭頭D表示的條帶是1018bp的DNA片斷，箭頭E表示的條帶是517bp、506bp、396bp、344bp和298bp的各DNA片斷重疊而成的條帶。
如圖1～圖4所示，本發明的松蕈FERM BP-7304株顯示與表1所示13種比較用松蕈株均不同的DNA圖案。
另外，本發明的松蕈FERM BP-7304株與表1所示13種比較用松蕈株以外的31種松蕈株，即MAFF460031、MAFF460033、MAFF460034、MAFF460035、MAFF460036、MAFF460037、MAFF460038、MAFF460040、MAFF460041、MAFF460042、MAFF460046、MAFF460050和MAFF460096(以上源於農林水產省農業生物資源研究所)、CM627-3、CM627-5、CM627-6和CM627-7〔以上源於吳羽化學工業(株)〕以及IFO6929、IFO6931、IFO6932、IFO6934、IFO6916、IFO6917、IFO6918、IFO6919、IFO6921、IFO6922、IFO6923、IFO6924、IFO6926和IFO6928〔以上源於(財)發酵研究所〕的DNA圖案也不同，但是具體的DNA圖案沒有圖示。分析例2松蕈FERM BP-7304株的GC含量在裝有與上述實施例1同樣得到的松蕈FERM BP-7304株的菌絲體(溼重量＝1.0g)的50mL錐形瓶中，加入1mg/mL蛋白酶K(默克公司，德國)的磷酸緩衝化生理鹽水(PBS)(pH7.4)溶液20mL，在時常振蕩的同時，在65℃下反應2小時。在100℃下熱處理10分鐘，使酶失活後，冷卻至37℃，加入適量(約1mg)消解酶(ザイモリア-ゼ)(生化學工業)，再在37℃下反應4小時。接著，加入Tris-十二烷基硫酸鈉(SDS)緩衝液40mL，在60℃下進行溶菌處理，配製DNA提取液。
向上述提取液中添加等量的苯酚，攪拌後，離心分離除去苯酚層。按照乙醇沉澱法由得到的上清液回收粗DNA後，用70～90％乙醇洗滌。將得到的沉澱再次溶解於枸櫞酸緩衝液5mL中，實施RNA酶處理。接著，向RNA酶處理溶液中少量添加苯酚，攪拌後，離心分離除去苯酚層。再次按照乙醇沉澱法由上清液回收粗DNA，用70～90％乙醇洗滌後，實施第2次RNA酶處理。RNA酶處理後，添加含有乙二胺四乙酸(EDTA)的醋酸緩衝液0.5mL，用異丙醇使DNA沉澱，離心分離進行回收。將其再次用70～90％乙醇洗滌，最終溶解於枸櫞酸緩衝液1mL中，得到純化DNA溶液。
在100℃下對得到的純化DNA溶液100μL進行熱處理10分鐘後，用冰冷卻，用核酸酶P1在50℃下處理1小時，分解成核苷酸。GC含量採用高效液相色譜(LC-6A，島津製作所)進行定量。使用GC試劑盒(ヤマサ醬油)作為標準品，使用YMC-Pack AQ-312(直徑＝6.0mm，長度＝150mm)作為柱，使用0.2mol/L磷酸銨溶液(pH約4.5)作為移動相。注入量為10μL，檢測在波長270nm處實施，峰的鑑定採用絕對保留時間法進行。作為定量法，使用修正百分率法。
松蕈FERM BP-7304株的GC含量為49.9％。評價例1對於壓力負荷的恢復促進活性的評價(1)松蕈FERM BP-7304株的熱水提取液和鹼性溶液提取液的評價在本評價例中，將上述實施例2中分別製備的松蕈FERM BP-7304株的熱水提取液乾燥物粉末和鹼性溶液提取液乾燥物粉末以3.2∶5.1的比率混合，以得到的混合物作為評價用試樣，將該評價用試樣對小鼠口服給藥4周後，負荷約束壓力18小時，測定從壓力中解放出來後的天然殺傷(NK)細胞活性，研究上述試樣的影響。
具體而言，將評價用試樣的水溶液(將上述實施例2中分別製備的松蕈FERM BP-7304株的熱水提取液乾燥物粉末和鹼性溶液提取液乾燥物粉末以3.2∶5.1的比率混合後，溶解於蒸餾水得到的溶液)對由日本SLC購入的8周齡雄性C57BL/6小鼠(每組＝5～10隻)在常規的飼養用籠中口服給藥4周(50mg/kg/day)。接著，將小鼠從上述飼養用籠中取出，在開了通氣孔的容量50mL的帶蓋聚丙烯制離心用管(商品目錄編號2341-050，テクノグラス社)中分別關入1隻小鼠。該關入管中的小鼠處於身體不能活動的狀態。接著，將這些管放回飼養用籠中，在這種狀態下放置18小時，給予約束壓力。使之承受18小時的壓力後，將小鼠從管中取出，放回飼養用籠中，在普通的環境下進行飼養。
從上述約束壓力中解放出來後，經過給定天數〔0天(剛解放後)、1天、3天、5天、7天和14天〕後，將小鼠處死，按照下述步驟，在試管內測定淋巴結細胞對NK敏感性腫瘤細胞株YAC-1的細胞損傷活性，評價天然殺傷(NK)細胞活性。
也就是說，無菌地由小鼠摘出脾臟和腸繫膜淋巴結，移入裝有Hanks平衡鹽溶液(Hanks Balanced Salt Solution)的無菌培養皿中。用剪刀和小鑷子將淋巴結拆散後，通過網篩配製淋巴細胞的單細胞液。用添加了10％胎牛血清(56℃下實施熱處理30分鐘)的RPMI 1640培養基將細胞洗滌3次後，用分別添加了10％胎牛血清(56℃下實施熱處理30分鐘)、20mmol/L的4-(2～羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸和30μg/mL慶大黴素的RPMI 1640培養基，將細胞濃度調節為5×106個/mL，使用得到的細胞懸浮液作為效應細胞。
另一方面，用作靶細胞的YAC-1細胞是在添加了10％胎牛血清(56℃下實施熱處理30分鐘)的RPMI 1640培養基中，由吳羽化學工業株式會社生物醫學研究所繼代維持的細胞。向上述YAC-1細胞中加入放射性鉻酸鈉(アマ-シヤムジヤパソ)，在37℃下反應20分鐘。用添加了10％胎牛血清(56℃下實施熱處理30分鐘)的RPMI 1640培養基洗滌3次，除去未結合的放射性鉻酸鈉，將放射性鉻標記腫瘤細胞調節為5×104個/mL。
在試管中分別加入前面製備的上述效應細胞懸浮液或其2倍稀釋系列以及上述放射性鉻標記腫瘤細胞懸浮液各0.1mL，在37℃的5％二氧化碳培養器中反應4小時。另外，這時為了計算出下述特異性損傷率，對於在試管中加入放射性鉻標記腫瘤細胞和培養基形成的懸浮液，以及在試管中加入放射性鉻標記腫瘤細胞和表面活性劑(Triton，最終濃度＝0.05％)形成的懸浮液，在37℃的5％二氧化碳培養器中反應4小時。反應結束後，再向試管中加入添加了10％胎牛血清(56℃下實施熱處理30分鐘)的RPMI 1640培養基1.5mL，用混合器充分混合後，離心分離(12000rpm，5分鐘，4℃)，得到上清液。使用γ計數器測定得到的上清液的放射能活性。
由下式計算出特異性損傷率(S.L.Specific Lysis)，〔S.L.〕＝((B-Bf)/(Bmax-Bf)}×100〔式中，S.L.為特異性損傷率(單位＝％)，B為實驗組的上清液的放射能活性(單位＝Bq)，Bf為自然游離組(即，放射性鉻標記腫瘤細胞單獨培養組)的上清液的放射能活性(單位＝Bq)，Bmax為最大游離組(即，Triton處理後的放射性鉻標記腫瘤細胞組)的上清液的放射能活性(單位＝Bq)〕用每107個效應細胞損傷30％腫瘤細胞的細胞數，即「30％損傷單位(Lytic Units 30％；LU30)」表示NK細胞活性。
結果如圖5所示。另外，作為對照(健康正常組)試驗，用蒸餾水代替評價用試樣水溶液口服給藥4周，並且不給予18小時的約束壓力，除此以外直接重複上述操作。另外，作為比較試驗，用蒸餾水代替評價用試樣水溶液口服給藥4周，除此以外直接重複上述操作。
在圖5中，折線a(白正方形)表示對照(健康正常組)試驗(非壓力)的結果，折線b(黑圓圈)表示給予本發明的評價用試樣(松蕈FERM BP-7304株的熱水提取液乾燥物粉末和鹼性溶液提取液乾燥物粉末的比率為3.2∶5.1的混合物)水溶液時的結果，折線c(黑三角)表示比較試驗(給予蒸餾水和壓力負荷)的結果。另外，在圖5中，折線b的上述黑圓圈的肩部所示的符號「+」表示p＜0.01(相對於折線c的黑三角表示的結果)，折線c的上述黑三角的肩部所示的符號「*」表示p＜0.01(相對於折線a的白正方形表示的結果)。
如圖5的折線b、c所示，如果承受約束壓力，則NK細胞活性顯著降低。如折線c所示，從約束壓力中解放後，即使直接放任不管，NK細胞活性也緩慢恢復，而如折線b所示，通過添加松蕈FERM BP-7304株的熱水提取液乾燥物粉末和鹼性溶液提取液乾燥物粉末的比率為3.2∶5.1的混合物，NK細胞活性的恢復顯著加快。(2)松蕈FERM BP-7304株的乾燥物粉末、巖手縣產松蕈子實體的乾燥物粉末以及巖手縣產松蕈子實體的熱水提取液乾燥物粉末和鹼性溶液提取液乾燥物粉末的混合物的評價用上述實施例1製備的松蕈FERM BP-7304株的乾燥物粉末(50mg/kg/day)、實施例3製備的市售巖手縣產松蕈子實體的乾燥物粉末(50mg/kg/day)以及上述實施例4製備的市售巖手縣產松蕈子實體的熱水提取液乾燥物粉末和鹼性溶液提取液乾燥物粉末的比率為1.0∶5.1的混合物(25mg/kg/day)代替松蕈FERM BP-7304株的熱水提取液乾燥物粉末和鹼性溶液提取液乾燥物粉末的比率為3.2∶5.1的混合物，除此以外重複上述評價例1(1)的步驟。
結果如表3所示。在表3中，符號「*」表示p＜0.01(相對於給予蒸餾水)。
表3NK細胞活性(LU30)0天 1天 3天5天7天14天對照試驗 49 47 48 50 48 48(無壓力負荷)比較試 7 9 11 22 30 42(給予蒸餾水和壓力負荷)實施例110 21* 35*46*48*50實施例310 20* 31*37*49*51*實施例411 22* 37*41*46*48(3)各種松蕈株的乾燥物粉末的評價使用上述實施例1製備的松蕈FERM BP-7304株的乾燥物粉末(50mg/kg/day)以及上述分析例1中使用的表1所示13種松蕈株的乾燥物粉末(50mg/kg/day)代替松蕈FERM BP-7304株的熱水提取液乾燥物粉末和鹼性溶液提取液乾燥物粉末的比率為3.2∶5.1的混合物，除此以外重複上述評價例1(1)的步驟。
結果如表4和圖6-圖9所示。
在表4中，符號「*」表示p＜0.01(相對於給予蒸餾水)。
在圖6～圖9中，折線a(黑正方形)表示對照試驗(無壓力負荷)的結果，折線b(白正方形)表示比較試驗(給予蒸餾水和壓力負荷)的結果。
圖6中，折線c(黑三角)表示本發明的松蕈FERM BP-7304株的結果，折線d(黑菱形)表示松蕈株IFO6915的結果，折線e(黑圓圈)表示松蕈株IFO6925的結果。
圖7中，折線f(黑三角)表示松蕈株IFO6930的結果，折線g(黑菱形)表示松蕈株IFO6935的結果，折線h(黑圓圈)表示松蕈株CM627-2的結果，折線i(白圓圈)表示松蕈株CM627-4的結果。
圖8中，折線j(黑三角)表示松蕈株IFO30604的結果，折線k(黑菱形)表示松蕈株IF030605的結果，折線1(黑圓圈)表示松蕈株IFO30606的結果，折線m(白圓圈)表示松蕈株MAFF460039的結果。
圖9中，折線n(黑三角)表示松蕈株KT001的結果，折線p(黑菱形)表示松蕈株IFO6920的結果，折線q(黑圓圈)表示松蕈株IFO6933的結果。
表4NK細胞活性(LU30)菌株名0天1天3天 5天7天14天對照試驗48 47 46 46 47 46(無壓力負荷)比較試驗6 8 14 21 28 43(給予蒸餾水和壓力負荷)[實施例]FERM BP-730411 25*42* 47*50*48IFO6915 7 15 18 31 38 45IFO6925 9 17 19 37 41 43IFO6930 8 10 18 29 36 45IFO6935 8 13 21 32 39 42CM627-2 7 14 20 33 44 44CM627-4 8 13 19 35 41 46IFO306046 11 20 35 39 40IFO306056 14 18 36 38 45IFO306066 14 18 30 36 44MAFF460039 8 13 19 29 37 45KT001 7 15 21 34 42 41IFO6920 7 11 19 33 40 40IFO6933 7 10 17 30 37 42
如表4所示，松蕈FERM BP-7304株的乾燥物粉末以及表1所示13種松蕈株的乾燥物粉末均促進NK細胞活性的恢復，其中松蕈FERM BP-7304株的乾燥物粉末顯示最優良的恢復促進活性。
另外，除使用表1所示13種松蕈株以外的31種松蕈株，即MAFF460031、MAFF460033、MAFF460034、MAFF460035、MAFF460036、MAFF460037、MAFF460038、MAFF460040、MAFF460041、MAFF460042、MAFF460046、MAFF460050和MAFF460096(以上源於農林水產省農業生物資源研究所)、CM627-3、CM627-5、CM627-6和CM627-7〔以上源於吳羽化學工業(株)〕以及IFO6929、IFO6931、IFO6932、IFO6934、IFO6916、IFO6917、IFO6918、IFO6919、IFO6921、IFO6922、IFO6923、IFO6924、IFO6926和IFO6928〔以上源於(財)發酵研究所〕的乾燥物粉末(50mg/kg/day)以外，重複上述評價例1(1)的步驟，對於這些松蕈株也確認了NK細胞活性的恢復，但是均沒有超過本發明的松蕈FERM BP-7304株的恢復促進活性。(4)長野縣產松蕈子實體的熱水提取液乾燥物粉末以及各種蘑菇的熱水提取液乾燥物粉末的評價除使用上述實施例5製備的長野縣產松蕈子實體的熱水提取液乾燥物粉末或者上述比較例1-3分別製備的Agaricus blazei子實體、靈芝子實體或香蕈子實體的各熱水提取液乾燥物作為評價用試樣以外，直接重複上述評價例1(1)的操作。另外，給藥量均為250mg/kg/day。
結果如表5所示。在表5中，符號「*」表示p＜0.01(相對於給予蒸餾水)。
表5NK細胞活性(LU30)0天1天3天5天7天 14天對照試驗47 48 48 49 4647(無壓力負荷)比較試驗6 8 13 26 2944(給予蒸餾水和壓力負荷)實施例5 10 14*22*34*37* 47比較例1 5 7 15 27 3037比較例2 3 8 11 24 2836比較例3 4 9 10 27 2940工業實用性採用本發明的壓力負荷恢復促進用藥物組合物，可以促進對壓力負荷的恢復。序列表獨立文本序列表的數字索引223中記載了「人工序列(ArtificialSequence)」的說明。具體而言，序列表中序列號1～序列號6的序列表示的鹼基序列構成的各寡核苷酸為引物RAPD1～引物RAPD6。
上面，以特定的方式說明了本發明，但是對於本領域技術人員來說顯而易見的變形和改良也包括在本發明的範圍內。
序列表序列表110吳羽化學工業株式會社120壓力負荷恢復促進用藥物組合物以及新型松蕈株130KRH-655150JP 2000-3110341512000-10-11150JP 2000-3110351512000-10-111606210121110212DNA213人工序列220223人工序列說明引物RAPD14001tggtcaccga210221110212DNA213人工序列220223人工序列說明引物RAPD24002agcgccattg210321110212DNA213人工序列220223人工序列說明引物RAPD34003ttcgagccag210421110212DNA213人工序列220223人工序列說明引物RAPD44004tgcgtgcttg210521110212DNA213人工序列220223人工序列說明引物RAPD54005gactagcctc210621110212DNA213人工序列220223人工序列說明引物RAPD64006ctcaccgtcc
權利要求
1.一種對於壓力負荷促進恢復用的藥物組合物，其中含有松蕈、松蕈的熱水提取液或其乾燥體、或者松蕈的鹼性溶液提取液或其乾燥體以及藥學上允許的載體。
2.如權利要求1所述的對於壓力負荷促進恢復用的藥物組合物，其中上述松蕈為松蕈FBRM BP-7304株。
3.如權利要求1或2所述的對於壓力負荷促進恢復用的藥物組合物，其中上述松蕈為菌絲體、培養物或子實體。
4.一種對於壓力負荷促進恢復用的功能性食品，其中單獨含有松蕈、松蕈的熱水提取液或其乾燥體、或者松蕈的鹼性溶液提取液或其乾燥體，或者根據需要還含有1種或1種以上的食品成分。
5.如權利要求4所述的對於壓力負荷促進恢復用的功能性食品，其中上述松蕈為松蕈FERM BP-7304株。
6.如權利要求4或5所述的對於壓力負荷促進恢復用的功能性食品，其中上述松蕈為菌絲體、培養物或子實體。
7.一種對於壓力負荷促進恢復用的口腔衛生用組合物，其中含有松蕈、松蕈的熱水提取液或其乾燥體、或者松蕈的鹼性溶液提取液或其乾燥體以及口腔衛生用組合物的載體。
8.如權利要求1所述的對於壓力負荷促進恢復用的口腔衛生用組合物，其中上述松蕈為松蕈FERM BP-7304株。
9.如權利要求7或8所述的對於壓力負荷促進恢復用的口腔衛生用組合物，其中上述松蕈為菌絲體、培養物或子實體。
10.一種對於壓力負荷的恢復促進方法，包括將松蕈、松蕈的熱水提取液或其乾燥體、或者松蕈的鹼性溶液提取液或其乾燥體以有效量給予必需促進對壓力負荷的恢復的對象。
11.如權利要求10所述的對於壓力負荷的恢復促進方法，其中上述松蕈為松蕈FERM BP-7304株。
12.如權利要求10或11所述的對於壓力負荷的恢復促進方法，其中上述松蕈為菌絲體、培養物或子實體。
13.松蕈、松蕈的熱水提取液或其乾燥體、或者松蕈的鹼性溶液提取液或其乾燥體在製備對於壓力負荷促進恢復用的藥物組合物、對於壓力負荷促進恢復用的功能性食品、或者對於壓力負荷促進恢復用的口腔衛生用組合物中的用途。
14.如權利要求13所述的用途，其中上述松蕈為松蕈FERM BP-7304株。
15.如權利要求13或14所述的用途，其中上述松蕈為菌絲體、培養物或子實體。
16.松蕈FERM BP-7304株。
17.松蕈FERM BP-7304株的菌絲體、培養物或子實體。
18.松蕈FERM BP-7304株的熱水提取液或其乾燥體，或者松蕈FERM BP-7304株的鹼性溶液提取液或其乾燥體。
19.如權利要求18所述的熱水提取液或其乾燥體或者鹼性溶液提取液或其乾燥體，其中松蕈FERM BP-7304株為菌絲體、培養物或子實體。
全文摘要
本發明公開了含有松蕈、松蕈的熱水提取液或其乾燥體、或者松蕈的鹼性溶液提取液或其乾燥體以及藥學上允許的載體的對於壓力負荷促進恢復用的藥物組合物，以及新型的松蕈FERM BP－7304株。
文檔編號A61P3/00GK1469751SQ01817304
公開日2004年1月21日 申請日期2001年10月10日 優先權日2000年10月11日
發明者松永謙一 申請人:吳羽化學工業株式會社