日本血吸蟲病SjPPase重組抗原蛋白及其在療效考核中的應用的製作方法

2023-09-17 00:25:20 2

本發明屬於免疫學領域，具體涉及一種日本血吸蟲無機焦磷酸酶(sjppase)重組抗原蛋白在日本血吸蟲病的療效考核中的應用。
背景技術：
：日本血吸蟲病是由於人或哺乳動物感染日本血吸蟲引起的一種人畜共患的寄生蟲病，主要分布在中國南部地區、菲律賓和印度尼西亞。儘管在中國已經有超過50年的血吸蟲病防治史，但是日本血吸蟲病仍然是目前中國重要的公共衛生問題之一，主要在我國7省110縣市區流行，仍然有79萬患者，受威脅人口6500萬。日本血吸蟲童蟲到成蟲的發育階段在哺乳動物宿主體內完成，該過程中童蟲生長較快、發育為成蟲的歷時較短。而後，其長期的寄生給宿主帶來一系列的病理反應。因此，日本血吸蟲童蟲的發育不僅是血吸蟲完善自己的過程，而且是宿主發生病理性變化的推動性因素。無機焦磷酸酶(ppase，inorganicpyrophosphatase)是一種與日本血吸蟲童蟲發育相關的蛋白質類催化劑，可以催化一分子無機焦磷酸鹽(ppi，inoraganicpyrophosphate)水解生成兩分子無機磷酸鹽(pi，inorganicphosphate)。與無催化劑的情況相比，ppase可使ppi的水解速率提高至原來的1010倍。ppi是許多生物大分子(如dna、rna、蛋白質等)合成過程中的副產物，ppi的快速水解反應為這些生物大分子合成反應的正向進行形成一個熱力學的推動力，加速了生物大分子的合成，進而推動日本血吸蟲童蟲的發育。血吸蟲感染宿主後，機體受抗原刺激所產生的抗體在宿主體液內會維持較長的時間，即使感染者得到有效治療(體內蟲體已經死亡)，其體內抗體水平仍維持較高水平，故不能確定其是否需要繼續治療。因而尋找某些治療後消失較快的抗體即「短程抗體」，成為血吸蟲病療效考核的研究熱點之一。現有的免疫診斷抗原無法有效區分現症感染和既往感染，故常導致已治癒患者的反覆用藥，這不但加重用藥者的精神負擔，也可能降低血吸蟲對藥物的敏感性。因此，發現和尋找那些具有高敏感性，同時能檢測出區分現症感染和既往感染的可用於日本血吸蟲病療效考核的抗原靶點非常重要。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題在於，提供一種日本血吸蟲sjppase重組抗原蛋白，其對日本血吸蟲病具有陽性檢出率高、特異性強的特點，可用於日本血吸蟲病的療效考核。本發明所要解決的另一技術問題在於，提供一種以sjppase重組抗原蛋白為基礎建立的日本血吸蟲病免疫診斷方法。為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現：本發明提供一種日本血吸蟲sjppase重組抗原蛋白，其具有seqidno：1所示胺基酸序列。該重組抗原蛋白可催化無機焦磷酸鹽(ppi)水解生成磷酸鹽，分子量為mr36000。本發明提供一種檢測日本血吸蟲病的檢測產品，該檢測產品包括具有seqidno：1所示胺基酸序列的日本血吸蟲sjppase重組抗原蛋白。本發明的的日本血吸蟲sjppase重組抗原蛋白可以用於製備成檢測日本血吸蟲病的各種檢測產品，包括檢測試紙、檢測試劑或檢測試劑盒等。所述sjppase重組抗原蛋白的應用，用於診斷日本血吸蟲病。所述sjppase重組抗原蛋白的應用，用於日本血吸蟲病的療效考核。本發明的有益效果：本發明包括日本血吸蟲無機焦磷酸酶sjppase重組抗原蛋白，其胺基酸序列如seqidno：1所示，是可以催化無機焦磷酸鹽(ppi)水解生成磷酸鹽的蛋白。本發明首次提出將sjppase重組蛋白應用於日本血吸蟲病診斷，其對日本血吸蟲病患者血清的敏感性為88.8％(71/80),陽性檢出率高，診斷特異性為97.5％(39/40)，特異性強。不僅可以用於診斷日本血吸蟲病，而且可以進行療效考核，具有廣闊的市場空間和較好的社會、經濟效益。具體實施方式下面將對本發明的技術方案進行清楚、完整的描述，顯然，所描述的實施例是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。實施例1日本血吸蟲sjppase重組抗原蛋白用於日本血吸蟲病的診斷和療效考核價值的評價1材料1.1日本血吸蟲病患者吡喹酮治療前、治療後3個月、治療後6個月的血清樣本，從四川省日本血吸蟲病流行區採集；正常人血清採自蘇州市1.2羊抗人全分子igg，來自於sigma公司。2方法2.1重組抗原sjppase檢測吡喹酮治療前日本血吸蟲病患者及正常人血清的檢測結果1)用包被液稀釋抗原至最終濃度為4ng/μl，100μl/孔，37℃孵育2h，用pbs-t洗滌3次，每次3min；2)用1％bsa(pbs稀釋)，100μl/孔，37℃孵育1h，用pbs-t洗滌3次，每次3min；3)將一抗(日本血吸蟲病患者吡喹酮治療前及正常人血清)用pbs-t稀釋(1:100)，100μl/孔，37℃孵育1h，用pbs-t洗滌3次，每次3min；將二抗(羊抗人全分子igg)用pbs-t稀釋(1:10000)，100μl/孔，37℃孵育1h，用pbs-t洗滌3次，每次3min；4)加tmb底物顯色液，100μl/孔，常溫3min左右，加2mh2so4終止液，100μl/孔；5)將96孔板放入酶標儀中讀數，光波波長為450nm。待檢測od值大於陰性對照2倍者為陽性，當陰性對照od值低於0.05時按0.05計算。2.2重組抗原sjppase對吡喹酮治療後3個月、6個月日本血吸蟲病患者血清的檢測結果elisa檢測方法同2.1，一抗為日本血吸蟲病患者吡喹酮治療後3個月、6個月血清。3數據統計分析使用excel電子表格處理軟體對實驗數據進行整理和統計分析。4結果4.1重組抗原sjppase檢測吡喹酮治療前日本血吸蟲病患者及正常人血清的檢測結果用重組抗原sjppase分別對受日本血吸蟲感染的病人血清和正常人血清進行elisa的igg檢測，以檢測od值大於陰性對照2倍為陽性判斷值，其敏感性為88.8％(表1)，特異性為97.5％(表2)。表1重組抗原sjppase檢測吡喹酮治療前日本血吸蟲病患者血清中igg的結果檢測方法陽性數陰性數陽性檢出率sjppase-elisa71988.8％表2重組抗原sjppase檢測正常人血清中igg的結果檢測方法檢測例數陽性數陽性率sjppase-elisa4012.5％4.2重組抗原sjppase對吡喹酮治療後3個月、6個月日本血吸蟲病患者血清的檢測結果重組抗原sjppase對吡喹酮治療後37例日本血吸蟲病患者血清的檢測結果如表3所示，其治療後3個月、6個月的陰轉率分別為24.3％和43.2％。表3重組抗原sjppase檢測吡喹酮治療後3個月、6個月日本血吸蟲病患者血清療效考核結果5討論血吸蟲病仍然是一種世界範圍內流行的主要寄生蟲病，雖然我國已經在日本血吸蟲病的防治工作中取得了卓越成就，但是目前仍缺乏能對血吸蟲病進行療效考核的方法。基因工程技術為發展檢測人血清抗體的重組抗原製備與檢測方法提供了方便，基於elisa免疫檢測方法具有較高的實用性，且已廣泛應用於日本血吸蟲病輔助診斷和血清流行病學監測。本發明基於日本血吸蟲sjppase重組抗原對吡喹酮治療前、治療後3個月、6個月以及正常人血清進行elisa檢測，結果表明sjppase重組抗原對日本血吸蟲病患者血清的敏感性為88.8％(71/80),診斷特異性為97.5％(39/40)，其陽性檢出率高、特異性強。吡喹酮治療後3個月、6個月的日本血吸蟲病患者血清陰轉率分別為24.3％(9/37)和43.2％(16/37)。不僅可以用於診斷日本血吸蟲病，而且可以進行療效考核，具有廣闊的市場空間和較好的社會、經濟效益。綜上所述，上述各實施例僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限定本發明的保護範圍，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，皆應包含在本發明的保護範圍內。序列表中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所sjppase重組抗原蛋白在日本血吸蟲病診斷及療效考核中的應用cpc-np-17-1005121patentinversion3.41287prt人工序列1msvergtsnsasykmflthggspisyfhdvplfadatnncynmiveiprwtnakmeicke60elmnpikhdvknnklryiynvfphkgyiwnygalpqtwedpsyvdedtkakgdndpidvc120eigskiwpsgsvipvkvlgilgmidegetdwkviainvadpmaeklndildvdahmpgfl180katrdwfkyykvpagkpensfafngefknkefavkiiskthehwqklistkveagpiira240nvtvkgspymvskedfidalqkhedfkrgseptdqaieqwhfcntni287當前第1頁12