一種催化合成肌肽的氨肽酶及其製備方法和應用與流程
2023-09-17 00:18:55
本發明涉及一種合成肌肽的方法，尤其是採用高效的氨肽酶催化和現代化的分離技術的肌肽合成方法，具體是一種催化合成肌肽的氨肽酶及其製備方法。
背景技術：
l-肌肽1900年首次在牛肉中發現，在哺乳動物的大腦、肌肉和其他組織中廣泛存在，其結構主要由β-丙氨酸和l-組氨酸兩部分組成，是一種天然的活性二肽，在水、0.1mol/l鹽酸和0.1mol/l氫氧化鈉中易溶，在甲醇、乙腈、無水乙醇、三氯甲烷和丙酮中幾乎不溶。研究證明l-肌肽有抗氧化作用，有抗衰老功能，對高血壓、心臟病、老年性白內障、潰瘍等都有治療效果，還有抗腫瘤等生物活性，可延緩皮膚衰老。與其他抗氧化劑相比，l-肌肽具有抗氧化能力強、無毒副作用的優點，並有多種生理活性，在醫藥、保健、衛生、美容等領域有廣泛的應用前景。目前，l-肌肽新的生理活性與機制的探索仍是熱點。文獻報導的l-肌肽的化學合成方法較多，主要有兩大類：（1）有β-丙氨酸參與的反應。大致的方法是β-丙氨酸經氨基保護、羧基活化後與保護的l-組氨酸反應，然後脫掉保護基團得到產品肌肽。（2）無β-丙氨酸直接參與的反應。大致方法為l-組氨酸先與不同的β-丙氨酸前體反應生成肽鍵，再經進一步反應轉換為肌肽。在本發明中使用氨肽酶催化l-組氨酸與β-丙氨酸合成肌肽，制酶成本低，合成時間短、轉化率高、環境友好，工藝操作簡單、安全等，具有大規模工業應用的廣泛前景。
技術實現要素：
為了解決以上問題，本發明的第一個目的在於提供一種催化合成肌肽的氨肽酶。
本發明的第二個目的是提供一種編碼所述催化合成肌肽的氨肽酶的核苷酸序列。
本發明的第三個目的是提供一種催化合成肌肽的氨肽酶的製備方法。
本發明提供肌肽的氨肽合成採用氨肽酶法催化一步合成肌肽；
本發明採用酶高效催化組氨酸和β丙氨酸生成肌肽，並採用現代化的先進分離技術，使肌肽的工業化生產成本大大降低。
本發明的技術方案如下：
一種催化肌肽生物合成的氨肽酶，所述氨肽酶為seqidno：2所示的胺基酸序列。
根據本發明所述催化肌肽生物合成的氨肽酶，所述氨肽酶來源於體外重組構建的基因工程菌株。
根據本發明所述催化肌肽的生物合成的氨肽酶，所述基因工程菌株為大腸桿菌、畢氏酵母、枯草芽孢桿菌。
本發明還提供一種編碼所述的氨肽酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列如seqidno：1所示。
本發明還提供一種所述的氨肽酶基因工程菌的製備方法，包括如下步驟：
（1）首先構建氨肽酶的基因工程菌株，將上述seqidno：1所示的核苷酸序列經酶切重組到表達載體，轉化到宿主細胞中；
（2）取原種菌種在ypd平板上劃線，30℃，倒置培養40h；
（3）在平板上挑取單菌落轉移至液體培養基中，30℃，振蕩培養24小時，od600增長至4～5；
（4）以10%的接種量接種至液體培養基的搖瓶中，30℃，200rpm振蕩培養，約24小時後od600生長至12左右；
（5）將發酵培養基配製好後，轉移至發酵罐中，121℃滅菌30min；降溫至30±2℃，使用氨水調節ph值至5.0；
（6）將培養好的菌種液接種至發酵罐，接種量5%；
（7）根據溶氧調節轉速和通氣，保持溶氧在30%以上，誘導發酵96小時後，放罐；
（8）離心，收集清液；
（9）將清液超濾濃縮後凍幹，得到合成肌肽用氨肽酶的凍乾粉。
採用上述的氨肽酶催化合成肌肽的方法，包括如下步驟：
1）β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽合成：
1.1）向反應釜中加入甲醇，控溫0～20℃將氯化亞碸滴入其中，滴加完畢，加入β-丙氨酸，30～60℃保溫攪拌；
1.2）30～50℃減壓，真空度≤-0.09mpa，濃縮，濃縮至無餾分流出，得β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽；
2）酶催化反應：
2.1向反應釜中加入l-組氨酸、去離子水、上述反應製備的β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽；
2.2在15～45℃溫度下，用鹼性溶液調節ph值至7.0～9.0；
2.3加入如權利要求4所述製備的氨肽酶，該氨肽酶的用量為反應液體積的1%～3%，25～45℃攪拌反應，反應過程中用鹼性溶液控制反應體系ph值在7.0～9.0；
3）肌肽粗品製備：
3.1反應完畢，放料，料液離心除去不溶物，收集濾液；
3.2將得到的濾液通過超濾機進行超濾，收集超濾透析液；
3.3將得到的超濾透析液通過納濾機進行納濾，收集納濾濃縮液；
3.4將納濾濃縮液上離子樹脂柱，樹脂柱的徑高比為0.05～0.2，上樣ph值為5.0～7.0；
3.5用純化水衝洗樹脂柱；
3.6用1%～5%的氨水洗脫解吸附樹脂柱，收集茚三酮顯色部分洗脫液；
3.7將收集的洗脫液50～80℃減壓，真空度≤-0.09mpa，濃縮肌肽含量至20～40%；
3.8加入析晶溶劑，0～25℃，攪拌析晶10～24h；
3.9析晶完畢，放料離心，30～50℃，減壓，真空度≤-0.09mpa，乾燥6～8h，得肌肽粗品。
作為優選，所述的析晶溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇或丙酮中的一種。
作為優選，所述的超濾機的濾膜孔徑為8000～10000道爾頓。
作為優選，所述的納濾機的濾膜孔徑為200～300道爾頓。
有益的效果：在本發明中使用氨肽酶催化l-組氨酸與β-丙氨酸合成肌肽，相比傳統化學法，其汙染小、反應周期短，能耗低，酶反應生成率高，可到達95%以上，更利於產業化。本發明採用濾膜孔徑為8000-10000道爾頓的超濾機，可在酶反應後有效去除反應液中殘留的大分子酶，減少成品的雜質。本發明採用濾膜孔徑為200-300道爾頓的納濾機，可有效去除反應液中的小分子無機鹽，減少成品的雜質，且汙染小，成本低，適於酶催化合成肌肽工藝的產業化。
具體實施方式
以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅由於說明本發明而非用於限定本發明的範圍。
實施例1：氨肽酶的基因工程菌株構建
將全基因合成的生物酶片段（序列如seqidno：1所示，由常州基宇生物科技有限公司合成），經限制性內切酶ecorⅰ和notⅰ（購自newenglandbiolabs公司，根據說明書進行操作）酶切後重組到酵母表達載體ppic9k（invitrogen公司），轉化到e.colitop10感受態（購自北京全式金生物技術有限公司），將e.colitop10置於lb液體培養基中，37℃、160rpm轉振蕩培養過夜，提取重組質粒。利用限制性內切酶salⅰ（購自newenglandbiolabs公司，根據說明書進行操作）線性化重組質粒。
巴斯德畢赤酵母gs115感受態細胞（invitrogen公司）：將pichiapastorisgs115單菌落挑入ypd培養基中活化，活化的pichiags115按0.5%的接種量接入50mlypd培養基中30℃培養至對數期，離心獲得的菌體用20ml無菌水洗2次，再用20ml無菌1m山梨醇洗2次，加入1ml1m山梨醇溶液重懸菌體獲得巴斯德畢赤酵母gs115感受態細胞。
將線性化片段加入到80μl巴斯德畢赤酵母gs115感受態細胞中冰浴5分鐘，電轉化後加入800μl山梨醇將細胞洗至1.5ml無菌離心管中，25℃溫育2小時後，離心塗md平板，30℃培養至長出菌落後，劃線分離出單菌落。將單菌落挑入無菌水中加入適量lyticase（購自sigma公司）後37℃溫育1小時消化細胞壁，取部分消化產物加入pcr體系檢測陽性克隆。
將陽性克隆挑入ypd液體培養基後轉接入bmgy液體培養基中，培養至od為1.0時接入1%甲醇誘導，誘導72小時，每24小時補加一次甲醇用於表達本發明的生物酶。
實施例2：氨肽酶的發酵製備
取原種菌種在ypd劃線，30℃，倒置培養過夜。在平板上挑取單菌落（直徑1mm）至50mlypd液體培養基（酵母粉10g，蛋白腖10g，葡萄糖10g，加水定容至1l）中，30℃，200rpm振蕩培養過夜（24h），od600增長至4-5。以10%的接種量接種至含300mlypd液體培養基（1l三角瓶）搖瓶中，30℃、200rpm搖床振蕩培養，約24小時後od600長到12左右。將發酵培養基配製完成後，轉入發酵罐（30l），121℃滅菌30min；降溫至30℃，使用氨水調節ph值至5.0。將培養好的菌種液接種至發酵罐，接種量5%。根據溶氧調節轉速和通氣，控制溶氧在30%以上。培養24小時左右，待溶氧突變上升，此時溼重約為140g/l，開始補料50%（w/v）甘油水溶液，補料速度約為15ml/l發酵液/小時，補料速度控制溶氧保持在30%以上；待菌種溼重長至180g/l左右，停止補加甘油，以7.2ml/l發酵液/小時流速流加100%甲醇，誘導10小時後，ph值調節為6.0，誘導24小時，ph調節為7.0，補料速度保持不變，根據溶氧調節轉速和通氣，保持溶氧在30%以上。誘導96小時菌體溼重約為340g/l左右放罐。離心，收集清液，超濾濃縮後凍幹，得到合成肌肽用生物酶凍乾粉。
實施例3氨肽酶催化合成肌肽
包括如下步驟：
1）β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽合成：
1.1）向反應釜中加入甲醇，控溫0～20℃將氯化亞碸滴入其中，滴加完畢，加入β-丙氨酸，30～60℃保溫攪拌；
1.2）30～50℃減壓，真空度≤-0.09mpa，濃縮，濃縮至無餾分流出，得β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽；
2）酶催化反應：
2.1向反應釜中加入l-組氨酸、去離子水、上述反應製備的β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽；
2.2在15～45℃溫度下，用鹼性溶液調節ph值至7.0～9.0；
2.3加入如權利要求4所述製備的氨肽酶，該氨肽酶的用量為反應液體積的1%～3%，25～45℃攪拌反應，反應過程中用鹼性溶液控制反應體系ph值在7.0～9.0；
3）肌肽粗品製備：
3.1反應完畢，放料，料液離心除去不溶物，收集濾液；
3.2將得到的濾液通過超濾機進行超濾，收集超濾透析液；
3.3將得到的超濾透析液通過納濾機進行納濾，收集納濾濃縮液；
3.4將納濾濃縮液上離子樹脂柱，樹脂柱的徑高比為0.05～0.2，上樣ph值為5.0～7.0；
3.5用純化水衝洗樹脂柱；
3.6用1%～5%的氨水洗脫解吸附樹脂柱，收集茚三酮顯色部分洗脫液；
3.7將收集的洗脫液50～80℃減壓，真空度≤-0.09mpa，濃縮肌肽含量至20～40%；
3.8加入析晶溶劑，0～25℃，攪拌析晶10～24h；
3.9析晶完畢，放料離心，30～50℃，減壓，真空度≤-0.09mpa，乾燥6～8h，得肌肽粗品。
本實施例中，所述的析晶溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇或丙酮中的一種。
本發明所述的超濾機的濾膜孔徑為8000～10000道爾頓；所述的納濾機的濾膜孔徑為200～300道爾頓。
在本發明中使用氨肽酶催化l-組氨酸與β-丙氨酸合成肌肽，相比傳統化學法，其汙染小、反應周期短，能耗低，酶反應生成率高，可到達95%以上，更利於產業化。本發明採用濾膜孔徑為8000-10000道爾頓的超濾機，可在酶反應後有效去除反應液中殘留的大分子酶，減少成品的雜質。本發明採用濾膜孔徑為200-300道爾頓的納濾機，可有效去除反應液中的小分子無機鹽，減少成品的雜質，且汙染小，成本低，適於酶催化合成肌肽工藝的產業化。
seqidno：1
atgcgtattcgcgatctgctgccgaatctgcgtctgggtcgtcattcaccgggtccgctgaatagtctgaccgacgttccgggcgtactggttcatacccagagcgttatcctgccgaaaaccgcacatcatcacgaagttaataccggcgtcacctgtattctgccgcgtcgcgattttgttgatcagggctgttacgcgagcgtttttcgctttaacggttgcggcgaaatgaccggtagtcattggattgacgaaacgggtctgctgaacagcccgattgttctgaccaacagctacagcgttggcgcagcatatagcggcatttatcagcattgccgtagtcagctggctgttaaacagggtccggaaaaaggtctgtgcaacggtttcattctgccggttgtcagcgaaaccttcgacggttatctgagcgatattggcgcaatggcagttaccccggaacacgttgcacaaggtattgagtctgcctctgcgatgcaagttccggaaggtaataccggcggcggtaccggtaccatttgtcagggctttaaaggcggtaccggttctagcagccgcgttattgacggtctgatttctgaaggcggcgaaggtagtaaaccggttaaatacaccattgcggcactggttcagaccaactttggtaccagtcgcgatctgcgcgttggtggcgttccggttggtcagctgatgaaagaagaagtcattgcagaagcaaccacccgtcgtgaagacgaaggcgttaaagacggtagcattattgtagttctggcaaccgacgcaccgctgcatccgctgcaactgcaacgcgttgcaaaacgtgcggcagttggtttttctcgcgttggtggttggggtagtaatagctcaggcgatatcttcctggcgtttagcaccagccatcatattccgcgcgatccggtatttagctggaaaccgaccgttggtcagagcgtgcaggttgttcaggacgttaccagcaacgcactgtttgaagcagcagcagacgttaccgaagaagcaatttataacgcgctgtgttgcgcccaagatatgcgcggtccggcaggtcgttttgttcgcgcactggatctggagaaactgaaaagcatcgtcgagaaatacctgtga
seqidno：2
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