用於蛋白質生物晶片的明膠基基質的製作方法
2023-09-17 00:28:00
專利名稱：用於蛋白質生物晶片的明膠基基質的製作方法
技術領域：
本發明大體上涉及蛋白質微陣列的製作，特別涉及採用明膠基基質的方法，其中明膠表面被修飾，以改善生物分子的特異性附著。
背景技術：
人類基因組計劃的完成激發了新的跨學科領域蛋白質組學的快速發展，其包括基因組編碼的全套蛋白質的鑑定和表徵、蛋白質合成、翻譯後修飾以及在細胞調節水平上對蛋白質相互作用的詳細作圖。
雖然二維凝膠電泳與質譜聯用仍為蛋白質組學研究的主要技術，但DNA微陣列技術在基因分布和基因發現中的成功移植和應用，已促使科學家開發蛋白質微陣列技術和將基於微晶片的蛋白質分析應用於蛋白質組學領域。例如，在WO 00/04382和WO 00/04389中公開了製作蛋白質微陣列的方法。上述公開內容的一個關鍵元件是由包被單層有機薄膜的固相支持物組成的基質，蛋白質或者蛋白質捕捉劑可在其上固定化。
硝酸纖維素膜在蛋白質印跡法和酶聯免疫吸附測定法(ELISA)中廣泛用作蛋白質印跡基質。在WO 01/40312和WO 01/40803中，抗體用網格(griding)機器人裝置點印在硝酸纖維素膜上。已證實硝酸纖維素膜基質上的這種點印抗體微陣列可用於大量平行地分析蛋白質混合物。
Mendoza等在WO 98/29736中描述了抗體固定化於N-羥基琥珀醯亞胺酯修飾的玻璃基質上的抗體微陣列。在美國專利第5,981,734號和WO 95/04594中，描述了用以製作DNA微陣列的聚丙烯醯胺基水凝膠基質技術。最近，在Anal.Biochem.(2000)278，123-131中進一步證明上述水凝膠技術可用作蛋白質微陣列製作中的蛋白質固定化基質。
在以上引證的實例中，所有這些不同方法的共同特點是需要固相支持物，其能允許蛋白質或者蛋白質捕捉劑共價或者非共價附著於所述支持物表面上。在DNA微陣列技術中，已製備了多種表面，供預合成的寡核苷酸和PCR製備的cDNA探針沉積其上。例如，在EP 1 106603A2中，公開了在表面上製備乙烯基磺醯基反應基團以生產DNA晶片的方法。雖然該發明可用於製備DNA晶片，但卻不適合於蛋白質微陣列的應用。蛋白質與DNA不一樣，它們趨向於非特異性地與表面結合，且這樣會喪失其生物活性。因此，蛋白質微陣列基質的特徵與DNA微陣列基質的不同之處在於，蛋白質微陣列基質不僅須提供能夠與蛋白質捕捉劑相互作用的表面官能度，而且須阻止蛋白質與沒有沉積蛋白質捕捉劑的區域非特異性結合。
已證明牛血清白蛋白(BSA)是封閉蛋白質非特異性表面結合的有用試劑。聚乙二醇和磷脂也已被用來使表面鈍化和提供能阻止非特異性結合的表面。但是，所有這些方法要麼因為製備表面需要花費很長時間，要麼因為表面修飾方法複雜費力，不免有各種缺點，使得這些方法不是大規模工業生產的理想選擇。
美國申請系列號10/020,747和10/091,644描述了製備蛋白質微陣列基質的低成本方法，該方法採用明膠包被來製備用以固定化蛋白質捕捉劑的反應性表面。雖然明膠修飾表面能有效消除非特異性蛋白結合，但需要將這種表面包被到尺寸穩定的固相支持物上，以便使用。
本領域需要具有化學官能度的尺寸穩定的基質，以固定化蛋白質捕捉劑，但是這種基質在表面上必須具有足夠的粘合強度，以粘合包被明膠的上層，使得當包被基質在任何生物處理過程中潮溼時，明膠層不會起皺褶，當包被基質變幹時，明膠層不會脫落。
本領域公知玻璃板尺寸穩定，是生物學應用中的優選固相支持物。將親水粘合劑如明膠包被到玻璃上是費神費力的苦差事，因為需要在玻璃和粘合劑之間塗敷相容性粘合夾層。這種粘合夾層應當具有以下性質1.它必須是對蛋白質微陣列應用沒有光學幹擾的薄膜；2.它必須不含對摻入到粘合劑表面的蛋白質捕捉劑的附著作用產生化學幹擾的任何成分；3.它必須容易生產。
本發明的目的是提供能解決以上討論的某些問題的蛋白質微陣列元件，以及提供製備這種蛋白質微陣列元件的方法。
發明概述本發明通過提供包括以下部分的蛋白質微陣列元件，克服以上討論的某些問題a)支持物；b)含有能夠結合生物探針的官能團的明膠層；以及在支持物和明膠層之間插入的c)能夠保持與支持物和與明膠層的接觸的粘合夾層。
本發明的另一個實施方案公開包括以下部分的蛋白質微陣列元件a)支持物；b)在所述支持物上安置能夠保持與支持物和與下述明膠層的接觸的粘合夾層；c)具有三官能化合物A-L-B的明膠層；其中A是能夠與明膠相互作用的官能團；L是能夠與A和B相互作用的連接基團；B是能夠與蛋白質捕捉劑相互作用的官能團；其中A與B可相同或者不同。
在本發明的又一個實施方案中，公開了製備用以製作蛋白質陣列的明膠基基質的方法，所述方法包括以下步驟-提供支持物；-在支持物上包被粘合層；-在所述粘合層上包被含三官能化合物A-L-B的明膠層；其中A是能夠與明膠相互作用的官能團；L是能夠與A和B相互作用的連接基團；B是能夠與蛋白質捕捉劑相互作用的官能團；其中A與B可相同或者不同。
本發明特別有助於製作蛋白質微陣列。本發明提供的基質具有能夠與固定化於其表面上的蛋白質捕捉劑發生特異性相互作用的官能度；且能基本阻止非特異性結合。
按本發明製備的基質與未修飾的明膠基質相比，其甚至在生物樣品中的分析物濃度非常低時也能檢測出這些分析物。可以較低成本容易地製備本發明的明膠基質。在以下實施例中使用幾種化學修飾方法和酶聯免疫吸附測定法(ELISA)，證明了本發明要求保護的蛋白質吸附用基質的有效性。
發明詳述大體上，本發明的蛋白質微陣列可如下製備首先修飾固相支持物，即蛋白質微陣列支持物，然後將各種蛋白質捕捉劑沉積到修飾基質的預定位置。蛋白質微陣列應用可選的支持物可以是有機支持物或者無機支持物。某些常用的支持物材料包括玻璃、塑料、金屬和半導體。支持物可以是透明的或者半透明的、柔韌的或者硬的。在某些情況下，支持物可以是多孔薄膜如硝酸纖維素膜和聚1，1-偏二氟乙烯膜，蛋白質捕捉劑通過物理吸附沉積到薄膜上。但是，為改善牢固性和重現性，更希望使用具有尺寸穩定性的固相支持物。
玻璃或者說熔凝二氧化矽是本領域最常用的微陣列支持物。在玻璃表面上產生蛋白質吸附作用的常規方法是，使用Edwin P.Plueddemann，「Silane Coupling Agents」第2版，Plenum Press，New York，1991描述的矽烷偶聯化學，將合適的蛋白質吸附作用接枝到玻璃表面上。為進行這種接枝操作，玻璃表面必須經等離子體放電處理或者用化學試劑進行化學處理，以提供親水表面。但是，採用這些處理方法要產生高度均勻和無缺陷的表面十分困難。而且，這些處理方法不容易與為蛋白質微陣列基質的製作提供低成本和可製備手段的包被方法相整合。
一般來說，玻璃支持物是平坦的，其具有很高的光滑度和透明度。優選玻璃不會發出螢光，厚度在0.1mm-5mm之間，優選在0.5mm-2.0mm之間。玻璃支持物可為任何尺寸，且可按預定用途切成各種尺寸。在本發明的一個優選實施方案中，玻璃表面用夾層包被，為隨後包被摻入了蛋白質捕捉劑固定化作用的明膠上層提供親水表面。
明膠已在照相工業中用作各種化學成分的粘合劑，而且製備高質量明膠的工業方法已經完備。由於明膠是由生物材料製成的，它能與蛋白質微陣列上的蛋白質捕捉劑生物相容。包被明膠的表面為將蛋白質捕捉劑在蛋白質微陣列上的固定化提供了生物溫和表面。如本發明所示，明膠還帶來能顯著減少非特異性結合造成的本底噪聲的表面。
通常，將明膠包被到支持物上，通過明膠溶液或明膠懸浮液和其他材料形成表現非定常流的連續三維網絡的過程，發生膠凝作用。在聚合物中這可通過多官能單體存在下的聚合作用而發生，其通過具有反應性側鏈的溶解聚合物的共價交聯，及通過溶液中聚合物分子之間的二級鍵結合如氫鍵結合。明膠等的聚合物表現出屬後者類型的熱膠凝作用。膠凝作用或者說凝結的特徵是粘度的間斷性上升。(參見P.I.Rose，「The Theory of the Photographic Process」，第4版，T.H.James(編輯)第51-67頁)。
當明膠包被在固相支持物如玻璃、塑料、金屬上時，需要有夾層來防止當上層明膠包被在任何生物處理過程中潮溼時凝膠包被的起皺，同時防止當上層明膠包被變幹時發生脫落。一般來說，夾層由成膜親水膠體材料或者親水粘合劑組成。
夾層除了為明膠層的粘合提供足夠的粘合力之外，還應當透明，不發螢光。代表性夾層材料包括但不限於天然物質如蛋白質、蛋白質衍生物、明膠(例如鹼處理明膠如牛骨或牛皮明膠，或者酸處理明膠如豬皮明膠)和明膠衍生物(例如乙醯化明膠、鄰苯二甲醯化明膠等)。親水透水性膠體也可用作賦形劑補充劑。這包括合成高分子塑解劑、載體和/或粘合劑，如聚乙烯醇、聚(乙烯基內醯胺)、丙烯醯胺聚合物、聚乙烯醇縮醛、丙烯酸烷基酯和甲基丙烯酸烷基酯及丙烯酸磺基烷基酯和甲基丙烯酸磺基烷基酯的聚合物、水解聚乙酸乙烯酯、聚醯胺、聚乙烯吡啶、甲基丙烯醯胺共聚物等等。
在明膠作為優選夾層材料的情況下，在配方中還應包括有機溶劑或者溶劑混合物。這種有機溶劑的實例包括但不限於丙酮、醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、醚或者它們的混合物。為使明膠與這些有機溶劑混合均勻，配方中可以但不必要加入分散助劑，例如有機酸或鹼。為改善夾層的粘合強度，夾層配方中還包括矽酸鹽如矽酸鈉。為改善夾層的物理強度，優選夾層中的明膠用一種或者多種交聯劑硬化。明膠硬化劑的實例見於標準參考書例如The Theory of the Photographic Process，T.H.James，Macmillan Publishing Co.，Inc.(New York 1977)或者Research Disclosure，1996年9月，第389期，第IIB部分(硬化劑)中。無機硬化劑比有機硬化劑更優選。
在本發明的另一個實施方案中，可用高分子支持物包被摻入了蛋白質捕捉劑固定化作用的明膠層。能形成本發明支持表面的代表性高分子支持物包括纖維素酯，如硝酸纖維素和乙酸纖維素；聚乙烯醇縮醛聚合物；聚碳酸酯；聚酯，如雙官能飽和及不飽和脂族和芳族二羧酸與雙官能多羥基有機化合物如多羥基醇縮合形成的高分子線型聚酯——例如烷撐二醇和/或甘油與對苯二甲酸、間苯二甲酸、己二酸、馬來酸、富馬酸和/或壬二酸的聚酯；多滷烴如聚氯乙烯；及聚合烴如聚苯乙烯和聚烯烴，特別是含2-20個碳原子的烯烴的聚合物。這些支持物可單獨使用，或者可用作金屬、玻璃和其他固體表面上的包被。優選支持物在潮溼時具有相當大的尺寸穩定性。
當使用高分子支持物時，有必要進行表面處理，以為粘合明膠層提供合適的膠粘度。例如，可使用美國專利第2,764,520號、第3,497,407號、第3,145,242號、第3,376,208號、第3,072,483號、第3,475,193號、第3,360,448號、英國專利第788,365號等專利中描述的放電處理、火焰處理、紫外線處理、高頻處理、活性等離子體處理、雷射處理、輝光放電、LTV照射、電子束處理等。高分子支持物可用粘合促進劑，包括二氯乙酸和三氯乙酸、苯酚衍生物如雷瑣酚和對氯間甲酚進行表面處理，在用下夾層(subbing interlayer)如上述明膠夾層包被之前進行溶劑洗滌。除進行表面處理或者用粘合促進劑處理外，可向聚酯支持物塗敷另外的粘合促進底漆或者粘結層，其含例如以下的聚合物含亞乙烯基二氯的共聚物、丁二烯基共聚物、含丙烯酸縮水甘油酯或甲基丙烯酸縮水甘油酯的共聚物、含馬來酸酐的共聚物、縮聚物如聚酯、聚醯胺、聚尿烷、聚碳酸酯及它們的混合物和摻合物等。特別優選的底漆或者粘結層包括含氯膠乳或者可包被溶劑的含氯聚合層。含氯乙烯和亞乙烯基二氯的聚合物優選用作本發明的底漆或者下層。
正如美國專利第3,864,132號和英國專利第1,066,944號所描述，本領域已認識到，親水膠體層可通過無機氧化物粘合層(其與支持表面和與親水膠體層相接觸)牢固地結合到疏水高分子支持表面。這種粘合層(在本領域中常稱為下層)是無粘合劑層，基本由無機金屬氧化物組成，能夠直接與親水膠體層和與疏水高分子支持物表面牢固結合，以實現之前由複雜得多的高分子層實現的功能。術語「無粘合劑層」指基本不含有機粘合材料的層，特別指不含本領域通常使用的有機粘合劑和粘合材料，如天然和合成高分子粘合劑和膠體媒介。無粘合劑粘合層可由晶狀或者無定形無機氧化物構成。矽的氧化物如一氧化矽和二氧化矽是優選的無機氧化物，因為它們基本不溶於水，在照相處理和使用環境中為化學惰性，且本身透明。優選矽氧化物還因為它們可通過加熱到氣化溫度進行氣相澱積，其汽化溫度比實施本發明時所採用的其他無機氧化物所需的汽化溫度要低。氧化鋁、氧化硼-矽、氧化鎂、氧化鉭和氧化鈦及它們的混合物特別適合本發明的實施。無機氧化物粘合層可用作玻璃支持物上。
此外，在金屬支持物上可使用如美國專利第3,511,661號和第3,860,426號中所描述的粘合夾層。例如，鋁因為容易獲得和成本低廉，是照相工業中的優選金屬支持物。通常，在塗敷粘合夾層之前，可在鋁支持物表面上進行如美國專利第4,608,131號、第4,092,169號和第4,446,221號中所描述的陽極氧化。
為使蛋白質捕捉劑固定化，包被了粘合夾層的支持物還需要包被一層用某些化學官能劑(functional agent)修飾過的明膠。一般來說，化學官能劑是A-L-B所示的雙官能分子，其中A和B是能夠與明膠和待固定化於基質上的蛋白質捕捉劑反應或者相互作用的化學官能度，L是連接基團。優選L是其連接A和B的兩端之間的鍵貫穿途徑(through-bond path)長度不大於10個原子的雙基。
有兩類雙官能劑1)如果A＝B，為同官能劑；2)如果A≠B，則為雜官能劑。某些常用的A和B包括但不限於醛、環氧、醯肼、乙烯碸、琥珀醯亞胺酯、碳二亞胺、馬來醯亞胺、聯硫基、碘乙醯基、異氰酸酯、異硫氰酸酯、氮丙啶。連接基團L包括足以連接A和B兩個官能度的相對穩定的共價鍵合化學單元的任何合理組合。這些化學單元可包括但不必限於單鍵、碳原子、氧原子、硫原子、羰基 羧酸酯基 醯胺基 磺醯基 氨磺醯基 乙烯氧基、聚乙烯氧基或者氨基 其中取代基X、Y和Z各自獨立為氫原子或含1-10個碳原子的烷基；含1-10個碳原子的直鏈或者支鏈、飽和或者不飽和的烷基(如甲基、乙基、正丙基、異丙基、叔丁基、己基、癸基、苄基、甲氧基甲基、羥基乙基、異丁基和正丁基)；含6-14個碳原子的取代或者未取代芳基(如苯基、萘基、蒽基、甲苯基、二甲苯基、3-甲氧基苯基、4-氯苯基、4-甲氧甲醯苯基和4-氰基苯基)；含5-14個碳原子的取代或者未取代環烷基(如環戊基、環己基和環辛基)；取代或者未取代的、飽和或者不飽和的雜環基(如吡啶基、嘧啶基、嗎啉代和呋喃基)；氰基。還可將某些增溶基團引入到A-L-B，這些增溶基團的實例包括但不限於羧酸、磺酸、膦酸、異羥肟酸、氨磺醯和羥基(以及它們相應的鹽)。A和B也可以是容易與交聯劑反應的官能度形式，其實例包括但不限於羧基、氨基和氯甲基等。A和B可以是能夠與待固定化於基質上的蛋白質捕捉劑發生非共價相互作用親和標記物。例如，某些常用的標記系統包括但不限於鏈黴親和素和生物素、組氨酸標記和鎳金屬離子、穀胱甘肽-S-轉移酶和穀胱甘肽。本領域技術人員應當能夠運用重組DNA技術創建融合蛋白捕捉劑，標記識別單元的元件可通過這種方式引入到蛋白質捕捉劑中。
本發明意在獲得很高密度的可用於蛋白質固定化的化學部分。為實現這個目標，本發明採用了「聚合物支架」策略。對本發明目的來說，術語「聚合物支架」指富含特定官能度的直鏈或者支鏈聚合物，其從表面向外三維伸展。在這種情況下，官能團由能夠固定化蛋白質的化學單元組成，且表面是蛋白質。在一個製作蛋白質接受性聚合物支架的基本策略中，採用富含單元的前體聚合物，該單元能被轉化成使蛋白質固定化的化學官能團。前體聚合物被粘連到明膠表面，然後通過用化學試劑後處理被轉化成蛋白質接受性形式。所謂「粘連」是指前體聚合物被塗敷到明膠表面，然後通過各種化學和物理吸引機制粘附到明膠上，所述機制包括離子相互作用、共價鍵、配位鍵、氫鍵和範德華相互作用。
在優選的實施方案中，化學試劑為以上定義的A-L-B結構中的一種，前體聚合物富含硫醇、胺、膦、醇或者羧酸之類的反應性單元。優選反應性單元是伯胺和仲胺。可用於此目的的具體聚合物可選自但不必限於聚(丙烯亞胺)和N-氨基丙基(甲基)丙烯醯胺及其仲胺衍生物、N-氨基乙基(甲基)丙烯酸酯及其仲胺形式、二烯丙基胺、乙烯基苄胺、乙烯胺、(甲基)丙烯酸、乙烯基苄硫醇和羥乙基(甲基)丙烯酸酯的聚合物和共聚物。優選聚合物是聚(乙烯胺)、聚(丙烯亞胺)或者聚(N-氨基丙基甲基丙烯醯胺)。
可使用已知能夠導致在聚合物的反應性單元和明膠的胺或者羧酸官能度之間形成共價鍵的任何化學試劑或者技術，來實現支架聚合物粘連到明膠的表面。例如，可使用脫水劑如碳二亞胺、吡啶基二陽離子醚或者氨基甲醯吡啶鎓化合物，通過醯胺鍵將含胺聚合物或者含羧酸聚合物結合到明膠表面。類似地，可使用雙(乙烯基磺醯基)化合物將聚(乙烯亞胺)結合到明膠表面。支架聚合物一旦粘連到明膠表面，就用過量的適宜A-L-B化合物處理，為反應性表面提供高水平的反應性單元。
製作蛋白質接受性聚合物支架的第二種基本策略涉及將富含能固定化蛋白質的化學官能的聚合物直接粘連到明膠表面上。所述官能包括但不必限於醛、環氧、醯肼、乙烯碸、琥珀醯亞胺酯、碳二亞胺、馬來醯亞胺、聯硫基、碘乙醯基、異氰酸酯、異硫氰酸酯和氮丙啶。另外，可將超過一種類型的聚合物支架粘連到同一明膠支持物。
式I表示用以形成聚合物支架的優選聚合物 式I其中R1是氫原子或者C1-C6烷基。優選R1是氫原子。
Q是-CO2-或CONR1；v是1或0；w是1-3；L是含至少一個選自-CO2-和CONR1的連接鍵且含3-15個碳原子的二價連接基團，或者是含至少一個選自-O-、-N(R1)-、-CO-、-SO-、-SO2-、-SO3-、-SO2N(R1)-、-N(R1)CON(R1)-和-N(R1)CO2-的連接鍵且含1-12個碳原子的二價基團，其中R1的含義如上所定義。
R2是-CH＝CH2或-CH2-CH2X1，其中X1是可被親核基團替換的取代基或者是可以HX1的形式被鹼釋放的取代基。X1可以是但不必限於-S2O3-、-SO4-、-Cl、-Br、-I、季銨、吡啶鎓和-CN以及磺酸酯(如甲磺酸酯和甲苯磺酸酯)；x和y均表示10-90和90-10的摩爾百分數。優選x和y分別在25-75和75-25的範圍內。
在本發明的一個優選實施方案中，含乙烯碸側鏈或者乙烯碸前體單元側鏈的聚合物可於與明膠反應，以提供聚合物支架。本實施方案優選的聚合物的結構由式1所示，其由「G」單體和「H」單體的聚合產物組成，「G」單體賦予聚合物良好的溶解性質，「H」單體含有乙烯碸部分，或者更優選含有乙烯碸前體官能團，如在β-位置具有離去基團的磺醯基乙基。在同一聚合物中可有超過一種類型的G單體和H單體。雖然聚合物可具有任何分子量，但優選分子量(Mn)在1000-200,000AMU之間。特別優選分子量在2000-50,000AMI之間，條件是這樣的聚合物可溶於水或者水和水混溶性溶劑(如甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃等)的混合物。還可摻入另外的單體，以對具體應用中需要的性質加以修飾，例如玻璃化溫度、表面性質以及與其他配方成分的相容性。另外單體的選擇須視應用情況而定，這對本領域技術人員來說是顯而易見的。
G是聚合α，β-烯鍵式不飽和加成可聚合單體，其賦予聚合物水溶性。可以衍生出G的單體包括離子單體和非離子單體。離子單體可包括例如陰離子烯鍵式不飽和單體如丙烯酸2-膦醯乙酯鉀鹽、甲基丙烯酸3-膦醯丙酯銨鹽、丙烯醯胺、甲基丙烯醯胺、馬來酸及其鹽、磺基丙烯酸丙酯和磺基甲基丙烯酸丙酯、丙烯酸和甲基丙烯酸及其鹽、N-乙烯基吡咯烷酮、丙烯酸和甲基丙烯酸的烷基膦酸酯、苯乙烯、含胺銨官能度的丙烯酸和甲基丙烯酸單體、苯乙烯磺酸及其鹽、丙烯酸和甲基丙烯酸的烷基磺酸酯、乙烯基磺酸及其鹽。非離子單體可包括含親水非離子單元的單體，如聚(環氧乙烷)鏈段、碳水化合物、胺、醯胺、醇、多羥基化合物、含氮雜環和寡肽。實例包括但不限於聚(環氧乙烷)丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯、乙烯基吡啶、丙烯酸羥乙酯、甘油丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯、(甲基)丙烯醯胺和N-乙烯基吡咯烷酮。
優選G是丙烯醯胺、2-丙烯醯胺基-2-甲基丙酸鈉、丙烯酸丙酯磺酸鹽和甲基丙烯酸丙酯磺酸鹽或者苯乙烯磺酸鈉的聚合形式。
單體H是通過由Q和L組成的有機間隔基(其中Q是任選成分)與可聚合α，β-烯鍵式不飽和官能團共價結合的乙烯碸或者乙烯碸前體單元的聚合形式。
可用於本實施方案的乙烯碸和含乙烯碸前體「H」單體包括但不必限於美國專利第4,548,869號和第4,161,407號(其通過引用結合到本文中)中公開的化合物以及式II化合物。
單體1 單體2 單體3式II雖然聚合物可具有任何分子量，但優選分子量(Mn)在1000-200,000AMU之間。特別優選分子量在2000-50,000AMU之間。
一旦選定了固相支持物、相應的夾層配方和明膠粘合層配方，優選在微陣列基質製作過程中使用線內方法將夾層和明膠上層塗敷到固相支持物上。但是，這也可通過分開的步驟進行操作。可用EdwardCohen和Edgar B.Gutoff在「Modern Coating And Drying Technology」的第一章，(Interfacial Engineering Series；v.l)，(1992)，VCH Publishers Inc.，New York，NY中概略性地描述的方法，將夾層和明膠上層包被到支持物上。在夾層塗敷中為獲得超薄膜包被，希望用美國專利第3,283,712號、第3,468,700號和第4,325,995號中描述的凹槽輥印刷方法或者美國專利第3,000,349號、第3,786,736號、第3,831,553號和第4,033,290號中描述的芯給塗法(wicked coating)來包被夾層。
本發明描述的明膠層可原樣包被在任何固相支持物上，或者與混合於凝膠中的一種硬化劑或多種硬化劑的組合一起包被。硬化劑佔總包被明膠的含量水平為0-20wt.％，優選為0.5-8wt.％。
有兩種類型的明膠酸預處理明膠和鹼預處理明膠。優選的明膠是制自牛骨髓的鹼預處理明膠，不過明膠還可有其他來源。實例包括但不限於豬明膠、魚明膠。雙官能劑A-L-B可在明膠包被到固相載體過程中或者之後引入。
一般來說，流體包被混合物包含粘合劑、用以溶解或者懸浮各成分的溶劑以及任選的添加劑，如表面活性劑、分散劑、增塑劑、殺生物劑、增加韌度和不溶性的交聯劑及使靜電累積減至最少的導電材料。將所有這些成分混合併溶解或者分散，然後將所得包被流體送到塗敷器，通過幾種包被技術中的一種塗敷到支持物上。接著加熱包被，以蒸去溶劑，產生所需的薄膜，或者通過紫外輻射或電子束的作用使包被固化。
最適合的包被方法——包括包被速度，須根據所需的質量和官能度以及所用的材料，如支持物、溶劑、包被的重量和粘度等來決定。對於單層形式，合適的包被方法可包括浸塗、棒塗、刀塗、刮板塗布、氣刀刮塗、凹槽輥塗布、正向和反向輥塗及縫擠出塗布(slot andextrusion coating)。
包被速度也是選擇包被方法時的重要決定因素。雖然大多數方法可在低速度下使用，且所有的方法都具有上限速度，但還是有某些方法在較高速度下更好用。簾流塗布需要極小的流速，以保持簾流的完整性。因此，如果要得到薄包被，這種方法就受限於較高的速度。在多層的滑動塗布(slide coating)中，當各層非常薄時，在滑動片上更可能出現界面不穩定性。較高流速在滑動片上帶來較大的流量和較厚的各層，傾向避免出現這些不穩定性。參見「Modern Coating and DryingTechnology」第12頁，出處同上。
明膠每平方米沉澱量為0.2-100克，優選每平方米10-50克。
可用任何公知的包被方法，如珠粒塗布(bead coating)或者簾流塗布，製備明膠基質。可用其他任何包被助劑，如表面活性劑和增稠劑來調整明膠的物理性質，以包被明膠。本發明所用的明膠可在包被過程之前、當中或者之後進行化學修飾，以產生更多的能與待粘連到明膠基質上的生物活性分子或者裝配物反應或者相互作用的化學官能度。
一般來說，使用明膠包被方法，有兩種途徑可製備用於蛋白質捕捉劑固定化的反應性表面。在第一種途徑中，可將化學試劑或者聚合物支架與明膠及某些包被助劑混合在一起，然後將所得混合物如上所述包被到固相支持物上。在第二種途徑中，如上所述在固相支持物上製作明膠包被，明膠包被乾燥後，即浸入含化學試劑如A-L-B、聚合物支架的溶液，以將反應性作用粘附到明膠表面。另外還可將粘附作用包被到明膠表面上。優選在明膠包被過程中將聚合物支架引入到支持物表面，以簡化生產程序。
一旦蛋白質微陣列基質用聚合物支架修飾完畢，即將蛋白質捕捉劑置於基質上，以形成蛋白質微陣列內容。蛋白質分子由20種胺基酸以共價方式線性連接而成。某些蛋白質通過翻譯後加工(包括磷酸化和糖基化)在選定胺基酸處被進一步修飾。蛋白質分子可用作蛋白質捕捉劑。本文所用術語「蛋白質捕捉劑」指能以高親和性和高特異性與蛋白質相互作用的分子。通常希望蛋白質捕捉劑和靶蛋白之間的親和結合常數大於106M-1。有幾種類型的分子可以用作蛋白質微陣列上的蛋白質捕捉劑。抗體是一類能夠以高親和性和特異性結合靶標的天然蛋白質分子。抗體的性質和抗體的使用方案可在「Using Antibodies；ALaboratory Manual」，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Ed Harlow和David Lane著，Cold Spring Harbor，NY 1999)查到。如果抗體是待檢測靶標，則可用抗原作為蛋白質捕捉劑。蛋白質支架如全蛋白/酶或者它們的片斷也可用作蛋白質捕捉劑。實例包括磷酸酶、激酶、蛋白酶、『氧化酶、水解酶、細胞因子或者合成肽。在體外選擇和富集對某些靶標具有結合親和性和特異性的核酸配體之後，這些核酸配體可用作蛋白質捕捉劑分子。這種選擇方法的原理見於Science，第249卷，第505-510頁，1990和Nature，第346卷，第818-822頁，1990。美國專利第5,110,833號公開了另一類合成分子，其能模擬抗體結合親和性和特異性，能容易地通過所謂的分子印記聚合物(Molecular ImprintingPolymer，MIP)來製備。這種技術在Chem.Rev.第100卷，第2495-2504頁，(2000)中進行了綜述。
在實踐中，蛋白質微陣列與生物流體樣品接觸，樣品中的蛋白質會同時吸附到點印有特異性蛋白質捕捉劑的區域和沒有點印蛋白質捕捉劑的區域。由於蛋白質微陣列是為了用來測量晶片上的蛋白質捕捉劑與生物流體樣品中的某些蛋白質或者其他分子之間的特異性相互作用，樣品蛋白質與非點印區域的非特異性結合會產生高本底噪聲。術語非特異性結合指蛋白質分子以非選擇方式粘附於固相表面的趨向。除非通過適當的方式對非特異性結合進行封閉，否則這種由非特異性結合產生的高本底噪聲會干擾待從點印區域檢測的報告信號。通常，蛋白質微陣列在與預定的分析物溶液接觸之前，須浸入含封閉劑的溶液中，以封閉非特異性結合位點。封閉蛋白質非特異性結合的一種常用方法是用大大過量的牛血清白蛋白處理基質的表面。非點印表面區域也可用聚乙二醇(PEG)、磷脂或者聚賴氨酸進行化學修飾，以防止非特異性結合。
參考以下具體實施方案，可更好地認識本發明。
實施例實施例1.
本實施例說明夾層熔化物(melt)和明膠上層熔化物的配方和將熔化物包被到玻璃支持物上的方法。本實施例闡明了使用夾層來提供所需的明膠粘合到玻璃表面上的粘合度的有效性。
配方1-1(明膠熔化物)溶液1通過將726.54克IV型溶脹明膠(24.8％w/v)加入到2237.06克水中，並添加16克壬基苯氧基聚甘油包被助劑和20.4克辛基苯酚聚(氧乙基)磺酸鈉包被助劑製得。
溶液2通過將800.79克1，1′-雙(乙烯基(磺醯基))甲烷(1.8％w/v)加入到2199克蒸餾水製得。
在進行包被之前，將溶液1和溶液2等體積混合，配成單熔化物。
配方1-2(夾層熔化物)通過將2.5克明膠、16.3克硫酸鉻鉀(chrom-alum)、34.7克甲醇、12.7克矽酸鈉加入到33.9克蒸餾水中製得。
對照用包被裝置將配方1-1包被到玻璃板上。所述配方在45℃的溫度下通過縫塗布模(slot-coating die)引入到以3.1m/min的速度移動的20.3cm寬的基質上。調整流速，以得到86.1-g/m2的明膠覆蓋水平。將包被在溫度保持在4℃、相對溼度(RH)為56.6％的9.1米長冷卻部件中冷卻凝固，然後在總長為34米、溫度和RH分別為35℃和18.3％的三個烘乾部件中烘乾。
本發明在45℃的溫度下將配方1-2加入到盤中。溶液通過轉動發生接觸，由此轉移到凹槽輥上，被削割得到所需的厚度。然後溶液被輥捲起，由此與基質發生接觸。在基質上沉積了一薄層溶液。支持物在51.6℃的溫度下被運送通過10米長烘乾部件。溶液於是被塗敷到基質的最上層，充當配方1-1的粘合層。
本發明產生令人滿意的包被效果，明膠上層在溼加工過程中與玻璃緊密結合，相反，明膠層在烘乾過程中會起皺褶。
實施例2.
本實施例說明使用改進的酶聯免疫吸附測定法(ELISA)評價明膠包被的蛋白質微陣列基質的方法。
改進的ELISA的操作程序如下1.將Sigma公司的山羊抗小鼠抗體IgG溶於PBS(磷酸緩衝鹽水，pH 7.4)緩衝液中，濃度為1mg/mL。將一系列稀釋山羊抗小鼠抗體IgG手工點印到硝酸纖維素膜和包被明膠基質上。將點印基質置於增溼箱中在室溫下溫育1小時。
2.用含1％Triton X100TM的PBS緩衝液振搖洗滌基質四次，每次5分鐘。
3.洗滌過的基質在含1％甘氨酸的PBS緩衝液中持續振蕩溫育15分鐘。
4.用含1％TritonTMX100的PBS緩衝液振搖洗滌基質四次。
5.將Sigma公司的小鼠IgG稀釋於含0.1％TweenTM20的PBS緩衝液中，至1μg/mL，用以覆蓋基質的全部表面，將基質在室溫下溫育1小時。
6.用含1％Triton X100的PBS緩衝液持續振搖洗滌基質四次，每次5分鐘。
7.在室溫下，將基質在山羊抗小鼠抗體IgG辣根過氧化物酶綴合物(稀釋於含1％甘氨酸的PBS緩衝液中，至合適的滴度)溶液中振蕩溫育1小時，以覆蓋基質的全部表面。
8.用含1％Triton X100的PBS緩衝液持續振搖洗滌基質四次，每次5分鐘，用水漂洗兩次。
9.在含SuperSignalELISA化學發光底物溶液(購自PIERCEENDOGEN)的辣根過氧化物酶底物溶液中顯色。通過使一薄層SuperSignalELISA化學發光底物溶液(購自PIERCE ENDOGEN)與包被基質接觸，捕捉化學發光圖像。用Kodak Image Station 440測量發射情況，並用隨儀器提供的Region of Interest(ROI)軟體進行定量。
權利要求
1.一種蛋白質微陣列元件，所述微陣列元件包括a)支持物；b)含有能夠結合生物探針的官能團的明膠層；以及在支持物和明膠層之間插入的c)能夠保持與支持物和與明膠層的接觸的粘合夾層。
2.權利要求1的微陣列，其中所述支持物是有機支持物或者無機支持物。
3.權利要求1的微陣列，其中所述支持物是玻璃或者熔凝二氧化矽。
4.權利要求1的微陣列，其中所述支持物的厚度在0.1-5.0mm之間。
5.權利要求1的微陣列，其中所述支持物的厚度在0.5-2.0mm之間。
6.權利要求1的微陣列，其中所述粘合夾層包含蛋白質、蛋白質衍生物、明膠、明膠衍生物或者親水透水性膠體。
7.權利要求1的微陣列，其中所述粘合夾層包含合成高分子型塑解劑、載體或者粘合劑。
8.權利要求1的微陣列，其中所述粘合夾層包含聚乙烯醇、聚(乙烯基內醯胺)、丙烯醯胺聚合物、聚乙烯醇縮醛、丙烯酸烷基酯和甲基丙烯酸烷基酯及丙烯酸磺基烷基酯和甲基丙烯酸磺基烷基酯的聚合物、水解聚乙酸乙烯酯、聚醯胺、聚乙烯吡啶或者甲基丙烯醯胺共聚物。
9.權利要求1的微陣列，其中所述粘合夾層包含明膠。
10.權利要求9的微陣列，其中有機溶劑或者溶劑混合物與明膠結合。
11.權利要求10的微陣列，其中所述有機溶劑或者溶劑混合物包括丙酮、醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、醚或者它們的混合物。
12.權利要求9的微陣列，其中交聯劑、矽酸鹽或者分散助劑與明膠結合。
13.權利要求9的微陣列，其中所述明膠用鹼預處理。
14.權利要求9的微陣列，其中所述明膠是豬明膠或魚明膠。
15.權利要求9的微陣列，其中所述明膠的覆蓋量為每平方米0.2-100克。
16.權利要求9的微陣列，其中所述明膠的覆蓋量為10-50克。
17.一種蛋白質微陣列元件，所述微陣列元件包括a)支持物；b)在所述支持物上安置能夠保持與支持物和與下述明膠層的接觸的粘合夾層；c)具有三官能化合物A-L-B的明膠層；其中A是能夠與明膠相互作用的官能團；L是能夠與A和B相互作用的連接基團；B是能夠與蛋白質捕捉劑相互作用的官能團；其中A與B可相同或者不同。
18.權利要求17的微陣列，其中所述三官能化合物A-L-B是附著於所述明膠層的聚合物支架。
19.權利要求17的微陣列，其中所述聚合物支架中的聚合物富含能夠與蛋白質相互作用的反應性單元。
20.權利要求17的微陣列，其中所述明膠層和A之間的相互作用是物理結合或者化學反應。
21.權利要求17的微陣列，其中A或者B或者兩者是醛、環氧、醯肼、乙烯碸、琥珀醯亞胺酯、碳二亞胺、馬來醯亞胺、聯硫基、碘乙醯基、異氰酸酯、異硫氰酸酯或者氮丙啶。
22.權利要求17的微陣列，其中B是能夠與待固定化於基質上的蛋白質捕捉劑發生非共價相互作用的親和標記物。
23.一種製備用以製作蛋白質陣列的明膠基基質的方法，所述方法包括以下步驟-提供支持物；-在支持物上包被粘合層；-在所述粘合層上包被含三官能化合物A-L-B的明膠層；其中A是能夠與明膠相互作用的官能團；L是能夠與A和B相互作用的連接基團；B是能夠與蛋白質捕捉劑相互作用的官能團；其中A與B可相同或者不同。
24.權利要求23的方法，其中所述三官能化合物ALB在將明膠包被到粘合層的同時粘附。
25.權利要求23的方法，其中所述三官能化合物ALB在將明膠包被到粘合層之後粘附。
26.權利要求23的方法，其中所述蛋白質捕捉劑是抗體、蛋白質支架、肽、核酸配體或者分子印記聚合物。
27.權利要求23的方法，其中所述聚合物支架中的聚合物富含能夠與固定化蛋白質的反應性單元。
全文摘要
一種蛋白質微陣列元件，包括a)支持物；b)含有能夠結合生物探針的官能團的明膠層；以及插入到支持物和明膠層之間的c)能夠保持與支持物和與明膠層接觸的粘合夾層。
文檔編號B01J19/00GK1826528SQ200480020968
公開日2006年8月30日 申請日期2004年7月14日 優先權日2003年7月23日
發明者T·A·喬, T·L·彭納, H·W·仇, G·W·羅思 申請人:伊斯曼柯達公司