通過乳酸菌和雙歧桿菌結合內毒素的製作方法
2023-09-17 12:21:10
專利名稱：通過乳酸菌和雙歧桿菌結合內毒素的製作方法
技術領域：
本發明涉及用具有疏水性質的乳酸菌和/或雙歧桿菌製備一種用於預防或治療因內毒素引起的和/或與內毒素有關的病症的食物組合物。本發明還涉及用具有疏水性質的乳酸菌和/或雙歧桿菌製備的組合物。
背景技術：
已經發現誘導敗血症的毒素與病原菌、病毒、植物和毒液有關。記載較完備的細菌毒素是革蘭氏陰性細菌的內毒素或脂多糖(LPS)。這些分子是所有革蘭氏陰性細菌外膜中普遍存在的糖脂，被認為與革蘭氏陰性敗血症有關。這類敗血症是極其常見的病症，並且是經常致命的。
已經進行過許多治療敗血症的嘗試。這些包括使用LPS的抗體、使用腫瘤壞死因子的抗體、使用可溶解的腫瘤壞死因子(TNF)受體、使用可溶解的白細胞間介素-1(IL-1)受體，僅舉幾個例子。雖然每種方法達到一些效果，但總的說來結果令人失望。
其它人曾嘗試設計和研究結合LPS/內毒素蛋白質的工作，並且將這些嘗試的說明性報告發表在Rustic，A.等，Science(1993)259361-364；Matsuzaki，K.等，Biochemistry(1993)3211704-11710；Hoess，A.等，EMBO J(1993)123351-3356；以及Elsbach，P.等，Current Opinion in Immunology(1993)5103-107。事實上，一旦LPS進入血液，可結合在稱為脂多糖結合蛋白(LBP)的一種蛋白質上。抑制LBP，如用抗LBP抗體，已被建議作為治療內毒素引起的敗血症的療法(國際專利申請號PCT/US90/04250，申請日1990年6月30日)。同時，幾個實驗室的工作表明血漿脂蛋白，特別是高密度脂蛋白(HDL)可結合併中和LPS(Skarnes等，1968，J.Bacteriology 952031；Flegel等，1993，Infect.Immunol.61(12)5140)，而且還表明這些粒子可在血漿中產生LPS中和活性。
以前對於因內毒素引起和/或有關的疾病的治療是追補性的(即在出現臨床病症之後的治療)，並限於化學治療法介入。這些治療方法不能達到預防的目的。
因此，為了預防或減輕敗血症和膿毒性休克的症狀，需要一種有效的藥物中和革蘭氏陰性內毒素(即LPS)。
本發明的疏水性的乳酸菌和雙歧桿菌提供了能夠結合內毒素並改善/預防其作用的補充化合物。
發明概要因此，本發明涉及用具有疏水表面性質的乳酸菌和/或雙歧桿菌中的至少一種菌株製備預防或治療內毒素引起和/或有關病症的組合物。
事實上，已經出人意料地發現一些特別是具有疏水表面的乳酸菌和雙歧桿菌能夠結合內毒素。因此，它們可作為有效的製劑，預防內毒素性休克和消化道起源的敗血症、細菌移位、壞死性小腸結腸炎、炎症性腸病、腸內的感染、慢性內毒素血症有關的或促進分解代謝的和全身的炎症。
優選的，疏水性的乳酸菌或雙歧桿菌的疏水性百分比(％H)至少為80，更優選為85-100％H。
在優選的實施方案中，菌株選自約氏乳桿菌、路氏乳桿菌、類於酪乳桿菌、動物乳桿菌、瘤胃乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、發酵乳桿菌、德氏乳桿菌乳亞種、雙歧桿菌屬、雙歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、假長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌。
在另一個方面，發明涉及分離出的一種具有疏水表面性質的乳酸菌或雙歧桿菌菌株，這種菌株因其具有與內毒素結合或與革蘭氏陰性細菌共聚集的能力而被選擇。
又一方面，本發明為人類或寵物提供了預防或治療因內毒素引起和/或有關的疾病的食物組合物，該組合物含有至少一種具有上述特性的乳酸菌和/或雙歧桿菌菌株以及可吸收藥物載體或基質。
這些組合物能減少小腸細菌滋生並減少內毒素從消化道滲漏到體內環境，這是寵物發的常見病，可能引起例如腹瀉的發作、營養不良以及腸內的和全身的炎症。
最後一方面，本發明涉及了預防或治療內毒素引起和/或有關病症的方法，包括讓人或動物攝食一種組合物的步驟，該組合物含有至少一種具有疏水表面性質的乳酸菌和/或雙歧桿菌以及可吸收載體或藥用基質。
發明詳述在下面的描述中，″NCC″指Nestlé菌種保藏(Nestlé研究中心，Vers-chez-les-Blanc，瑞士洛桑市)。
關於本發明第一個目的，是關於用至少一種具有疏水表面性質的乳酸菌和/或雙歧桿菌製備預防或治療內毒素引起和/或有關病症的組合物。
事實上，已經出人意料地發現一些乳酸菌和雙歧桿菌，特別是具有疏水表面的乳酸菌和雙歧桿菌能夠結合內毒素。
的確，根據本發明的菌株能夠將內毒素結合在其疏水性的細胞壁上，因此清除了這些革蘭氏陰性菌的前炎症產物，否則其可從腸道進入血液內，從而引起炎症反應，嚴重時，引起內毒素性休克。
根據本發明的乳酸菌或雙歧桿菌選自適於動物消耗的菌株，它們的疏水性百分比(％H)參見A.G.Zavaglia等，Journal of Foodprotection，61卷，第7期，1998，865-873頁。
優選根據本發明的菌株的％H至少是80，更優選的是85-100％H。
使用前述MATH方法(Pérez，P.F.等，1998，Appl.Environ.Microbiol.6421-26)確定表面疏水性。簡言之，用0.4ml二甲苯經渦流混合120秒抽提2毫升細菌懸液(約108CFU/ml，PBS)。用傾析法分相，測定水相的A600。用下式計算細胞表面疏水性(％H)H％＝[(A0-A)/A0]×100，其中A0和A分別是用二甲苯提取前後的吸光度。
在優選的實施方案中，菌株可選自約氏乳桿菌、路氏乳桿菌、類於酪乳桿菌、動物乳桿菌、瘤胃乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、發酵乳桿菌、德氏乳桿菌乳亞種、雙歧桿菌屬、雙歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、假長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌。
在最優選的實施方案中，菌株可以是例如嗜酸乳桿菌NCC 2463(CNCM-I 2623)、雙歧雙歧桿菌NCC 189(原名CIDCA 536，CNCM-I-2333)、雙歧雙歧桿菌NCC 235(原名CIDCA 533，CNCM-I-2335)、青春雙歧桿菌NCC 251(CNCM I-2168)、乳雙歧桿菌(ATCC27536)。
在根據本發明選擇的多種菌株中，以下菌株按照布達佩斯條約分別被保藏在國立微生物保藏中心(CNCM)，Institut Pasteur，28ruedu Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15，France，嗜酸乳桿菌NCC2463，保藏日2001.2.02，保藏號CNCM I-2623、雙歧雙歧桿菌NCC189和NCC 235，保藏日1999.10.12，保藏號CNCM-I-2333和CNCMI-2335。青春雙歧桿菌NCC 251，保藏日1999.03.15，保藏號CNCMI-2168。
乳雙歧桿菌菌株(Bb12)(ATCC27536)，由Hansen提供(Chr.Hansen A/S，10-12Boege Alle，P.O.Box 407，DK-2970 Hoersholm，Danemark)。其疏水性為89％H。
根據本發明的菌株可以用於製備改善人類或動物健康情況的組合物，特別是預防或治療人類和寵物中與內毒素有關係的病症。該菌株可以用作有效的製劑，預防內毒素性休克和消化道起源的敗血症、細菌移位、壞死性小腸結腸炎、炎症性腸病、腸內感染，以及慢性內毒素血症有關的或促進分解代謝的和全身的炎症。
根據本發明的菌株可以按其活的形式或無活性形式使用。
在優選的實施方案中，乳酸菌株在其發酵生長培養基中使用。所述培養基可以例如單獨消毒或與食物一起消毒、擠出或噴霧乾燥、冷卻或者存放。
菌株的使用量可以是每人每日相當於大約103-1014cfu(菌落形成單位)。此量取決於個體重量，對於人類來說優選大約為109-1012cfu/日，對於寵物為107-1010cfu/日。
根據另一方面，本發明涉及一種分離出的具有疏水表面性質並能夠結合內毒素或與革蘭氏陰性細菌共聚集的乳酸菌或雙歧桿菌菌株。
本發明菌株結合內毒素的能力可以使用FITC-標記的內毒素容易地測定出，測量放射性同位素標記的內毒素與細菌細胞的結合，在這種情況下內毒素的分子結構是不變的，而與FITC綴合後分子可能會改變(見實施例)。
優選測量菌株將內毒素從溶液中除去的能力，該溶液中的內毒素含量是模仿人類腸中發現的內毒素量。用微量分析法檢查內毒素水平，如檢測革蘭氏陰性細菌的脂多糖中的2-酮-3-脫氧辛酸酯(2-keto-3-deoxyoctonate)基團(Karkhanis Y D，等，AnalyticalChemistry(1978)85595-601)。優選選用可由此溶液中除去30％以上內毒素含量的細菌。在此分析中，被檢測為非疏水性的細菌不會改變內毒素的初始含量(見實施例)。
這類菌株可以用作如上所述的用途，特別是作為有效的製劑，預防例如內毒素性休克和消化道起源的敗血症、細菌性移位、壞死性小腸結腸炎、炎症性腸病、腸內感染，以及慢性內毒素血症有關的或促進分解代謝的和全身的炎症。
根據另一方面，本發明涉及一種人類或寵物食物組合物，其含有至少一種分離出的具有上述特性的菌株的乳酸菌和/或雙歧桿菌以及可吸收的載體或藥物基質。
所述菌株可以按如上所述進行選擇。
優選該乳酸菌或雙歧桿菌可以作為日常飲食的補充而服用，或作為人類或寵物營養完全的食物的成分而服用。
如上所述人類或寵物食物組合物可以至少包含如上所述的乳酸菌和/或雙歧桿菌菌株，使菌株的使用量是每人每日相當於大約103-1014cfu。此量取決於個體重量，對於人類來說優選大約為109-1012cfu/日，對於寵物為107-1010cfu/日。
人類食物的形式可以例如是營養製劑、嬰兒製劑、以奶為基礎的產品、乳製品、以穀類為基礎的產品等形式。為了製備這種食品產品或組合物，如上所述菌株可以在製造時引入在食物，比如穀類粉末、奶粉、酸乳酪之中。
在一個實施方案中，可以製備包括蛋白質來源和至少一種根據本發明的菌株的營養製劑。膳食蛋白質優選用作蛋白質的來源。膳食蛋白質可以是任何適當的膳食蛋白質；例如動物性蛋白質(比如牛乳蛋白質、肉蛋白質和卵蛋白質)、植物蛋白質(比如大豆、小麥、大米或豌豆蛋白質)、游離胺基酸混合物或以上膳食蛋白質的組合。牛乳蛋白質比如酪蛋白、乳清蛋白和大豆蛋白質是特別優選的。組合物還可含有碳水化合物來源和脂肪源。
如果營養製劑包括脂肪源，該脂肪源優選提供大約營養製劑中大約5％-55％的能量；例如大約20％-50％的能量。組成脂肪源的脂類可以是任何適當的脂肪或脂肪混合物。植物脂肪是特別適合的；例如大豆油、棕櫚油、椰子油、紅花油、向日葵油、玉米油、菜籽油、卵磷脂等。如需要，也可加入動物脂肪，如奶油。
如果營養製劑包括碳水化合物源，該碳水化合物源優選提供大約營養製劑中40％-80％的能量。可以使用任何適當的碳水化合物，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、澱粉糖漿乾粉，及麥芽糖糊精和上述碳水化合物的混合物。
如需要，也可以加入膳食纖維素。許多類型的膳食纖維素是可用的。其它的適當膳食纖維素源可以包括大豆、豌豆、燕麥、果膠、瓜耳豆膠和阿拉伯樹膠。如果使用膳食纖維素，優選包括相當於營養製劑中最多至大約5％的能量。適當的維生素和礦物質可以以通常的方式包括在此營養製劑中以符合相應的指標。如需要，一種或多種食物級乳化劑可以加入此營養製劑；例如二乙醯酒石酸的單和二甘油酯、卵磷脂及單和二甘油酯。同樣地，可以包括適當的鹽和穩定劑。
營養製劑優選經腸道服用；例如以粉末、液態濃縮液或即飲的飲料形式。
營養製劑可以用任何適當的方式製備。例如，營養製劑可以將膳食蛋白質源、碳水化合物源和脂肪源以適當的比例混合在一起而製備。如果使用乳化劑，可以在混合時加入。維生素和礦物質可以在混合時加入，但是通常後加入，避免熱降解。任何親脂性的維生素、乳化劑等等可以在混合之前溶解到脂肪源中。然後將水，優選是經反向滲透的水混合，形成液體混合物。水的溫度通常是大約50℃-80℃，以有助於組分的分散。市場上可買到的液化劑可用於形成液體混合物。例如用兩個步驟配製時，將液體混合物均勻化。
然後，液體混合物可以進行熱處理，以減少細菌存在。如液體混合物可以被迅速加熱到大約80℃-150℃的溫度範圍並維持大約5秒-5分鐘。這可以用注入蒸汽、高壓釜或熱交換器，例如用平板式熱交換器進行。然後將液體混合物冷卻至大約60℃-大約85℃，如通過瞬間冷卻。然後可將液體混合物再均勻化；例如在兩段法中，第一階段的壓力大約在7MPa-40MPa，第二階段大約在2MPa-14MPa。如果要加入任何熱敏感的成分，如維生素和礦物質，均勻化的混合物可以進一步冷卻。均勻化混合物的pH和固體含量通常是標準化的。
如果欲生產粉末狀的營養製劑，將均勻的混合物轉入到適當的乾燥設備，比如噴霧乾燥器或冷凍乾燥機中，製成粉末。粉末的含溼量應小於大約5％(按重量計算)。
如果欲生產液體製劑，均勻化的混合物優選無菌充入適當的容器中。無菌灌裝入容器可以通過以下方法進行預熱均勻化的混合物(例如大約75-85℃)，然後將蒸汽注入均勻化的混合物，以提高溫度至大約140-160℃，例如在大約150℃。然後將均勻化的混合物冷卻，如通過瞬間冷卻至溫度大約75-85℃。然後可將均勻化的混合物均勻化。進一步冷卻至大約室溫並充入容器中。進行此種性質的無菌灌裝的適當裝置是市場上可買到的。液體製劑可以是即可服用的製劑形式，具有大約10-14％(按重量計算)固體含量或可以是濃縮液的形式；通常的固體含量大約在20-26％(按重量計)。可在液體製劑中加入香料，以便配製成為方便、香濃、即飲的飲料。
在另一個實施方案中，通常的食品可以富含本發明所述的菌株。例如發酵牛奶、酸奶、鮮乳酪、凝乳、糕餅條、早餐穀類薄餅或條、飲料、奶粉、大豆製品、非奶發酵產品或用於臨床營養的營養增補劑。
在另一實施方案中，可以製備全營養寵物食物組合物。該組合物可以是粉末狀、幹的形式、半潮溼的或溼的、冷卻的或儲藏穩定的寵物食物產品。它還可以是用於寵物的營養增補劑或藥物組合物。這些寵物食物可以按常規方法生產。除該菌株外，這些寵物食物可以包括任何一種或多種澱粉源、蛋白質源和脂肪源。
適當的澱粉源是穀類物和豆類，比如玉米、大米、小麥、大麥、燕麥、大豆和它們的混合物。適當的蛋白質源可以選自任何適當的動物或植物蛋白源，例如肉類和肉粉、家禽粉、魚粉、大豆蛋白質濃縮物、牛乳蛋白質、麵筋等。對於年長的動物，更優選的是包含高質量蛋白質的蛋白源。適當的脂肪源包括肉類、動物脂肪和植物脂肪。另外，還可有各種其它組分，例如糖、鹽、香料、調味品、維生素、礦物質、調味劑、脂肪等等都可按需要加入寵物食物。
製備幹的寵物食物適當的方法是擠出烹製，雖然可以使用烘焙及其他適當的方法。當進行擠出烹製時，通常得到碎塊形式的幹的寵物食物。如果使用前生物(prebiotic)，可在加工之前將該前生物與幹的寵物食物的其他組分混合。適合的方法參見歐洲專利申請0850569的描述，該專利申請的公開引入作為參考。如果使用前微生物，最好將該有機體覆蓋在幹寵物食物上，或充入幹寵物食物中。適合的方法參見歐洲專利申請No 0862863的描述，該專利申請的公開引入作為參考。
對於溼的食物，美國專利4,781,939和5,132,137所述的方法可用於生產人造肉製品。這些專利的公開在此引入作為參考。對於生產塊型產品的其它加工方法也可以使用，例如在蒸汽灶上烹製。或者，塊型產品可以用下法生產，將適當的肉類原料乳化，以生產肉糜，在裝入罐或其它容器之前加適當的膠凝劑，並且加熱肉糜。
前生物在寵物食物中的量優選大約是20％(按重量計算)；尤其大約10％(按重量計算)。例如，寵物食物可以包含大約0.1％-5％(按重量計算)的前生物。對於寵物食物，用菊苣作為前生物時，飼料混合物中可以包含大約0.5％-10％(按重量計算)的菊苣；更優選大約含1％-5％(按重量計算)。
如果使用前微生物，每克寵物食物中優選含有大約104-1010前微生物細胞；更優選每克寵物食物含有大約106-108前微生物細胞。寵物食物可以含有大約0.5％-20％(按重量計算)前微生物的混合物；優選大約1％-6％(按重量計算)，例如大約3％-6％(按重量計算)。
該寵物食物可以含有其它活性劑，如長鏈脂肪酸。適當的長鏈脂肪酸包括α-亞油酸、γ亞油酸、亞油酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。魚油是適當的二十碳五烯酸源和二十二碳六烯酸源。琉璃苣籽油、blackcurrent籽油和月見草油是適當的γ亞油酸源。紅花油、向日葵油、玉米油和大豆油是適當的亞油酸源。必要時，在寵物食物中補充礦物質和維生素以使營養完全。
此外，如需要，可將菌株用膠囊包裹；例如置於糖基質、脂肪基質或多糖基質中。
寵物消耗該寵物食物以獲得有益的效果的消耗量取決於寵物的大小或寵物的類型及年齡。然而能提供每日量大約為至少一種乳酸菌或雙歧桿菌菌株的103-1014cfu(菌落形成單位)的寵物食物的通常是合適的。優選對於狗，大約服用109-1010cfu/日，貓107-1010cfu/日。
根據本發明的組合物特別適於預防或治療與革蘭氏陰性細菌、產生內毒素的細菌如螺桿菌屬、沙門氏菌屬有關的感染，以及與小腸細菌滋生(SIBO)有關的感染，所有這些感染臨床上表現為腹瀉、腸道或全身發炎的病症，或異化作用和營養不良。
根據最後方面，發明提供了一種預防或治療內毒素引起和/或有關病症的方法，該方法包括的步驟是讓人或動物攝食含有至少一種具有疏水表面性質的乳酸菌和/或雙歧桿菌菌株以及有關的可吸收的載體或藥用基質的組合物。
此方法特別適於預防或治療與革蘭氏陰性細菌、產生內毒素的細菌，如螺桿菌屬、沙門氏菌屬有關的感染，以及與小腸細菌滋生(SIBO)有關的感染，所有這些感染臨床上表現為腹瀉、腸道或全身發炎的病症，或異化作用和營養不良。
以下給出的實施例僅為了說明，而決不應理解為對本申請發明的限制。除非另有說明，所有給出的百分比均為重量百分比。實施例前有以下附圖的簡述。
附1雙歧雙歧桿菌菌株NCC 189(原名CIDCA 536，CNCM I-2333)直方圖，顯示結合了FITC-LPS。A無FITC-LPS的對照。B用50微升/mlFITC-LPS培養。至少分析16000次結果。
圖2白蛋白對乳酸菌和雙歧桿菌結合FITC-LPS的影響。A雙歧雙歧桿菌菌株NCC 200(原名CIDCA 538，CNCM I-2334)。B嗜酸乳桿菌菌株NCC 2463(CNCM I-2623)。C雙歧雙歧桿菌菌株NCC 189(原名CIDCA 536，CNCM I-2333)。
圖3雙歧雙歧桿菌菌株NCC 189(原名CIDCA 536，CNCM I-2333)生長和FITC-LPS結合動力學。數值來自兩次獨立實驗的平均數。
圖4LPS被雙歧桿菌菌株結合，用微量分析法確定脂多糖中的2-酮-3-辛酸酯基團(KDO)。溶液的初濃度是100μg/ml。矩形顯示溶液用疏水性的雙歧桿菌菌株NCC 189和NCC 251(CNCM I-2168)培養後與用非疏水性的雙歧桿菌菌株(NCC 200(CNCM I-2334))培養後的終濃度比較。
圖5用疏水性的細菌預培養的LPS溶液在HT-29人上皮細胞上的前炎活性(IL-8(ng/mL))。
檢測對照樣品DMEM、人乳(HM)2％、單獨的LPS(2.5μg/ml)、單獨的雙歧雙歧桿菌屬菌株NCC 189(1.5e8cfu/ml)的基礎刺激活性。LPS+人乳(sCD14的來源)的試液與用雙歧雙歧桿菌菌株NCC189(1.5e8cfu/ml)預培養的含2.5μg/ml LPS+2％人乳的溶液比較。
實施例實施例1選擇本發明的疏水性的乳酸菌菌株疏水性的細菌基於細菌細胞在有機(疏水性的)相和水相的分配百分比進行最初的選擇。利用以前所述的MATH方法確定表面疏水性(Pérez，P.F.等，1998，Appl.Environ.Microbiol.6421-26)。簡言之，2ml細菌懸液(約108CFU/ml，PBS)用0.4毫升的二甲苯進行渦流混合抽提120秒。用傾析法分離不同的相併測量水相A600。用下式計算細胞表面疏水性(％H)H％＝[(A0-A)/A0]×100，其中A0和A是分別用二甲苯提取前後的吸光度。
隨後根據細菌將內毒素從模仿人腸道內毒素含量的溶液中除去的能力，選擇乳酸菌或雙歧桿菌。用微量分析法檢測革蘭氏陰性細菌的脂多糖中的2-酮-3-辛酸酯基團，以測定內毒素水平。(Karkhanis Y D，等，Analytical Chemistry(1978)85595-601)。
選擇由此溶液中除去30％以上內毒素的細菌。在此分析中測定為非疏水性的細菌不能改變內毒素的初始含量。
實施例2乳酸菌作為內毒素清除劑的體外效果選擇80％H以上細菌和一些非疏水性的″陰性″對照，對來自大腸桿菌的LPS和不同的表面性質的乳酸菌之間相互作用進行了研究，用流式細胞術完成與螢光標記的內毒素相互作用的測定。
材料和方法菌株和生長條件嗜酸乳桿菌菌株NCC 2463(CNCM I-2623)來自Nesteccollection(Lausanne，Switzerland)。雙歧雙歧桿菌NCC 189(原名CIDCA 536，I-2333)和雙歧雙歧桿菌NCC 200(原名CIDCA 538，(CNCMI-2334))菌株來自collection of the Centro de Investigacion yDesarrollo en Criotecnologia de Alimentos(La plata，Argentina)。用10％(體積/體積)甘油保存的冷凍懸浮液(-80℃)在實驗之前在MRS肉湯中再活化一次。所有培養在37℃厭氧狀態下進行(BBL GasPak Plus)。
FITC-LPS結合脂多糖和FITC-標記的脂多糖來自Escherichia coli血清型0111B4(Skelly，R.R等，1979，Infect.Immun.23287293)購自Sigma。合1000μl/ml的儲備液用蒸餾水製備並進行適當稀釋。
細菌培養物用PBS洗3次，將懸浮液標定為107CFU/ml。取400μl與不同的量的FITC-LPS或LPS混合，獲得從0到50μg/ml濃度範圍的反應混合物。在4℃或37℃下在溫育30分鐘，然後用PBS洗細胞2次，並用1％(體積/體積)多聚甲醛在4℃下固定30分鐘。使用藍綠激發光(FACScanTM)進行流式細胞分析。
表面疏水性用前述MATH方法(Pérez，P.F.等，1998，Appl.Environ.Microbiol.6421-26)確定表面疏水性。簡言之，用0.4ml二甲苯經渦流混合抽提2毫升細菌懸液(約108CFU/ml，PBS)。用傾析方法分離不同的相併測量水相的A600。用下式計算細胞表面疏水性(％H)H％＝[(A0-A)/A0]×100，其中A0和A分別是用二甲苯提取前後的吸光度。
結果所研究的菌株表面疏水性結果見表1。嗜酸乳桿菌NCC 2463(CNCMI-2623)和雙歧雙歧桿菌NCC 189(CNCM I-2333)菌株表面疏水性值分別是93和96％，而嬰兒雙歧桿菌NCC200菌株(CNCM I-2334)不是疏水性的，顯示值約為3％。
表1所研究的菌株疏水性，表中數值是至少3次測定的平均值。
用50μg/ml FITC標記的LPS培養的菌株NCC 189細菌群落顯然進入螢光區之內。位於圖右側(標記M1)的結果代表90％的控制的菌群(
圖1b)。對於未用FITC-LPS培養的懸浮液，僅有2％不同結合能力的結果。
表2(下)顯示FITC-LPS結合是劑量依賴性的。NCC200菌株發現有5％-15％的FITC(+)細胞。另一方面，菌株NCC 189顯示出約95％的FITC(+)細胞。約在10μg/ml FITC LPS時出現飽和。加入白蛋白，一種脂肪結合物，明顯減少在所有研究的菌株中FITC(+)的比率(圖2)。而在有0.4％白蛋白和50μg/ml的FITC-LPS存在時，菌株CIDCA 536顯示出約30％的FITC(+)細胞(圖2C)。此外對於此菌株，用濃度高達3％白蛋白時，發現有10％的FITC(+)細胞。二價陽離子(Ca2+0.9mM和Mg2+0.5mM)不改變結合能力(數據未顯示)。
表2在不同的濃度FITC-LPS時FITC(+)細菌百分比。
至少分析30000個實例。
FITC-LPS對於雙歧雙歧桿菌NCC 189菌株(原名為CIDCA 536，CNCM I-2333)的結合強烈依賴於生長期(圖3)。在穩定期收穫的細菌顯示出高比率的FITC(+)細胞。這些數值在延滯期顯著地下降，在生長期逐步的恢復。在4℃-37℃之間，該結合發現無差異。
總之，對於菌株NCC 189這樣的高度疏水性的菌株顯示出達到約95％的FITC(+)細胞。非疏水性的菌株NCC 200從未達高於5％的值。這些結果表明LPS的結合與表面疏水性關聯。
這些結果清楚地表明了疏水性的細菌結合FITC-標記的內毒素，從而變為有螢光的。用流式細胞術進行檢測時，內毒素濃度為10μg/ml時，超過90％的疏水性的細胞培養物變為有螢光的；相反，在類似的內毒素濃度下，非疏水性的細菌細胞中，小於10％的細胞變為陽性。
當疏水性的培養物被放入含濃度範圍在30和90μg/ml之間內毒素的培養基中時，濃度在107-108細菌/ml的細菌培養物，至少消除20％的內毒素。使用放射性同位素標記的內毒素證實了這些數據。
實施例3對人免疫活性細胞的實驗對消除在疏水菌株培養系統存在下內毒素誘導的人免疫活性細胞的前炎症反應，就培養系統中存在疏水菌株與非疏水性的細菌進行了對比研究。
疏水性雙歧雙歧桿菌NCC 189(CNCM I-2333)和非疏水性嬰兒雙歧桿菌NCC 200(CNCM I-2334)在含規定量內毒素(用KDO方法測定)的溶液中培養(見實施例1)(圖4)。
用疏水細菌懸浮液培養後，存在的內毒素明顯減少，而對於非疏水菌株則未觀察到變化。
實施例4疏水細菌功能研究材料和方法洗滌過的細菌再懸浮在DMEM-高葡萄糖(AMIMED)中，並用終濃度為2.5μg/ml的大腸桿菌0111B4(Sigma)的LPS預培養。離心後，200μl的上清液或再懸浮細菌小粒用於刺激HT 29上皮細胞。
在37℃培養20小時後，使用酶聯免疫吸附方法檢查HT-29細胞培養物上清液中是否存在IL-8。
結果結果見圖5。當LPS溶液用疏水細菌預培養時，LPS的前炎活性顯著降低。離心後，加至人上皮的細胞培養物中(在人乳存在下，因為LPS刺激依賴於sCD14存在)的上清液比沒有用疏水細菌預培養的上清液顯著減少。
實施例5嬰兒製劑為獲得嬰兒製劑食品，我們製備了以下混合物的製劑，其中每100ml製劑含有0.5-5％，優選2％的縮氨酸、0.2-10％，優選4％的脂肪、1-25％，優選8％的非果聚糖碳水化合物(包括乳糖65％、麥芽糖糊精20％、澱粉15％)，和至少106cfu/ml的以下菌株嗜酸乳桿菌NCC2463(CNCM I-2623)，雙歧雙歧桿菌NCC189(CNCM I-2333)，雙歧雙歧桿菌CNCM I-2335，青春雙歧桿菌CNCM I-2168，並配合少量的維生素和微量元素，以適應每日需要，及0.01-2％，優選0.3％的礦物質，和50-90％，優選75％的水。
實施例6在乳製品中使用本發明的疏水性的乳酸菌菌株雙歧雙歧桿菌(CNCM I-2333)、嗜酸乳桿菌NCC 2463(CNCM I-2623)、雙歧雙歧桿菌NCC235(CNCM I-2335)或青春雙歧桿菌NCC251(CNCM I-2168)中的一種或多種菌株，根據本發明可以用於製造發酵的酸奶樣奶產品。
為此，製備了含2.8％的脂肪和補充了2％脫脂奶粉和6％蔗糖的1升乳製品，在96℃巴氏殺菌30分鐘，然後將其溫度降至42℃。在含10％重新配製的牛奶粉和0.1％市售的酵母抽提物的無菌MSK培養基中，對非增稠的嗜熱鏈球菌和非粘性的保加利亞乳桿菌菌株的預培養物進行再活化。
同時，在含10％重配的牛奶粉末和0.1％市售的酵母抽提物與1％蔗糖的培養基中使一種或多種菌株的預培養物再活化。將每個再活化的預培養物按1％的接種量接入經巴氏殺菌的乳製品中，然後將這些乳製品在32℃發酵，直到pH達到4.5。用此法生產發酵酸奶樣產品，並在4℃貯藏。
實施例7幹的狗糧一種飼料混合物，由大約58％(按重量計算)玉米、大約5.5％(按重量計算)玉米面筋、大約22％(按重量計算)雞粉、2.5％幹的菊苣、嗜酸乳桿菌NCC 2463(CNCM-I 2623)的菌株發酵乳組成，對於狗的量相當於大約109-1010cfu/日，其餘成分是鹽維生素和礦物質。
飼料混合物被送入預調節器並浸溼，然後將溼潤的飼料送入擠出機-烹製機，製成凝膠狀。從擠出機擠出的凝膠狀基質通過衝模衝壓並擠出。壓出物被切割成適合餵給家犬的小片，在大約110℃乾燥約20分鐘，冷卻形成小粒。
此幹的狗糧能改善寵物健康情況，特別是能預防寵物的與內毒素有關的病症。
權利要求
1.具有疏水表面性質的乳酸菌和/或雙歧桿菌中的至少一種菌株在製備預防或治療內毒素引起和/或有關病症的組合物中的用途。
2.權利要求1所述的用途，其中乳酸菌或雙歧桿菌的疏水性百分比(％H)至少為80，更優選為85-100％H。
3.權利要求1或2的用途，其中乳酸菌和雙歧桿菌具有結合內毒素或與革蘭氏陰性細菌共聚集的能力。
4.權利要求1-3中任何一項所述的用途，其中乳酸菌菌株或雙歧桿菌選自約氏乳桿菌、路氏乳桿菌、類乾酪乳桿菌、動物乳桿菌、瘤胃乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、發酵乳桿菌、德氏乳桿菌乳亞種、雙歧桿菌屬、雙歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、假長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌。
5.權利要求1-4中任一項所述的用途，其中所述菌株是嗜酸乳桿菌NCC 2463(CNCM-I 2623)、雙歧雙歧桿菌NCC 189(CNCM-I-2333)、雙歧雙歧桿菌NCC 235(CNCM-I-2335)、青春雙歧桿菌NCC 251(CNCMI-2168)、乳雙歧桿菌(ATCC27536)。
6.權利要求1-5中任一項所述的用途，其中乳酸菌的使用量是使每人每日可得到大約103-1014cfu的量。
7.一種分離出的具有疏水表面性質的乳酸菌或雙歧桿菌菌株，其已經根據結合內毒素或與革蘭氏陰性細菌共聚集的能力而被選擇。
8.權利要求7所述的菌株，其中乳酸菌或雙歧桿菌至少從濃度類似於腸道中內毒素含量的溶液中結合30％的內毒素。
9.權利要求7或8所述的菌株，其選自約氏乳桿菌、路氏乳桿菌、類於酪乳桿菌、動物乳桿菌、瘤胃乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、發酵乳桿菌、德氏乳桿菌乳亞種、雙歧桿菌屬、雙歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、假長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌。
10.權利要求7-9中任一項所述的菌株，其為嗜酸乳桿菌NCC2463(CNCM-I 2623)、雙歧雙歧桿菌NCC 189(CNCM-I-2333)、雙歧雙歧桿菌NCC 235(CNCM-I-2335)、青春雙歧桿菌NCC 251(CNCMI-2168)、乳雙歧桿菌(ATCC27536)。
11.一種人類或寵物食物組合物，其含有權利要求7-10中任一項所述的乳酸菌和/或雙歧桿菌中的至少一種菌株以及一種可吸收的載體或藥用基質。
12.權利要求11所述的組合物，其中所述菌株可以用其活的形式或無活性形式使用。
13.權利要求11或12所述的組合物，其中乳酸菌菌株選自約氏乳桿菌、路氏乳桿菌、類乾酪乳桿菌、動物乳桿菌、瘤胃乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、發酵乳桿菌、德氏乳桿菌乳亞種、雙歧桿菌屬、雙歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、假長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌。
14.權利要求11-13中任一項所述的組合物，其中菌株是嗜酸乳桿菌NCC 2463(CNCM-I 2623)、雙歧雙歧桿菌NCC 189(CNCM-I-2333)、雙歧雙歧桿菌NCC 235(CNCM-I-2335)、青春雙歧桿菌NCC251(CNCM I-2168)、乳雙歧桿菌(ATCC27536)。
15.權利要求11-14中任一項所述的組合物，其中乳酸菌菌株的使用量是使每人每日可得到大約相當於103-1014cfu的量。
16.權利要求11-15中任一項所述的組合物，它可以減少、預防或治療內毒素引起和/或有關的病症。
全文摘要
本發明涉及使用具有疏水表面性質的乳酸菌和/或雙歧桿菌中的至少一種菌株製備一種用於預防或治療因內毒素引起的和/或與內毒素有關的病症的組合物，及用具有疏水表面性質的乳酸菌菌株和/或雙歧桿菌中的至少一種菌株製備的人類或寵物食物組合物。
文檔編號A23L1/28GK1501805SQ02807884
公開日2004年6月2日 申請日期2002年2月1日 優先權日2001年2月6日
發明者E·施夫林, E 施夫林, G·科丘賓斯基, 鴇鏊夠 申請人:雀巢製品公司