鈉磷轉運體DvSPT2基因誘導型啟動子、其克隆方法及其應用的製作方法
2023-09-17 03:29:40
專利名稱：鈉磷轉運體DvSPT2基因誘導型啟動子、其克隆方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種鈉磷轉運體/^57T^基因誘導型啟動子、其克隆方法及其應用。
背景技術：
磷元素是植物維持正常生理功能所必需的大量營養元素之一，對於農作物來說磷 肥也是最重要的肥料。但是由於磷在土壤中的低溶解性及高附著性，土壤中可供植物 利用的磷濃度通常是1 mol/L甚至更少。據估算，全球每年有多達57億公頃的土地 因為缺磷而導致農作物減產。另一方面，鹽鹼化是農作物面臨的另外一個重要不利因 素，全球20%的耕地正在受到鹽鹼化影響，嚴重影響了糧食產量。面對當今日益嚴重 的糧食短缺問題，研究植物對低磷和高鹽脅迫的耐受機制，採用基因工程手段提高農 作物對低磷和高鹽脅迫的耐受能力是一項具有重大意義的工作。
鹽藻(￡ "朋&//")是一種無細胞壁的單細胞真核綠藻，是巳知的最耐鹽的真核 生物，廣泛分布於鹽湖、海洋、鹽土等高鹽度的環境中。鹽藻具有十分驚人的滲透調 節能力，通過高效調節細胞內甘油的變化，能在低至50mM高至接近飽和的鹽濃度 的環境下生存，可以一次性耐受3-4倍的滲透壓變化。此外，它對光照、環境pH、 溫度、營養限制如磷飢餓等其他脅迫因素也能夠很好的耐受，因而被廣泛的用來研究 植物對各種脅迫的反應機制。研究證明，生長在ymol/L級別磷濃度環境中的鹽藻， 可積累高達500mmol/L的胞內磷濃度。鹽藻對磷元素的高效吸收不僅滿足了其對磷 元素的一般營養需求，同時也對其合成甘油，抵抗滲透脅迫具有重要的意義。在鹽藻 中，高親和性的鈉磷轉運體參與了磷元素選擇性的跨膜主動運輸，為在高鹽條件下有 效地利用磷元素髮揮了重要的作用。對於這類和高鹽以及磷代謝密切相關的基因及其 調控元件的研究有助於推動農作物的改良工作。
另一方面，除了作為抗逆研究的模式植物，鹽藻也是一種具有多種優點的新型生 物反應器。利用鹽藻作為生物反應器，培養成本低廉，經轉基因表達外源產物不需要 經過複雜的後續修飾加工，而且在鹽環境培養下的鹽藻不易汙染其他微生物，安全性 高。開發鹽藻做為生物反應器生產外源生物活性物質正在成為研究的熱點。目前，在 轉基因的生物反應器中大多採用誘導型啟動子來控制目的基因的表達。因為誘導型啟 動子能夠使目的基因在特定的時期和特定的部位表達,這樣可以使宿主細胞對特定的外界信號作出反應，又可以避免目的基因的過高表達對宿主細胞生長帶來的不良影 響。在這方面，採用鹽藻內源性啟動子具有可靠的安全性，特別是受鹽信號，營養因 素信號誘導的啟動子，不需要化學誘導，無毒副作用，且在生產過程中控制方便。
因此，克隆和分析鹽藻鈉磷轉運體基因的誘導型啟動子不僅能為高等植物的改良 工作提供幫助，而且也為鹽藻生物反應器的開發提供了重要的工具。
發明內容
本發明的目的之一在於提供一個鈉磷轉運體/M5P7^基因誘導型啟動子的核 苷酸序列。
本發明目的之二是提供該DvSPT7基因啟動子的克隆方法。
本發明目的之三是提供了該ZM^"基因啟動子在鹽脅迫以及磷缺乏條件下的基 因調控作用。
為達到上述目的，本發明採用如下技術方案 一種鈉磷轉運體/MS7T^基因誘導型啟動子，其特徵在於該基因具有下列核苷 酸序列之一
(1) .具有SEQ N0 1所示的DNA序列；
(2) .與序列表中序列1限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且編碼相同功 能蛋白質的DNA序列。
一種上述的鈉磷轉運體"K577^基因誘導型啟動子的克隆方法，其特徵在於該方法 的具體步驟為
A. 根據NCBI GenBank上DvSP77的cDNA序列，即DQ286761 ，設計引物，引 物的序列如下
5'- AGAACCTGAGCGGCTTCATC- 3' 5'- CACGCAGCAATGAAGGAGGT- 3'
通過四維PCR篩選體系從鹽藻基因組BAC文庫得到一個含有鹽藻鈉磷共轉 運通道2號基因/M57T2的BAC克隆，並構建該BAC克隆的鳥槍文庫；
B. 大通量提取鳥槍文庫的質粒DNA，在MegaBACE 4500上進行序列的測定， 每個鳥槍質粒利用M13正反向引物，進行雙向測序；
C. 在RedHat Linux平臺的並聯計算機群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼 接所測序列，得到若干長短不一的重疊群Contig;使用PCR方法填補測序200810040039.0
說明書第3/8頁
"溝"，使用細菌轉座子Kit填補物理"溝"，最後拼接得到一段連續的全 長為64776 bp的鹽藻基因組序列，Z)vSi572基因組序列的啟動子和上遊調 控序列也一併獲得，以開放讀碼框第一位鹼基為基準，向5'上遊方向劃定 1500bp，即為鈉磷轉運體"K577^基因誘導型啟動子。 一種上述的鈉磷轉運體ZV5/Ti"基因誘導型啟動子在鹽脅迫以及磷缺乏條件下的 基因調控中的應用。
本發明根據分析所推定的抗逆相關順式作用元件，著重分析了鈉磷轉運體 "^57T^基因誘導型啟動子的內源活性。通過檢測受這個啟動子調控的基因在不同逆 境脅迫條件下的轉錄水平，揭示了這個啟動子在極端逆境環境下的基因調控模式，證 明啟動子在特殊外界環境信號下的高度可誘導性，具有重要的應用意義。
圖1為BAC DNA序列的BLASTn比對結果示意圖，箭頭所指為DvSi577基因 組之所在位置。
圖2為DvSPT7基因和上遊啟動子區在這個拼接完成的BAC DNA序列上的位置 的示意圖。
圖3為DvSiT2上遊啟動子序列中的轉錄起始位點和推定的順式作用元件。圖例 t，轉錄起始位點；★， ACACNNG, El/E2/E3-core序列；方框'GGTTT， GT-Box 序列；▲， CACGTA ， ABRE4序列；■， GTGGNG， Alfinl BS2序歹!j;下劃線，Pho4P 結合位點。圖中的位置定義，以已知的DW戶77的開放讀碼框的第一位定義為+1，之 前一位定義為-1，以此類推。
圖4為Dv5P"在6個不同鹽穩態條件下的表達情況,X軸代表鹽藻培養基中氯 化鈉的濃度，單位為摩爾/升，Y軸代表目標基因拷貝數與內參基因拷貝數的比值。
圖5為DvS戶72在鹽振蕩(A)與磷"飢餓"(B)脅迫下的表達情況，X軸代 表鹽藻受外界脅迫的時間，單位為小時，A圖中的"3M"表示在氯化鈉3摩爾/ 升的濃度下持久培養的情況，Y軸代表目標基因拷貝數與內參基因拷貝數的比 值。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規條件，分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rded.)或植物分子 生物學一實驗手冊(Plant Molecular Biology—A Laboratory Manual, Melody S. Clark 編，Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述條件，或按照製造廠商所建議的 條件。
實施例一BAC克隆的篩選與鳥槍文庫的測序及拼接
根據NCBI GenBank (http:〃麗w.ncbi.nlm.nih.。ov)上￡H'5P77的cDNA序列 (DQ286761 ) 設計引物 (5'- AGAACCTGAGCGGCTTCATC- 3'與 5'-CACGCAGCAATGAAGGAGGT- 3')，通過四維PCR篩選體系從鹽藻基因組BAC文 庫得到一個含有鹽藻鈉磷共轉運通道2號基因的BAC克隆，並構建該BAC克隆的鳥 槍文庫。
大通量提取鳥槍文庫的質粒DNA，在MegaBACE 4500上進行序列的測定。每個 鳥槍質粒利用M13正反向引物，進行雙向測序。以該BAC克隆大小為65 kb計算， 以每個測序反應得到可用序列為800 bp,得到可用序列的成功率以80%來計算，按 IO倍覆蓋的要求，共測序約500個鳥槍文庫質粒，即5塊96孔板。
在RedHat Linux平臺的並聯計算機群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所測 序列，得到若干長短不一的重疊群(Contig)。使用PCR方法填補測序"溝"，使用 細菌轉座子Kit填補物理"溝"，最後拼接得到一段連續的全長為64776 bp的鹽藻基 因組序列。
實施例二 Dvs戶r2基因組序列及其上遊啟動子序列的獲得與分析
在NCBI的核酸序列庫中，BAC DNA序列的Blastn比對結果顯示，在連續的鹽
藻基因組序列中發現了一個鹽藻鈉磷共轉運通道基因DvSiT2，參見圖l和圖2。 通過與已知的DvSPT2的cDNA序列進行BLAST 2 SEQUENCES,我們發現
Z)vS屍"基因組全長為8499 bp，包括20個外顯子和19個內含子。所有內含子5'都是
GT， 3'者P是AG。
基因組序列的啟動子和上遊調控序列也一併獲得，以開放讀碼框第一位 鹼基為基準，向5'上遊方向劃定1500bp，通過TSSP程序進行啟動子和順式作用元件 分析。我們發現DvS戶77不具有常見的TATA-Box，轉錄起始位點在-447位上，上遊 區存在大量在其他物種中報導過的逆境相關的順式作用元件，包括ABA響應，鹽脅 迫相應，磷元素代謝的PHO調控元件等，參見圖3和表1。這說明DvSiT2的啟動子
參JiJ^S:逆境脅迫相^iilfij具有廣泛的應用前景。表LZMS屍"啟動子區的順式作用元件分析
順式作用元件 (序列/名稱)可能參與的過程在Z)WP77上遊的位置
ACACNNG El/E3/E4-core motifABA脫落酸響應-568—562, -556—550, -526 -520， -516—510
GGTTT GT-Box缺氧響應-662—657
CACGTA ABRE4ABA脫落酸響應一487~-482
GTGGNG Alfinl BS2鹽適應相關-479~-474
CACGT Pho4 binding site在磷轉運體中保守， 涉及PHO調控系統-1263—1258
實施例三通過Realtime-PCR方法分析鹽藻DW屍r2啟動子在鹽脅迫和磷飢餓 下的調控模式
(一) 引物設計
用Primer Premier軟體在DvSi5712靠近3'區域設計合適的特異性引物用於 Realtime-PCR檢測。檢測Dv5"屍77表達所用的引物為DvSPT2RTS和DvSPT2RTA; 以持家基因DvJcri"作為內參，所用檢測引物為DvActinRTS和DvActinRTA。
引物序列如下
(1) DvSPT2RTS: 5'-CAGACCGTTCCCTAGATTAG-3'
(2) DvSPT2RTA: 5'-CATAACACCAAGGTCGTAAA-3，
(3) DvACTINRTS: 5'-GCCACTGCTTTAGCTGTTTGC-3'
(4) DvACTINRTA: 5，-CCTCATGCTCCCAGATGTTCTA-3'
(二) 模板的製備
作為一個鈉磷轉運體基因DvSi577的啟動子，我們首先感興趣的是其在鹽脅迫 和缺磷誘導下的調控DuSiT2基因的表達模式。我們抽取了在不同NaCl濃度穩定培 養條件下的鹽藻細胞總RNA，經受1 M NaCl—3 M NaCl高鹽震蕩後不同時間點的 鹽藻細胞總RNA，經受從正常培養條件下轉移到缺磷培養條件後不同時間點的鹽藻 細胞總RNA。將抽提的總RNA反轉錄為cDNA。以這些cDNA為模板進行Real-time PCR分析。
(三) Real-time PCR法檢測DvSPT7啟動子的調控模式Real-time PCR分析使用SYBR Green染料法，DNA Engine Option2 System (MJ Research)分析系統，標準曲線法定量分析。
Real-time PCR檢測結果表明，在不同鹽濃度的穩定培養條件下，DvSi5"的受 調控表達與鹽濃度密切相關，在0.5M低鹽濃度下，DvS/T2的表達非常微弱，隨著 鹽濃度的上升，/)v57T2的表達水平也表現出了一個明顯的上升趨勢，到4M時達 到最高峰，5M略有下降，參見圖4A 。
當鹽藻細胞從lMNaCl低鹽環境突然轉移到3MNaCl高鹽環境時，面對突然 加劇的逆境條件，Z^S^77的表達受到強烈誘導，對外界的脅迫做出了一個快速的反 應，在短短6個小時內，轉錄水平就表現出明顯的升高，在鹽震蕩後36小時達到最 高值，參見圖4B。
在鹽脅迫的條件下，鹽藻急需加強對各種營養元素的吸收以在逆境下維持正常的 生理活動。這些結果表明了鹽藻在面臨極端高鹽的不利條件下，DvSPT2的高表達證 明了其上遊調控序列在鹽適應過程中發揮了靈敏和重要的調控作用。
當鹽藻細胞從正常培養環境中轉移到缺乏磷元素的培養環境時，為了應對"磷飢 餓"，D必/T2的表達水平迅速升高，在短短4個小時的時間內就上升到了一個可觀 的豐度。這個的急劇上調的表達模式表明ZM 屍77啟動子在鹽藻應對磷元素缺乏時， 做出了一個快速的反應，及時提升了基因的表達豐度。參見圖4C。這些結果證實了 DvS/T2的啟動子是一個參與高鹽以及缺磷響應的啟動子，在鹽藻抗逆過程中起到了 重要的作用。
鹽藻鈉磷轉運體基因"M屍7^啟動子作為一個受到高鹽以及缺磷信號調控的誘導 型啟動子，在多個方面具有重大的應用價值。
首先，利用鹽藻作為新型生物反應器生產外源生物活性物質正在成為一項關注熱 點，DM/T2誘導型啟動子在這個領域具有重大的潛在應用價值其作為一個鹽藻內 源性的啟動子，排除了安全性和可靠性方面的問題；這個啟動子不需要化學誘導，只 需改變鹽度和營養條件即可，從而使鹽藻生物反應器無汙染、無毒副作用；通過鹽度 或者磷元素濃度變化即可控制啟動子的活性，從而控制外源基因的表達量，在低鹽或 者磷元素充沛的條件下,啟動子活性低或暫時處於失活狀態，外源基因不表達，從而 對宿主鹽藻細胞的生長繁殖不會造成不良影響。因此，高鹽和低磷誘導的DWP77啟 動子在轉基因鹽藻作為生物反應器的工作中，具有較為廣闊的應用前景。
—其次，在使用基因工S^雖改良農作物耐受高鹽和缺磷脅迫的工作中，誘導型啟動子也有重要的應用價值。因為諸如在轉基因工作中常用的35S這樣的組成型強啟動 子，持續驅動抗逆基因的高水平表達，會對在正常環境中的生長的農作物本身造成不 利影響。而當採用類似DvSP77啟動子這樣的受逆境誘導的啟動子驅動時，只有在作 物遭遇到如高鹽和缺磷等不利因素時，誘導性啟動子才開始驅動抗逆基因，幫助作物 適應環境脅迫。當環境脅迫減輕時，基因的表達又可以恢復到低水平，不會對作物生 長造成副作用。因此，作為能對逆境信號做出靈活反應的DvSPT2啟動子，在轉基因 改良農作物的工作中也具有一定的應用價值。
儘管本發明描述了具體的例子，但是有一點對於本領域技術人員來說是明顯的， 即在不脫離本發明的精神和範圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因此，所附 權利要求覆蓋了所有這些在本發明範圍內的變動。本文引用的所有出版物、專利和專 利申請均納入本文作參考。序列表
〈110〉 上海大學
〈120〉鈉磷轉運體/MS7T2基因誘導型啟動子、其克隆方法及其應用 〈130〉 080610 <160〉 1
〈170〉 Patentln version 3.5
〈210〉 1 〈211〉 1500 〈212〉 DNA
〈213〉 鹽藻(Dunaliella viridis) <400〉 1
cgtgtgtgca tgtgcgtgca cgtgcggctg tgcaagcgtg tgcgtgcatg tatgtatgct 冊
tttg卿gag cgtc鄉tgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 120
gtgtgtgcac gcgcstgcaa gtgtacatgt acgtgagagt gtgcacacgc aagcgcgcgt 180
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ttgcgctcct gccacacatg cttggcggca tgaagttccg acagcacatt ccacctxcga 1380
cagagattcc ctcgccaaaa gtatgcgatc cagtgcatct ccacgcaaaa tattcctccc 1440
ccgccctcca ttgctgtagc agcggccgga gctagtctcc ggtccttcaa gcttgcaacc 1500
權利要求
1.一種鈉磷轉運體DvSPT2基因誘導型啟動子，其特徵在於該基因具有下列核苷酸序列之一(1).具有SEQ NO 1所示的DNA序列；(2).與序列表中序列1限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
2. —種根據權利要求1所述的鈉磷轉運體A^/T2基因誘導型啟動子的克隆方法， 其特徵在於該方法的具體步驟為a. 根據NCBIGenBank上DvS屍r2的cDNA序列，即DQ286761，設計引物，引物的序列如下 5'陽AGAACCTGAGCGGCTTCATC- 3' 5'- CACGCAGCAATGAAGGAGGT- 3'通過四維PCR篩選體系從鹽藻基因組BAC文庫得到一個含有鹽藻鈉磷共轉 運通道2號基因/M57T2的BAC克隆，並構建該BAC克隆的鳥槍文庫；b. 大通量提取鳥槍文庫的質粒DNA，在MegaBACE 4500上進行序列的測定，每個鳥槍質粒利用M13正反向引物，進行雙向測序；c. 在RedHat Linux平臺的並聯計算機群中，使用Phred/Phrap/Consed程序 拼接所測序列，得到若干長短不一的重疊群Contig;使用PCR方法填補 測序"溝"，使用細菌轉座子Kit填補物理"溝"，最後拼接得到一段連 續的全長為64776 bp的鹽藻基因組序列，DvSiT2基因組序列的啟動子 和上遊調控序列也一併獲得，以開放讀碼框第一位鹼基為基準，向5'上 遊方向劃定1500bp，即為鈉磷轉運體/MS7T^基因誘導型啟動子。
3. —種根據權利要求1所述的鈉磷轉運體/V5P7^基因誘導型啟動子在鹽脅迫以及 磷缺乏條件下的基因調控中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種鈉磷轉運體DvSPT2基因誘導型啟動子、其克隆方法及其應用。本發明通過對篩選鹽藻基因組文庫並對陽性克隆的測序，獲得鹽藻鈉磷共轉運通道2號基因(DvSPT2)的包含上遊調控序列在內的啟動子區。通過對啟動子區的分析表明，其中含有多個可能參與多重逆境脅迫的順式作用元件。通過對在逆境條件下下DvSPT2的受控表達模式的檢測，證明了DvSPT2在這些逆境下受到了了明顯的誘導，表明DvSPT2這個基因上遊的啟動子區和調控序列在鹽藻逆境適應中扮演了重要的角色。作為一個逆境信號誘導的啟動子，DvSPT2啟動子區和上遊調控序列，在基因工程的應用方面具有重要的價值。
文檔編號C12N15/31GK101302525SQ200810040039
公開日2008年11月12日 申請日期2008年7月1日 優先權日2008年7月1日
發明者彬 盧, 厲高慜, 孟祥宗, 宋任濤, 張文文, 管禎瑋, 許政暟 申請人:上海大學