鹽藻中鈉磷共轉運通道1;2基因、其編碼蛋白及其克隆方法

2023-09-17 03:20:55

專利名稱：鹽藻中鈉磷共轉運通道1;2基因、其編碼蛋白及其克隆方法
技術領域：
本發明涉及鹽藻中鈉磷共轉運通道l;2基因、其編碼蛋白及其克隆方法。
背景技術：
鹽藻，又叫杜氏藻，它是一種無細胞壁的單細胞真核綠藻，是已知的最耐鹽的真 核生物。同時，它對光照、環境pH、溫度和重金屬離子等變化造成的脅迫也能夠很 好的耐受。因而被廣泛的用來研究植物對各種脅迫的反應機制，特別是耐鹽脅迫的機 制。
磷是所有生物必需的生命元素，生物體對無機磷吸收利用的第一步是通過無機磷 轉運通道來實現的。本實驗室利用SSH技術從鹽藻(Dw"fl//e//fl v/nYfo)中分離到兩 個受高鹽與磷"飢餓"誘導的鈉磷共轉運通道基因(DvSP7V， DWiT2)。在功能上， Z)vSP77和I)vS戶77可能與鹽藻細胞中的無機磷的轉運，促進甘油合成，維持對外界 高滲脅迫的適應有關。
基因複製是基因組進化的一種重要機制，是基因功能多樣化的前提，也是物種進 化的主要推動力。基因發生複製後積聚突變或者獲得新的功能，或者退化成沒有功能 的假基因。基因功能在具備多樣化之前，必需先發生基因複製，由此可見基因複製在 進化中的重要性。

發明內容
本發明的目的之一是提供鹽藻鈉磷共轉運通道l;2基因(DvS戶77;力。 本發明的目的之二在於提供該基因的編碼蛋白。 本發明的目的之三在於提供該基因的克隆方法。
為達到上述目的，本發明通過"鳥槍"法測序鹽藻BAC克隆DNA，得到了一段 連續的鹽藻基因組序列，根據在NCBI的核酸庫中的Blastn比對發現，獲得了鹽藻鈉 磷共轉運通道l;2基因(DvS屍77;力。
本發明採用如下技術方案
一種鹽藻鈉磷共轉運通道l;2基因，其特徵在於該基因具有SEQ N0 1所示的
鹼基序列。
上述的鹽藻鈉磷共轉運通道l;2基因編碼蛋白，其特徵在於具有SEQ N0 2所示 的胺基酸序列。
上述的鹽藻鈉磷共轉運通道l;2基因的克隆方法，其特徵在於該方法具有如下步
驟
a. 根據NCBI GenBank DvS屍n (DQ286760) 的基因組序列設計下列引物5' ACTGGTCCACAGACAAGAAGG 3'與5' TCTCAGCATCACGAGCCATA 3';通過四維PCR篩選體系從鹽藻BAC文庫得到一個含有鹽藻鈉磷共轉運通 道基因的BAC克隆，並構建該BAC克隆的鳥槍文庫；
b. 從步驟a中構建的鳥槍文庫中，大通量提取鳥槍文庫的質粒DNA，在 MegaBACE4500上進行序列的測定；每個鳥槍質粒利用M13正反向引物，進 行雙向測序；共測序600個鳥槍文庫質粒，即6塊96孔板；
c. 將上述的600個鳥槍文庫質粒的原始數據輸入在RedHat Linux平臺的並聯計 算機群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所測序列，構建亞克隆並測序以 填補出現在序列之中的缺口，得到一段連續的鹽藻基因組序列。通過Blastn 程序(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)在該連續的鹽藻基因組序列中， 獲得鹽藻鈉磷共轉運通道l;2基因的全長基因組序列，長度為7973bp。
本發明通過對鹽藻BAC克隆DNA的"鳥槍"法測序，在連續的鹽藻基因組序 列中發現鹽藻鈉磷共轉運通道1基因(Z)vSP77)和不同於已知的鹽藻鈉磷共轉運通 道1;2基因(DvS屍77;2)。它們可能起源於鹽藻基因組序列的複製，並且在6個不同 鹽穩態條件下Z)vSP77z2的表達量要大於DvSP77，它們的表達趨勢也發生了分化。 當鹽藻處在極端高鹽濃度條件下(5M NaCl)時，Dv5P77;2可能擔負起主要功能， 它增加了鹽藻對於更寬鹽濃度的適應性。而Z)v5777;2響應高鹽或磷"飢餓"脅迫時 的誘導表達趨勢與DM戶77類似，在功能上可能與鹽藻細胞中的無機磷的轉運，促進 甘油合成，維持對外界高滲脅迫的適應有關。本發明在研究植物抗鹽機制上具有一定 的理論意義。


圖l顯示了BAC DNA序列的Blastn比對結果示意圖，圖中兩個箭頭所指匹配 到序列都是鹽藻鈉磷共轉運通道基因(Z)wm/zW/fl v/n'cfo sodium-coupled phosphate transporter protein gene)，它們在GenBank中的序列號都是DQ286760。左側箭頭所
指序列是Z)vS屍n，右側箭頭所指序列是DvSP77;2。
圖2顯示了 DvS屍77和DvS屍77;2的基因組序列結構示意圖，圖中灰色的箭頭代 表大片段重複區段，黑色箭頭代表非重複區段。
圖3 DvSP7V和Dv5P77;2在6個不同鹽穩態條件下的表達情況，X軸代表鹽藻 培養基中NaCl的濃度，Y軸代表目標基因拷貝數與內參基因拷貝數的比值。圖下的 表格代表了柱狀圖示的具體數值。。
圖4 DvSP7V和DvS屍77;2在高鹽(A)與磷"飢餓"(B)脅迫下的表達情況，X軸 代表鹽藻受外界脅迫的時間，Y軸代表目標基因拷貝數與內參基因拷貝數的比值。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體實驗條件的實驗方法，通常按 照常規條件，分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rded.)或植物分子 生物學一實驗手冊(plant Molecular Biology—A Laboratory Manual, Melody S. Clark 編，Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述條件，或按照製造廠商所建議的 條件。
實施例一BAC克隆的篩選與鳥槍文庫的測序及拼接
根據NCBI GenBank (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)上DvSiTl (DQ286760)的 基因組序列設計引物(5' ACTGGTCCACAGACAAGAAGG 3'與5' TCTCAGCATCACGAGCCATA 3')，通過四維PCR篩選體系從鹽藻BAC文庫得到 一個含有鹽藻鈉磷共轉運通道基因的BAC克隆，並構建該BAC克隆的鳥槍文庫。
大通量提取鳥槍文庫的質粒DNA，在MegaBACE 4500上進行序列的測定。每個 鳥槍質粒利用M13正反向引物，進行雙向測序。以該BAC克隆大小為70kb計算， 以每個測序反應得到可用序列為800 bp，得到可用序列的成功率以80%來計算，按 10倍覆蓋的要求，共測序600個鳥槍文庫質粒，即6塊96孔板。
在RedHat Linux平臺的並聯計算機群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所測 序列。構建亞克隆並測序以填補出現在序列之中的缺口，得到一段連續的鹽藻基因組 序列。
實施例二 BAC DNA序列的Blastn比對與Z)vS屍J7和DvS屍77，'2基因組序列的
比較
在NCm的核酸庫中，BAC DNA序列的Blastn比對結果顯示，在連續的鹽藻基 因組序列中發現了兩個鹽藻鈉磷共轉運通道基因(圖1)。圖中左側箭頭所指序列就 是鹽藻鈉磷共轉運通道1基因(Z)WP7V)，右側箭頭所指序列是一個新的同源基因， 命名為鹽藻鈉磷共轉運通道1;2基因(ZH^屍77z2)。
在Z)WP77和i)W屍77;2 8 kb左右的基因組序列範圍內，包括大片段重複區域(大 約7 kb, 97.9%的同源性)與3'下遊區域(只有47.0%的同源性)(圖2)。大片段重 復區域覆蓋了這對同源基因的5'上遊區域，整個基因編碼區域，但不包括3'下遊區 域(圖2)。以上結果暗示DvSPT7和DvSP77J可能來源於鹽藻中同一祖先基因的基 因複製(gene duplication),這種基因複製的機制可以幫助鹽藻在進化中增加基因的 數量，分化基因的功能。
實施例三DvSP77/2基因在不同外界條件下的表達分析
分別設計DvS屍77;2和DvS屍7V以及內參基因Z)"cri" (AF163669)的特異性引 物，利用Real-time PCR的方法檢測DvSP77;2和Z)vSP7V在不同外界條件下的表達量。 DvSPTlRTS: 5' TTGTGGCTGGTTCATATCCT 3' DvSPTlRTA: 5' TATTCAATCAGTTCAGTGGG 3' DvSPTl;2RTS: 5' TGTTCCTTCGGCTGTCTTAT 3' DvSPTl;2RTA: 5' AATTGAGTTCCTCGCTTGTG 3' DvActinRT+: 5' GCCACTGCTTTAGCTGTTTGC 3' DvActinRT陽5' CCTCATGCTCCCAGATGTTCTA 3'
Real-time PCR分析結果顯示(圖3)，在6個不同鹽穩態條件下DvS屍77;2的表 達量要大於DvS戶77。並且從0.5M至5MNaCl， Z)vS戶77;2的表達是逐漸上升的；而 DW戶77的表達經歷了一個先上升後下降的過程。由此可知，DWP77;2和DvS戶7V在 表達上發生了分化。
而DW戶77;2響應高鹽或磷"飢餓"脅迫時的誘導表達趨勢與DvS戶77類似，並 沒有發生改變(圖4)，這說明DvSP77;2和DvS戶77在功能上都與鹽藻細胞中的無機 磷的轉運，促進甘油合成，維持對外界高滲脅迫的適應有關。 序歹U表 <110〉上海大學
鹽藻鈉磷共轉運通道1;2基因、其編碼蛋白及其克隆方法 2
1
7973
DNA
鹽藻( 1
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atttcgcgtg cgagcgtggc cagaaagctg catctacaca ggagggggca ttcctgcacc 1680 ctcttttcca tcccactgcg gcactgcact cactccgcca cacacaccca cccacccaca 1740 cacacacacg cacaggcgag aacttcacct accacgatgg caaggtgagc gacgggctgg 1800 gtgggtgggc cgctgtgcgg taggggtccc tcatgtcatg gtccctctaa gaggatgccg I860 atgccggatt tctgtcggga ggagataggc ctgagagcat tgtagctctc ctttgtactg 1920 agacctccat tcctgtgctt tgcgttgtgt ctgccctgct gctcatcagt gtgttcagcg 1980 catggacacg cgagcatggt gcccagcatc tgccctgcca tcccctcgct ctcgtcctgc 2040 agtggtctgc ctacgtgtgg ctgctggtca tcggctcctt cacctcattc atggctgcat 2100 ggggcatcgg tgccaacgat gtggccaact ccttcgccac aagtgagcac tcggtcaatg 2160 tgcatgcctg catgagctta tgctgcactt gtgtgcacgt gtgtgcctat gtttagggat 2220 gctggctgtt gagcagtaca ttgcatgtct gaatagatgt gatgatgtga ataaacagct 2280 ttagatgatg tg犯taaaca gctttagact gttgggcata ccccaELcaac cgcatcgtgt 2340 cagtgcctct actctctgtg tctctcctct ccactgcagg tgtgggctcc aaggctttga 2400 ccatgttcca agcctgcgtg gtgggtgccc cgtgcttgtg tggggtttgg tgctcttagg 2460 ttcttgaaaa cccctgcttg ccagtgcccc ccctttttcc aaaatgtgtt tgagagttaa 2520 cgttaccata ttctccagtc agactgttaa ttcctctggt tgagcatcac tctgtacaac 2580 tgagcatcag tgctgagcct tttctgagag caattccagt gctcgttcga tgctgggcct 2640 ccacccagac tgacatctcc ctttgtgttt gacactcgtg catcacagat tgcgggcatc 2700 tttgaatttg tcggcgctgt gtccctgggt ggtactgttg tgaagaccgt gaagggctcc 2760 atcactgacc cctcaatgtt caagcaccag ccccaggtat ttctttcttt cgggtgtacc 2820 tgtgcgagca tgcacatgtg tgcgcaggtt atgtgccccc cttttcacaa gaaattttgt 2880 gaatcctgtt tccagccgag tgttagtttc tgtccctttc tcccgtttca tggtgctaaa 2940 accaaaccaa tcatcgctxt caacctgcag atttttgcgt acggcatgct tggtgcctct 3000 acttctgtag ccattgtgct cttcctggcc acatacttga agcaggctgt gtccaccaca 3060 cacactgcaa gtgagtagca gcagtgattg cttgagcctc gtgctacttg cttgcaatct 3120 gcttgacgtt ggaggttaag aaggcacttt ctggcgtaag gatgctctgg atcgttgtga 3180 ctgaaacagc aagcacttac tattattaac cagcactgca cttgcctttt ccgcagttgg 3240 gtctgtgcU ggcttcggct tggtgtatgg aggcgctgat ggtgtgacct ggaacgaggt 3300 gtccgatgag gtgagaccat tgcattgcta ggagtcatac atagcgcctt actgcaagct 3360 gctgtgtaac aagaactggt atccttttag tttttccgct aattctcttt ccaagagagg 3420 gaaaactaat tgttgctcct atcatgcatc accacccgtc ttcgttccct gcagttcccc 3480 ttccgcaagg ggttcacacc tgtcgtcatc tcctggttcg tctcccccgt cttcactgcc 3540 attctgtcct ccggattctt catcatcacc aggtgtgtgc cccaaaggct gggtgtcctt 3600 gattaattaa ggtgtgtttg ctcgttgaca tcatctttct gttgcaagtt gtagctcaca 3660 tgccaagctg cgcagaacaa ggtggaagga aggagaaagc acttccctct ctgaatccct 3720 gtcctcctgc aggattgtct gcctgcagcg ccagcaatcc tacaagattg ccttcttcat 3780 gatccctgtg ctgatgatga tcaccatctt cattgtcctg ctggccatct tcctgaaggt 3840 gagcagaatt gtctgatctc tcttctcttg tacgcttgtt tctggcttgt caagctcgca 3900 tgcattcttg cacatgcata cagacatgca tgcacacaca tgcacc犯ca cgtgcagagt 3960 gtggactctg gacacgaccg tgagggtgag ctgaactggt ccacagacaa gaaggcctgg 4020 gtggcaattg ttgttggtgc tggtgccggt ctgctgacca tcccctacac catctggctg 4080 鄉aagtcca tgctccagtg agtctctgtt tgatcctgtc atgagtaggc tccattcagt 4140 gcagtaagtt cagcagtgca ctgagtcttg ctcatcctca tcaacacaca agtttcctgt 4200 ttagagacaa aaaccaacag ccatactggt gctcaactta ctccatgtct cgacacaatc 4260 gatctcacca caaattttcg ctggcctaca gggaggacca ggaagtgcac gaggagaata 4320
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3CC33g33tg ttg3ttgtCC tttgCgt33t
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gtgtctgttt gcaagtttct tctgttggtt
CC3t3t3t3g 3ggtt3tgC3 33gg33g3ga
2 672 PRT
鹽藻(Dw"a//e//a vzWcfo) <400〉 2
Met Thr Asp Val Asp Ser Phe Ser Gly Asn Met Pro Asn Leu Ser 1 5 10 15
Gly Phe Glu Ser Ala Ala Gly Trp Gin Gly Glu Asn Phe Thr Tyr 20 25 30
His Asp Gly Lys Trp Ser Ala Tyr Val Trp Leu Leu Val He Gly 35 40 45
Ser Phe Thr Ser Phe Met Ala Ala Trp Gly He Gly Ala Asn Asp 50 55 60
Val Ala Asn Ser Phe Ala Thr Ser Val Gly Ser Lys Ala Leu Thr 65 70 75
Met Phe Gin Ala Cys Val lie Ala Gly lie Phe Glu Phe Val Gly 80 85 90
10
atctgttccttcggctgtcttattatttag7080
ggctgcctgagtggtcaatcttgctagtga7140t￡lg￡L￡LtCSLtgc鄉gatctgtctgagcagt7200
ccgcctgcttagtgcactgt7260
cctcgtgcaatgtgatgtct7320
tgatttcagtcttgaactgtgatgtccttg7380
ccgtctactcttgtacatttcatgattgta7440
cttcagctatgtcaatgtgagggctg卿a7500
acaccattcagtaccaggtgactgccaggc7560
acagagtaaccacgagtgttgcactggttc7620
gctcatg犯gac 11 cataaacaagtacgag7680
gg已gcccgccggcacacaaactagctaaag7740
tggacsgacacgtgggtagtgcactaccca7800
gtaaggcagg7860
tg￡Ltt￡L￡L￡Lg￡Lgcc肪gg卿tagcgatctc7920
33g7973
Ala Val Ser Leu Gly Gly Thr Val Val Lys Thr Val Lys Gly Ser 95 100 105
lie Thr Asp Pro Ser Met Phe Lys His Gin Pro Gin lie Phe Ala 110 115 120
Tyr Gly Met Leu Gly Ala Ser Thr Ser Val Ala lie Val Leu Phe 125 130 135
Leu Ala Thr Tyr Leu Lys Gin Ala Val Ser Thr Thr His Thr Ala 140 145 150
He Gly Ser Val Leu Gly Phe Gly Leu Val Tyr Gly Gly Ala Asp 155 160 165
Gly Val Thr Trp Asn Glu Val Ser Asp Glu Phe Pro Phe Arg Lys 170 175 180
Gly Phe Thr Pro Val Val lie Ser Trp Phe Val Ser Pro Val Phe 185 190 195
Thr Ala lie Leu Ser Ser Gly Phe Phe lie lie Thr Arg lie Val 200 205 210
Cys Leu Gin Arg Gin Gin Ser Tyr Lys lie Ala Phe Phe Met lie 215 220 225
Pro Val Leu Met Met He Thr lie Phe He Val Leu Leu Ala He 230 235 240
Phe Leu Lys Ser Val Asp Ser Gly His Asp Arg Glu Gly Glu Glu 245 250 255
Asn Trp Ser Thr Asp Lys Lys Ala Trp Val Ala He Val Val Gly 260 265 270
Ala Gly Ala Gly Leu Leu Thr lie Pro Tyr Thr He Trp Leu Arg 275 280 285
Lys Ser Met Leu Gin Glu Asp Gin Glu Val His Glu Glu Asn Met 2卯295 300
Ala Arg Asp Ala Glu Thr Ala His Val Ala Ala Gly Gly Thr Leu 305 310 315
Lys Glu Lys Asn Pro Glu Asp Asp Val His Glu Leu Thr Lys Ala 320 325 330
Glu Lys Phe Met Glu Trp Phe Asn Gly Thr Trp Phe Gly Gin Arg
335 340 345
Gin Phe Val Lys Asn Phe Val Ala Ala Met Thr Tyr Asp Val His 350 355 360
Ala His Val Ala Thr Met Asp Asn Pro Lys Val Ala Gin Met His 365 370 375
Ala Asp Ala Glu Val Phe Asp Pro Arg Thr Glu Asp Val Phe Lys 380 385 3卯
Arg Met Gin lie lie Thr Ala Ser Ala Val Ala Phe Val His Gly 395 400 405
Ala Asn Asp Val Ala Asn Gly Val Gly Pro Leu Ala Gly lie Trp 410 415 420
Asp Thr Tyr Asn Thr Tyr Gin Ser Gly Ser Gly Lys Ala Ser Gin 425 430 435
Pro Arg Trp He Leu Val lie Gly Ala Ala Gly lie Val Phe Gly 440 445 450
Leu Ala Met Tyr Gly Tyr Arg lie lie Ala Thr Leu Gly Val Asp 455 460 465
Leu Val Val Met Thr Pro Ser Arg Gly Tyr Ser Val Glu Leu Ala 470 475 480
Ala Ala Ala lie lie Ala Leu Ala Ser Thr Tyr Gly Leu Pro Val 485 4卯495
Ser Thr Thr Gin Val Val Thr Gly Gly Glu lie Gly Val Gly Met 500 505 510
Cys Glu Ser Trp Lys Met Thr Gly Val Asn Trp Leu Leu Phe lie 515 520 525
Arg Thr Phe Trp Gly Trp Val Gly Ala Leu Val Thr Gly Ala lie 530 535 540
Leu Ser Ala Leu Leu Phe Ser lie Gly Val Tyr Gly Pro Ser Arg 545 550 555
Thr Asp Leu Asp Tyr Val Thr His Tyr Gin Arg Ala Met Lys lie 560 565 570
Asp lie Asp Gin Ser Met Gin Ala Leu Leu Asp Arg Cys Ala Ala 575 580 585
Ala Pro Ala Pro Thr Asn Gly Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Asp 590 595 600
Leu Asn Cys Ser Cys Gin Gin Arg He Pro Tyr Thr Met Gly Asp 605 610 615
Leu Gin Gly Leu Lys Thr Gin Val Asp Gly Leu Phe Asn Phe Glu 620 625 630
Glu Asn Gly Gin lie Asn Glu Tyr Asn Met Met Tyr Met Leu Arg 635 640 645
Gin lie Asn Ser Leu Phe Lys Tyr Thr Phe Phe Asp Gly Asp Phe 650 655 660
Ser Gin Tyr Glu Asn Val Ser Glu Gin Thr Met Pro 665 670
權利要求
1.一種鹽藻鈉磷共轉運通道1；2基因，其特徵在於該基因具有SEQ NO 1所示的鹼基序列。
2. —種根據權利要求1所述的鹽藻鈉磷共轉運通道l;2基因編碼蛋白，其特徵在於 具有SEQ N0 2所示的胺基酸序列。
3. —種根據權利要求1所述的鹽藻鈉磷共轉運通道l;2基因的克隆方法，其特徵在 於該方法具有如下步驟-a. 根據NCBI GenBank DvS屍n (DQ286760) 的基因組序列設計下列引物5' ACTGGTCCACAGACAAGAAGG 3'與5' TCTCAGCATCACGAGCCATA 3';通過四維PCR篩選體系從鹽藻BAC文庫得到一個含有鹽藻鈉磷共轉運通 道基因的BAC克隆，並構建該BAC克隆的鳥槍文庫；b. 從步驟a中構建的鳥槍文庫中，大通量提取鳥槍文庫的質粒DNA，在 MegaBACE4500上進行序列的測定；每個鳥槍質粒利用M13正反向引物，進 行雙向測序；共測序600個鳥槍文庫質粒，即6塊96孔板；c. 將上述的600個鳥槍文庫質粒的原始數據輸入在RedHat Linux平臺的並聯計 算機群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所測序列，構建亞克隆並測序以 填補出現在序列之中的缺口，得到一段連續的鹽藻基因組序列；通過Blastn 程序在該連續的鹽藻基因組序列中，獲得鹽藻鈉磷共轉運通道l;2基因的全長 基因組序列，長度為7973bp。
全文摘要
本發明涉及一種鹽藻中鈉磷共轉運通道1；2基因、其編碼蛋白及其克隆方法。該基因具有SEQ NO 1所示的鹼基序列。本發明通過對鹽藻BAC克隆DNA的「鳥槍」法測序，在連續的鹽藻基因組序列中發現鹽藻鈉磷共轉運通道1基因(DvSPT1)和不同於已知的鹽藻鈉磷共轉運通道1；2基因(DvSPT1；2)。它們可能起源於鹽藻基因組序列的複製，並且在6個不同鹽穩態條件下DvSPT1；2的表達量要大於DvSPT1，它們的表達趨勢也發生了分化。當鹽藻處在極端高鹽濃度條件下(5M NaCl)時，DvSPT1；2可能擔負起主要功能，它增加了鹽藻對於更寬鹽濃度的適應性。而DvSPT1；2響應高鹽或磷「飢餓」脅迫時的誘導表達趨勢與DvSPT1類似，在功能上可能與鹽藻細胞中的無機磷的轉運，促進甘油合成，維持對外界高滲脅迫的適應有關。本發明在研究植物抗鹽機制上具有一定的理論意義。
文檔編號C07K14/415GK101100669SQ200710041200
公開日2008年1月9日 申請日期2007年5月24日 優先權日2007年5月24日
發明者孟祥宗, 宋任濤, 管禎瑋, 許政暟 申請人:上海大學