黃柄鵝膏與共生植物室內共生關係的建立方法

2023-09-17 04:43:45

專利名稱：黃柄鵝膏與共生植物室內共生關係的建立方法
技術領域：
本發明涉及一種黃柄鵝膏與共生植物滇青R室內共生關係的建立方法，屬於生物技術領域，具體地說是屬於植物組織培養及大型真菌菌絲體培養範疇。
背景技術：
鵝膏菌屬—)隸屬於擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、鵝膏菌科 iaceae)，是有毒的大型真菌中較特殊、較有價值的一個世界性廣布大屬。鵝膏菌屬
中的大部份種屬於著名劇毒菌，主要含鵝膏毒素，鵝膏毒素在研發抗菌抗病毒、抗腫瘤、鎮靜麻醉等新藥方面具有潛在應用，因而成為了近年的研究熱點。 鵝膏菌屬絕大部分屬於外生菌根真菌，目前尚不能進行人工栽培，難以開發利用，其子實體的生長發育與共生植物關係密切，因此鵝膏菌和其共生植物的生物學關係的研究，是進一步探討鵝膏菌子實體發生機制的可行途徑。黃柄鵝膏菌(Anianita flavipes Imai)是鵝膏屬中的一個廣布種，在雲南武定獅子山分布較多，主要與殼鬥科的滇青岡、元江栲iCastanopsis orthacantha)等闊葉樹共生，滇青岡{Cyclobalanopsis glaucoides )為殼鬥科(Fagaceae)、青岡屬{Cyclobalanopsis Oerst.)植物,在獅子山闊葉林地上可以收集較多的滇青網種子，因此本發明以滇青R種子及黃柄鵝膏子實體為材料，成功地建立了黃柄鵝膏與滇青R的室內共生關係，為今後共生機理及鵝膏子實體發生的機制研究等提供了技術貯備。

發明內容
本發明的目的在於，在室內或可控條件下建立一種簡單穩定、互利互惠的黃柄鵝膏與滇青岡植物的共生關係。實現本發明的技術方案利用殼鬥科滇青R植物種子，成功得到了無菌苗及盆栽苗，利用黃柄鵝膏子實體誘導了菌絲體，將菌絲體分別接種到無菌苗及盆栽苗根部，室內建立了二者的共生關係，實現本發明的主要步驟如下
(I)黃柄鵝膏菌絲體的誘導及培養野外採摘生長優良、無蟲害、未開傘或未完全開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的成熟子實體；將子實體帶回實驗室，於超淨臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為四，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約O. 08 O. 16cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導培養基(馬鈴薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L、NH4N03 O. 30 O. 40g/L、穀氨酸 O. 28 O. 32 g/L、VB1 O. 10mg/L、麥芽汁 150 ml/L、瓊脂 11. 00g/L，控制 PH 值為
5.4左右)表面，培養溫度為22 23°C，暗培養14 18天，菌塊周圍開始萌發出極少白色菌絲，53 60天，組織塊多處隆起，表面長出團狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；將以上誘導的菌絲轉入培養皿中，用擴大培養基(馬鈴薯100. 00 120. 00g/L、葡萄糖9. 00 12. 00g/L、滇青R腐葉乾粉(過80 100目分樣篩)30. 00 50. 00g/L、生境土乾粉(過80 100目分樣篩)60. 00 80. 00g/L、蛋白腖 3. 00 5. 00 g /UNH4NO3 0. 60 0. 80g/L、6_BAl. 20 I.50mg/L、麥芽汁200 230 ml/L、瓊脂6. 00 8. 00 g/L，控制PH值為5. 4左右)進行擴
大培養；
(2)滇青R無菌苗的培養於雲南武定獅子山闊葉林中採集滇青R種子；將種子放至清水中，洗淨泥沙及汙物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然乾燥，把種皮剔除，挑選子葉中無明顯菌斑的種子；將挑選後的種子放置於75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無菌水清洗3次；將種子放置於O. 1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min，取出種子，用無菌水清洗6 8次；將處理後的種子放置於無菌濾紙上濾幹水分；將種子芽胚朝上接進萌發培養基(MS培養基，無糖，6-BA I. 00 I. 50mg/L，NAA O. 08 O. 10mg/L，瓊脂7.50g/L, pH為6. 80)，每瓶接種I顆，未汙染的褐化種子於21 22°C下暗培養8 10天後生根開始萌發，轉入2000 2500Lux的光照下相同溫度再培養5 8天，長出I. 8 2. 3cm高的小苗時進行菌絲接種(接種方法為將前面培養皿中已擴繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的6個菌絲塊圍繞培養瓶中的無菌小苗按6個方向等距接種，接種瓶苗於22 23°C下培養13 16天，菌絲長滿培養瓶，小苗高3. O 3. 5cm,葉3 5片，總體上接種小苗比未接種小苗，莖杆粗狀、葉色濃綠、葉片多)，建立起黃柄鵝膏菌絲與無菌小苗的共生關係；
(3)滇青R盆栽苗的培養將野外取回的生境土及腐葉在陽光下曝曬2 3天，放置於花盆中；將以上濾紙濾幹水分的消毒種子埋入花盆中，種植深度約3 4cm，澆水至透；每三天澆一次水，若土表過幹隔天澆水；上午9 00以後將花盆置於室外自然光照下，晚上7 00左右將其移至室內保溫；約25 30天種子發芽，待59 63天小苗長至4 5片真葉、高4 6cm時進行接種，接種方法為將前面培養皿中已擴繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將花盆中的土輕輕翻開露出根部，將截取的菌絲塊圍繞根部接種(每苗接種10 15塊)，蓋上泥土及腐葉，置於室外光照較好、空氣清潔處培養，每隔13 15天，接種一次，共接種五次，118 122天，植株高10. O 13. Ocm,葉子9 11片，接種小苗比未接種小苗，植株及根系生長健壯，葉數多，葉子濃綠，抗病性增強，建立起黃柄鵝膏菌絲與盆栽小苗的共生關係。本發明的有益效果是在室內以兩種方式(無菌及盆栽)成功建立了黃柄鵝膏菌與滇青網的共生體系，其特點如下，
(O以滇青R種子，成功獲得了無菌苗及盆栽菌，在可控條件下提供了兩種滇青R植物的人工培養方法；
(2)建立的兩種共生體系，各具特點，相互補充，無菌體系由於生長快，且為純共生體，可以快速方便地研究二者的共生情況，盆栽苗由於自然生長，更接近野外原生境，可以將無菌條件下的一些實驗結果直接用在盆栽苗上模擬或擴大實驗；
(3)提供了菌根真菌與植物實驗條件下共生關係的研究方法，為其它大型真菌與共生植物的研究提供了方法借鑑。
具體實施例方式 以下的實施例子是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。實例一
野外採摘生長優良、無蟲害、未開傘或未完全開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的成熟子 實體；將子實體帶回實驗室，於超淨臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為四，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約O. 08 O. 16cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導培養基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、NH4NO3 O. 30g/L、穀氨酸 O. 32 g/L、Vbi O. 10mg/L、麥芽汁150 ml/L、瓊脂11. 00g/L，控制PH值為5. 4左右)表面，培養溫度為22 23°C，暗培養14天，菌塊周圍開始萌發出極少白色菌絲，60天，組織塊多處隆起，表面長出團狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；將以上誘導的菌絲轉入培養皿中，用擴大培養基(馬鈴薯100. 00g/L、葡萄糖10.00g/L、滇青R腐葉乾粉(過80目分樣篩)30.00g/L、生境土乾粉(過80目分樣篩)70. 00g/L、蛋白腖 3. 00g/L、NH4NO3 0. 80g/L、6_BAl. 50mg/L、麥芽汁 200ml/L、瓊脂 6. 00 g/L，控制PH值為5. 4左右)進行擴大培養；
於雲南武定獅子山闊葉林中採集滇青R種子；將種子放至清水中，洗淨泥沙及汙物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然乾燥，把種皮剔除，挑選子葉中無明顯菌斑的種子；將挑選後的種子放置於75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無菌水清洗3次；將種子放置於0. 1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min，取出種子，用無菌水清洗6 8次；將 處理後的種子放置於無菌濾紙上濾幹水分；將種子芽胚朝上接進萌發培養基(MS培養基，無糖，6-BA I. 50mg/L, NAAO. 10mg/L，瓊脂 7. 50 g/L, pH 為 6. 80)，每瓶接種 I 顆，未汙染的褐化種子於21 22°C下暗培養8天後生根開始萌發，轉入2000 2500Lux的光照下相同溫度再培養5天，長出約2. Ocm高的小苗時進行菌絲接種(接種方法為將前面培養皿中已擴繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的6個菌絲塊圍繞培養瓶中的無菌小苗按6個方向等距接種，接種瓶苗於22 23°C下培養13天，菌絲長滿培養瓶，小苗高約3. Ocm,葉4 5片，總體上接種小苗比未接種小苗，莖杆粗狀、葉色濃綠、葉片多)，建立起黃柄鵝膏菌絲與無菌小苗的共生關係；
將野外取回的生境土及腐葉在陽光下曝曬2天，放置於花盆中；將以上濾紙濾幹水分的消毒種子埋入花盆中，種植深度約3 4cm，澆水至透；每三天澆一次水，若土表過幹隔天澆水；上午9 00以後將花盆置於室外自然光照下，晚上7 :00左右將其移至室內保溫；約25天種子發芽，待60天小苗長至4 5片真葉、高約4cm時進行接種，接種方法為將前面培養皿中已擴繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將花盆中的土輕輕翻開露出根部，將截取的菌絲塊圍繞根部接種(每苗接種10塊)，蓋上泥土及腐葉，置於室外光照較好、空氣清潔處培養，每隔13天，接種一次，共接種五次，118天，植株高約10. 0cm，葉子9 10片，接種小苗比未接種小苗，植株及根系生長健壯，葉數多，葉子濃綠，抗病性增強，建立起黃柄鵝膏菌絲與盆栽小苗的共生關係。實例二
野外採摘生長優良、無蟲害、未開傘或未完全開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的成熟子實體；將子實體帶回實驗室，於超淨臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為四，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約0. 08 0. 16cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導培養基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、NH4NO3 0. 30g/L、穀氨酸 0. 32 g/L、Vbi 0. 10mg/L、麥芽汁150 ml/L、瓊脂11. 00g/L，控制PH值為5. 4左右)表面，培養溫度為22 23°C，暗培養14天，菌塊周圍開始萌發出極少白色菌絲，60天，組織塊多處隆起，表面長出團狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；將以上誘導的菌絲轉入培養皿中，用擴大培養基(馬鈴薯100. 00g/L、葡萄糖10.00g/L、滇青R腐葉乾粉(過80目分樣篩)30. 00g/L、生境土乾粉(過80目分樣篩)70. 00g/L、蛋白腖 3. 00 g /UNH4NO3 0. 80g/L、6_BAl. 50mg/L、麥芽汁200ml/L、瓊脂6. OOg/L，控制PH值為5. 4左右)進行擴大培養；
於雲南武定獅子山闊葉林中採集滇青R種子；將種子放至清水中，洗淨泥沙及汙物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然乾燥，把種皮剔除，挑選子葉中無明顯菌斑的種子；將挑選後的種子放置於75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無菌水清洗3次；將種子放置於0. 1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min，取出種子，用無菌水清洗6 8次；將處理後的種子放置於無菌濾紙上濾幹水分；將種子芽胚朝上接進萌發培養基(MS培養基，無糖，6-BA I. 50mg/L,NAA 0. 10mg/L，瓊脂 7. 50 g/L，pH 為 6. 80)，每瓶接種 I 顆，未汙染的褐化種子於21 22°C下暗培養10天後生根開始萌發，轉入2000 2500Lux的光照下相同溫度再培養8天，長出約I. 8cm高的小苗時進行菌絲接種(接種方法為將前面培養皿中已擴繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的6個菌絲塊圍繞培養瓶中的無菌小苗按6個方向等距接種，接種瓶苗於22 23°C下培養16天，菌絲長滿培養瓶，小苗約高3. 5cm,葉3 4片，總體上接種小苗比未接種小苗，莖杆粗狀、葉色濃綠、葉片多)，建立起黃柄鵝膏菌絲與無菌小苗的共生關係；
將野外取回的生境土及腐葉在陽光下曝曬3天，放置於花盆中；將以上濾紙濾幹水分的消毒種子埋入花盆中，種植深度約3 4cm，澆水至透；每三天澆一次水，若土表過幹隔天澆水；上午9 00以後將花盆置於室外自然光照下，晚上7 :00左右將其移至室內保溫；約30天種子發芽，待63天小苗長至4 5片真葉、高約6cm時進行接種，接種方法為將前面培養皿中已擴繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將花盆中的土輕輕翻開露出根部，將截取的菌絲塊圍繞根部接種(每苗接種15塊)，蓋上泥土及腐葉，置於室外光照較好、空氣清潔處培養，每隔15天，接種一次，共接種五次，122天，植株約高13. 0cm，葉子10 11片，接種小苗比未接種小苗，植株及根系生長健壯，葉數多，葉子濃綠，抗病性增強，建立起黃柄鵝膏菌絲與盆栽小苗的共生關係。實例三
野外採摘生長優良、無蟲害、未開傘或未完全開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的成熟子實體；將子實體帶回實驗室，於超淨臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為四，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約0. 08 0. 16cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導培養基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、NH4NO3 0. 40g/L、穀氨酸 0. 28 g/L、Vbi 0. 10mg/L、麥芽汁150 ml/L、瓊脂11. 00g/L，控制PH值為5. 4左右)表面，培養溫度為22 23°C，暗培養16天，菌塊周圍開始萌發出極少白色菌絲，55天，組織塊多處隆起，表面長出團狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；將以上誘導的菌絲轉入培養皿中，用擴大培養基(馬鈴薯120. 00g/L、葡萄糖10. 00g/L、滇青R腐葉乾粉(過100目分樣篩)50. 00g/L、生境土乾粉(過100目分樣篩)60. 00g/L、蛋白腖 5. 00 g /L、NH4NO3 0. 60g/L、6_BAl. 20mg/L、麥芽汁 230 ml/L、瓊脂 8. 00g/L,控制PH值為5. 4左右)進行擴大培養；
於雲南武定獅子山闊葉林中採集滇青R種子；將種子放至清水中，洗淨泥沙及汙物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然乾燥，把種皮剔除，挑選子葉中無明顯菌斑的種子；將挑選後的種子放置於75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無菌水清洗3次；將種子放置於O. 1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min，取出種子，用無菌水清洗6 8次；將處理後的種子放置於無菌濾紙上濾幹水分；將種子芽胚朝上接進萌發培養基(MS培養基，無糖，6-BA I. 00mg/L, NAA O. 08 mg/L，瓊脂 7. 50 g/L，pH 為 6. 80)，每瓶接種 I 顆，未汙染的褐化種子於21 22°C下暗培養9天後生根開始萌發，轉入2000 2500Lux的光照下相同溫度再培養7天，長出約2. 3cm高的小苗時進行菌絲接種(接種方法為將前面培養皿中已擴繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的6個菌絲塊圍繞培養瓶中的無菌小苗按6個方向等距接種，接種瓶苗於22 23°C下培養15天，菌絲長滿培養瓶，小苗約高3. 3cm,葉3 4片，總體上接種小苗比未接種小苗，莖杆粗狀、葉色濃綠、葉片多)，建立起黃柄鵝膏菌絲與無菌小苗的共生關係；
將野外取回的生境土及腐葉在陽光下曝曬3天，放置於花盆中；將以上濾紙濾幹水分的消毒種子埋入花盆中，種植深度約3 4cm，澆水至透；每三天澆一次水，若土表過幹隔天澆水；上午9 :00以後將花盆置於室外自然光照下，晚上7 :00左右將其移至室內保溫；約27天種子發芽，待59天小苗長至4 5片真葉、高約5cm時進行接種，接種方法為將前面培 養皿中已擴繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將花盆中的土輕輕翻開露出根部，將截取的菌絲塊圍繞根部接種(每苗接種13塊)，蓋上泥土及腐葉，置於室外光照較好、空氣清潔處培養，每隔14天，接種一次，共接種五次，120天，植株約高12. 0cm，葉子9 10片，接種小苗比未接種小苗，植株及根系生長健壯，葉數多，葉子濃綠，抗病性增強，建立起黃柄鵝膏菌絲與盆栽小苗的共生關係。實例四
野外採摘生長優良、無蟲害、未開傘或未完全開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的成熟子實體；將子實體帶回實驗室，於超淨臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為四，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約O. 08 O. 16cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導培養基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、NH4NO3 0. 40g/L、穀氨酸 0. 28 g/L、Vbi 0. 10mg/L、麥芽汁150 ml/L、瓊脂11. 00g/L，控制PH值為5. 4左右)表面，培養溫度為22 23°C，暗培養16天，菌塊周圍開始萌發出極少白色菌絲，55天，組織塊多處隆起，表面長出團狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；將以上誘導的菌絲轉入培養皿中，用擴大培養基(馬鈴薯120. 00g/L、葡萄糖10. 00g/L、滇青R腐葉乾粉(過100目分樣篩)50. 00g/L、生境土乾粉(過100目分樣篩)60. 00g/L、蛋白腖 5. 00 g /L、NH4NO3 0. 60g/L、6_BAl. 20mg/L、麥芽汁 230 ml/L、瓊脂 8. 00g/L,控制PH值為5. 4左右)進行擴大培養；
於雲南武定獅子山闊葉林中採集滇青R種子；將種子放至清水中，洗淨泥沙及汙物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然乾燥，把種皮剔除，挑選子葉中無明顯菌斑的種子；將挑選後的種子放置於75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無菌水清洗3次；將種子放置於0. 1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min，取出種子，用無菌水清洗6 8次；將處理後的種子放置於無菌濾紙上濾幹水分；將種子芽胚朝上接進萌發培養基(MS培養基，無糖，6-BA I. 00mg/L, NAA 0. 08 mg/L，瓊脂 7. 50 g/L，pH 為 6. 80)，每瓶接種 I 顆，未汙染的褐化種子於21 22°C下暗培養8天後生根開始萌發，轉入2000 2500Lux的光照下相同溫度再培養6天，長出約2. Icm高的小苗時進行菌絲接種(接種方法為將前面培養皿中已擴繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的6個菌絲塊圍繞培養瓶中的無菌小苗按6個方向等距接種，接種瓶苗於22 23°C下培養14天，菌絲長滿培養瓶，小苗約高3. Icm,葉4 5片，總體上接種小苗比未接種小苗，莖杆粗狀、葉色濃綠、葉片多)，建立起黃柄鵝膏菌絲與無菌小苗的共生關係；
將野外取回的生境土及腐葉在陽光下曝曬3天，放置於花盆中；將以上濾紙濾幹水分的消毒種子埋入花盆中，種植深度約3 4cm，澆水至透；每三天澆一次水，若土表過幹隔天澆水；上午9 00以後將花盆置於室外自然光照下，晚上7 :00左右將其移至室內保溫；約28天種子發芽，待61天小苗長至4 5片真葉、高約5cm時進行接種，接種方法為將前面培養皿中已擴繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將花盆中的土輕輕翻開露出根部，將截取的菌絲塊圍繞根部接種(每苗接種12塊)，蓋上泥土及腐葉，置於室外光照較好、空氣清潔處培養，每隔15天，接種一次，共接種五次，121天，植株約高11. Ocm，葉子10 11片，接種 小苗比未接種小苗，植株及根系生長健壯，葉數多，葉子濃綠，抗病性增強，建立起黃柄鵝膏菌絲與盆栽小苗的共生關係。
權利要求
1.一種黃柄鵝膏與共生植物滇青R室內共生關係的建立方法，其特徵為，利用黃柄鵝毫(Jinanita fIavipes)子實體誘導菌絲體,對菌絲體進行擴繁；利用野外採集的滇青岡(Cyclobalanopsis glaucoides )種子培養無菌苗及盆栽苗,將已擴繁的菌絲體分別接種到無菌苗及盆栽苗根部，室內建立共生關係，主要包括下列步驟 (1)黃柄鵝膏菌絲體的誘導及培養野外採摘生長優良、無蟲害、未開傘或未完全開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的成熟子實體；將子實體帶回實驗室，於超淨臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為四，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約O. 08 O. 16cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導培養基表面，培養溫度為22 23°C,暗培養14 18天,菌塊周圍開始萌發出極少白色菌絲，53 60天，組織塊多處隆起，表面長出團狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；將以上誘導的菌絲轉入培養皿中，用擴大培養基進行擴大培養； (2)滇青R無菌苗的培養於雲南武定獅子山闊葉林中採集滇青R種子；將種子放至清水中，洗淨泥沙及汙物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然乾燥，把種皮剔除，挑選子葉中無明顯菌斑的種子；將挑選後的種子放置於75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無菌水清洗3次；將種子放置於O. 1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min，取出種子，用無菌水清洗6 8次；將處理後的種子放置於無菌濾紙上濾幹水分；將種子芽胚朝上接進萌發培養基，每瓶接種I顆，未汙染的褐化種子於21 22°C下暗培養8 10天後生根開始萌發，轉入2000 2500Lux的光照下相同溫度再培養5 8天，長出I. 8 2. 3cm高的小苗時進行菌絲接種； (3)滇青R盆栽苗的培養將野外取回的生境土及腐葉在陽光下曝曬2 3天，放置於花盆中；將以上濾紙濾幹水分的消毒種子埋入花盆中，種植深度約3 4cm，澆水至透；每三天澆一次水，若土表過幹隔天澆水；上午9 00以後將花盆置於室外自然光照下，晚上7 00左右將其移至室內保溫；約25 30天種子發芽，待59 63天小苗長至4 5片真葉、高4 6cm時進行接種。
2.根據權利要求I所述的黃柄鵝膏與共生植物滇青R室內共生關係的建立方法，其特徵在於步驟(I)中的誘導培養基為馬鈴薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L、NH4NO3 O. 30 0.40g/L、穀氨酸 O. 28 O. 32 g/L、Vbi O. 10mg/L、麥芽汁 150 ml/L、瓊脂 11. 00g/L，控制PH值為5. 4左右；擴大培養基為馬鈴薯100. 00 120. 00g/L、葡萄糖9. 00 12. 00g/L、滇青R腐葉乾粉(過80 100目分樣篩)30. 00 50. 00g/L、生境土乾粉(過80 100目分樣篩)60. 00 80. 00g/L、蛋白腖 3. 00 5. 00 g /UNH4NO3 0. 60 0. 80g/L、6_BAl. 20 1.50mg/L、麥芽汁200 230 ml/L、瓊脂6. 00 8. 00 g/L，控制PH值為5. 4左右。
3.根據權利要求I所述的黃柄鵝膏與共生植物滇青R室內共生關係的建立方法，其特徵在於步驟(2)中的滇青岡種子萌發培養基為MS培養基，無糖，6-BA I. 00 I. 50mg/L,NAA 0. 08 0. 10mg/L,瓊脂 7. 50 g/L, pH 為 6· 80。
4.根據權利要求I所述的黃柄鵝膏與共生植物滇青R室內共生關係的建立方法，其特徵在於步驟(2)中的菌絲體接種方法為將前面培養皿中擴繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的6個菌絲塊圍繞培養瓶中的無菌小苗按6個方向等距接種，接種瓶苗於22 23°C下培養13 16天，菌絲長滿培養瓶，小苗高3. O 3. 5cm,葉3 5片，總體上接種小苗比未接種小苗，莖杆粗狀、葉色濃綠、葉片多(未接種小苗形成8. O 9. Ocm的高莖杆小苗，莖長葉少)，表明建立了黃柄鵝膏菌絲與無菌小苗的共生關係。
5.根據權利要求I所述的黃柄鵝膏與共生植物滇青R室內共生關係的建立方法，其特徵在於步驟(3)中的菌絲體接種方法為將前面培養皿中擴繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將花盆中的土輕輕翻開露出根部，將截取的菌絲塊圍繞根部接種(每苗接種10 15塊)，蓋上泥土及腐葉，置於室外光照較好、空氣清潔處培養，每隔13 15天，接種一次，共接種五次，118 122天，植株高10. O 13. 0cm，葉子9 11片，接種小苗比未接種小苗，植株及根系生長健壯，葉數多，葉子濃綠，抗病性增強，表明建立了黃柄鵝膏菌絲與盆栽小苗的共生關係。
全文摘要
本發明涉及一種黃柄鵝膏與共生植物滇青岡室內共生關係的建立方法，屬於生物技術領域(植物組織與真菌培養)。鵝膏菌絕大部分屬於外生菌根真菌，目前尚不能進行人工栽培，難以開發利用，其子實體的生長發育與共生植物滇青岡等關係密切。本發明的特徵為，利用黃柄鵝膏(A.flavipes)子實體誘導菌絲體，對菌絲體進行擴繁；利用野外採集的滇青岡(C.glaucoides)種子成功獲得了無菌苗及盆栽苗，並將已擴繁的菌絲體分別接種到無菌苗及盆栽苗根部，接種苗比未接種苗生長健壯，葉數多，葉子濃綠，抗病性增強，創新性地建立了黃柄鵝膏與滇青岡的室內共生關係，為今後共生機理及鵝膏子實體發生的機制研究等提供了技術貯備。
文檔編號A01G7/06GK102715089SQ20121023699
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月10日 優先權日2012年7月10日
發明者何雋, 馮遼遼, 吳鵬, 周文, 張曦予, 李宗菊, 李彪, 趙昱 申請人:雲南大學