紅託鵝膏菌絲體固液交替培養的方法

2023-09-17 04:40:45

紅託鵝膏菌絲體固液交替培養的方法
【專利摘要】本發明涉及一種紅託鵝膏菌絲體固液交替培養的方法，屬於大型真菌培養【技術領域】。其特徵為：將已經誘導並擴繁的菌絲體，採用固液交替培養方法，即固體培養4～6代後，液體培養3～4代，再進行固體培養，菌絲體的生長速度為未經液體培養前的8～10倍，生長明顯加快。本發明通過簡單改變培養方式，即加快了菌絲體的繁殖速度，其操作簡單易實現、效益明顯、生產成本低。鵝膏屬毒素在開發新特效藥如抗腫瘤、抗菌抗病毒、鎮靜或麻醉藥等領域具有潛在地應用，但至今因其資源珍稀、難以人工馴化等瓶頸問題尚難以開發應用。本發明徵對紅託鵝膏菌絲生長非常緩慢等制約純培養的問題進行了重點研究，為菌絲規模化培養及今後人工馴化栽培等提供了條件。
【專利說明】紅託鵝膏菌絲體固液交替培養的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種紅託鵝膏菌絲體固液交替培養的方法，屬於生物【技術領域】，具體地說是屬於有毒大型真菌室內培養範疇。
【背景技術】
[0002]鵝膏菌屬—)隸屬於擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、鵝膏菌科 iaceae)，是有毒的大型真菌中較特殊、較有價值的一個世界性廣布大屬,其物種多
樣性是非常豐富的。全球已報導近400種，中國已記錄的近100種(含亞種、變種及變型)。據考證，目前中國仍有不少種尚未研究和命名。但是如今隨著全球生態危機的出現，我國的許多大型真菌資源已告危，處於嚴重衰退及瀕危狀態，而部份種面臨著可能還沒有被人類認識或發現其價值時，就已滅絕的風險。[0003]鵝膏菌屬中的大部份種屬於著名劇毒菌，據知，因誤食野生蕈菌中毒死亡者95%是因鵝膏菌所致。科學家們對鵝膏菌真正感興趣的是其毒性，因此，大約在140年前，人們就開始了鵝膏菌毒素的研究。鵝膏毒素的應用研究主要體現在以下幾方面:①可用於研究真核生物基因的表達、調控及細胞定位；②可開發抗菌、抗病毒特效新藥可篩選抗腫瘤藥物；④可開發鎮靜、麻醉及其它特效藥可用於生物防冶等。
[0004]目前導致鵝膏難以開發及可持續性利用的主要瓶頸問題有:①鵝膏資源珍稀，其種群小，個體少，產量低，分布數量極其有限，加之對生境敏感，一旦生境受到破壞，極易消失或滅絕，屬於特殊的致危生物類群，這增加了其進一步被研究、利用的難度；②鵝膏菌屬，大多屬於外生菌根真菌，其絕大部份種仍屬於自然界中難培養或未能培養的微生物，難以人工、半人工栽培。因此，至今國內外還沒有一種能規模化開發的毒素產品，現作為生化試劑的肽類毒素依然價格昂貴(10多年前每克在10萬美元左右一陳作紅等，1999)，難以滿足科研和應用所需。
[0005]鵝膏的純培養是保證鵝膏資源可持續性利用的前提或關鍵，但此目前仍然屬於難以攻克的問題，存在許多盲點，其中菌絲難以誘導、菌絲生長非常緩慢是制約及影響純培養的重要環節或因素。
[0006]紅託鵝毫(A.rubrovolvata S.1mai ),屬於鵝膏亞屬(Amanita subgen.Amanita)鵝膏組(sect.Amanita),其種群分布較少，目前已成功分離到了該種的菌絲,但菌絲的生長前期仍然很慢，難以擴繁，本發明徵對這個問題，改變培養方法，大大提高了菌絲的生長速度，為鵝膏毒素的可持續性開發利用等奠定了重要基礎。

【發明內容】

[0007]本發明的目的在於，提供一種生產成本低、易實現，能使鵝膏菌絲快速生長的培養方法。
[0008]本發明的技術任務是，採用固液交替培養方法，以加快菌絲體的繁殖速度，其所述特徵如下:將已經誘導並擴繁的菌絲體，固體培養4~6代後，液體培養3~4代，再進行固體培養2~3代，即採用固體一液體一固體的培養方法；
所述的紅託鵝膏菌絲體的誘導及擴繁方法如下:野外採摘生長健狀、未開傘的幼嫩子實體；取菌蓋與菌柄交接處的內部無菌組織塊約0.3cm2大小，輕輕嵌入誘導培養基，所述的培養基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖13~15g/L、酵母膏1.20~1.40g/L、MgS04l.00g/L、CaCl2 1.0Og /UKH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麥芽汁 120 ~140ml、瓊脂 10.00g/L，控制培養基PH值為5.8~6.0，在22~23°C下暗培養46~55天，組織塊表面長出絨毛狀白色菌絲；將菌絲在上述誘導培養基中繼代擴繁2~3次；
所述的固體培養方法如下:將菌絲體轉入含固體培養基的直徑為9cm培養皿中，在22~23°C下暗培養70~80天，待菌絲長至3.5~4.5cm時，轉接，培養3~6代；所述的固體培養基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖15~18g/L、酵母膏1.20~1.40g/L,ZnSO40.40~0.60 g/L、MgSO40.40 ~0.60g/L、玉米素 ZT 1.00 ~1.20mg/L、複合生境物質 90 ~100g/L、瓊脂10.00g/L，控制培養基PH值為5.8~6.0 ;
所述的固體培養基中的複合生境物質的製備方法如下:在紅託鵝膏生長地，取生長土、共生的滇青R樹根、滇青R落葉，帶回實驗室，烘乾，用高速粉碎機分別粉碎，按土:根:葉=1: I: I的比例混合；
所述的液體培養方法如下:取培養皿中經固體培養3~6代的菌絲體，用直徑為6_的無菌打孔器，無菌條件下切取菌片，剔除上面的培養基，轉入含100ml液體培養基的250ml三角瓶中，每瓶接種4塊，置於轉速為150r/min、溫度為25°C的搖床上培養，20天後，待菌絲長成分散的刺突狀的細小菌球時，取IOml所培養的菌液移入新配的培養基中進行繼代，20~25天，待小菌球逐漸變大，呈絮狀的團塊時，即可繼代或轉回固體培養基中；其所述的液體培養基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖15~18g/L、酵母膏1.20~1.40g/L、ZnSO40.40 ~0.60g/L、MgSO40.40 ~0.60g/L、ZTl.00 ~1.20mg/L、複合生境物質水提液400~500ml，控制培養基PH值為5.8~6.0 ;
所述的複合生境物質水提液的製備方法如下:取以上複合生境物質200g，加入1000ml蒸餾水浸泡1天後，加熱煮沸I~2hr，過濾，濾液加熱濃縮成400~500ml ；
所述的經過液體培養3~4代的絮狀菌絲球，再按以上進行固體培養2~3代，菌絲生長速度為未經液體培養前的8~10倍，生長明顯加快。
[0009]本發明的有益效果是:簡單改變培養方式，即可以大大加快菌絲體的繁殖速度，其特點如下:
(1)操作簡單易實現:通過固體一液體一固體的交替培養方法，即可明顯提高菌絲體的生長速度；
(2)效益明顯:經過液體培養，再轉入固體培養，菌絲生長速度為未經液體培養前的8~10倍，生長明顯加快；
(3)生產成本低:本發明採用常規培養方式，只是兩種方式交替進行；培養基結合添加複合生境物質，該材料取自於野外，易得，因此本發明整個培養過程不涉及昂貴的生物或化學藥品，也不需要特殊的設備。
【具體實施方式】
[0010]以下的實施例子是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。[0011]實例一:
野外採摘生長健狀、未開傘的幼嫩子實體；取菌蓋與菌柄交接處的內部無菌組織塊約
0.3cm2大小，輕輕嵌入誘導培養基，所述的培養基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖13g/L、酵母膏 1.20g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.0Og /UKH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麥芽汁 120ml、瓊脂10.00g/L，控制培養基PH值為5.8，在22~23°C下暗培養46天，組織塊表面長出絨毛狀白色菌絲；將菌絲在上述誘導培養基中繼代擴繁3次；
再將菌絲體轉入含固體培養基的直徑為9cm培養皿中，在22~23 °C下暗培養70天，待菌絲長至3.5cm時，轉接，培養4代；所述的固體培養基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖15g/L、酵母膏 1.20g/L,ZnSO40.40 g/L、MgS040.40g/L、玉米素 ZT 1.00mg/L、複合生境物質 90g/L、瓊脂10.00g/L，控制培養基PH值為5.8 ;所述複合生境物質的製備方法如下:在紅託鵝膏生長地，取生長土、共生的滇青R樹根、滇青R落葉，帶回實驗室，烘乾，用高速粉碎機分別粉碎，按土:根:葉=1:1:1的比例混合；
取培養皿中經固體培養3代的菌絲體，用直徑為6mm的無菌打孔器，無菌條件下切取菌片，剔除上面的培養基，轉入含100ml液體培養基的250ml三角瓶中，每瓶接種4塊，置於轉速為150r/min、溫度為25°C的搖床上培養，20天後，待菌絲長成分散的刺突狀的細小菌球時，取IOml所培養的菌液移入新配的培養基中進行繼代，20天，待小菌球逐漸變大，呈絮狀的團塊時，即可繼代或轉回固體培養基中；其所述的液體培養基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖 15g/L、酵母膏 1.20g/L, ZnSO40.40g/L,MgSO40.40g/L、ZTl.00mg/L、複合生境物質水提液400ml，控制培養基PH值為5.8 ;所述複合生境物質水提液的製備方法如下:取以上複合生境物質200g，加入1000ml蒸餾水浸泡I天后，加熱煮沸Ihr，過濾，濾液加熱濃縮成400ml ；
將經過液體培養3代的絮狀菌絲球，再按以上固體培養方法培養2代，菌絲生長速度為未經液體培養前的8倍，生長明顯加快。
[0012]實例二:
野外採摘生長健狀、未開傘的幼嫩子實體；取菌蓋與菌柄交接處的內部無菌組織塊約
0.3cm2大小，輕輕嵌入誘導培養基，所述的培養基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖15g/L、酵母膏 1.40g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g /UKH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麥芽汁 140ml、瓊脂10.00g/L，控制培養基PH值為6.0，在22~23°C下暗培養55天，組織塊表面長出絨毛狀白色菌絲；將菌絲在上述誘導培養基中繼代擴繁2次；
再將菌絲體轉入含固體培養基的直徑為9cm培養皿中，在22~23°C下暗培養80天，待菌絲長至4.5cm時，轉接，培養6代；所述的固體培養基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖18g/L、酵母膏 1.40g/L,ZnSO40.60 g/L,MgS040.60g/L、玉米素 ZTL 20mg/L、複合生境物質 100g/L、瓊脂10.00g/L，控制培養基PH值為6.0 ;所述複合生境物質的製備方法如下:在紅託鵝膏生長地，取生長土、共生的滇青R樹根、滇青R落葉，帶回實驗室，烘乾，用高速粉碎機分別粉碎，按土:根:葉=1:1:1的比例混合；
取培養皿中經固體培養6代的菌絲體，用直徑為6mm的無菌打孔器，無菌條件下切取菌片，剔除上面的培養基，轉入含100ml液體培養基的250ml三角瓶中，每瓶接種4塊，置於轉速為150r/min、溫度為25°C的搖床上培養，20天後，待菌絲長成分散的刺突狀的細小菌球時，取IOml所培養的菌液移入新配的培養基中進行繼代，25天，待小菌球逐漸變大，呈絮狀的團塊時，即可繼代或轉回固體培養基中；其所述的液體培養基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖 18g/L、酵母膏 1.40g/L,ZnSO40.60g/L,MgSO40.60g/L、ZTl.20mg/L、複合生境物質水提液500ml，控制培養基PH值為6.0 ;所述複合生境物質水提液的製備方法如下:取以上複合生境物質200g，加入1000ml蒸餾水浸泡I天后，加熱煮沸2hr，過濾，濾液加熱濃縮成500ml ；
將經過液體培養4代的絮狀菌絲球，再按以上固體培養方法培養3代，菌絲生長速度為未經液體培養前的10倍，生長明顯加快。
[0013]實例三:
野外採摘生長健狀、未開傘的幼嫩子實體；取菌蓋與菌柄交接處的內部無菌組織塊約0.3cm2大小，輕輕嵌入誘導培養基，所述的培養基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖14g/L、酵母膏 1.30g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.0Og /UKH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麥芽汁 130ml、瓊脂10.00g/L，控制培養基PH值為5.8，在22~23°C下暗培養50天，組織塊表面長出絨毛狀白色菌絲；將菌絲在上述誘導培養基中繼代擴繁3次；
再將菌絲體轉入含固體培養基的直徑為9cm培養皿中，在22~23 °C下暗培養75天，待菌絲長至4.0cm時，轉接，培養5代；所述的固體培養基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖17g/L、酵母膏 1.30g/L,ZnSO40.50 g/L、MgS040.50g/L、玉米素 ZT 1.10mg/L、複合生境物質 97g/L、瓊脂10.00g/L，控制培養基PH值為5.8 ;所述複合生境物質的製備方法如下:在紅託鵝膏生長地，取生長土、共生的滇青R樹根、滇青R落葉，帶回實驗室，烘乾，用高速粉碎機分別粉碎，按土:根:葉=1:1:1的比例混合；
取培養皿中經固體培養5代的菌絲體，用直徑為6mm的無菌打孔器，無菌條件下切取菌片，剔除上面的培養基，轉入含100ml液體培養基的250ml三角瓶中，每瓶接種4塊，置於轉速為150r/min、溫度為25°C的搖床上培養，20天後，待菌絲長成分散的刺突狀的細小菌球時，取IOml所培養的菌液移入新配的培養基中進行繼代，23天，待小菌球逐漸變大，呈絮狀的團塊時，即可繼代或轉回固體培養基中；其所述的液體培養基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖 17g/L、酵母膏 1.30g/L, ZnSO40.50g/L,MgSO40.50g/L、ZTl.15mg/L、複合生境物質水提液450ml，控制培養基PH值為5.8 ;所述複合生境物質水提液的製備方法如下:取以上複合生境物質200g，加入1000ml蒸餾水浸泡I天后，加熱煮沸1.5hr，過濾，濾液加熱濃縮成450ml ；
將經過液體培養3代的絮狀菌絲球，再按以上固體培養方法培養3代，菌絲生長速度為未經液體培養前的9倍，生長明顯加快。
[0014]實例四:
野外採摘生長健狀、未開傘的幼嫩子實體；取菌蓋與菌柄交接處的內部無菌組織塊約
0.3cm2大小，輕輕嵌入誘導培養基，所述的培養基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖13g/L、酵母膏 1.30g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g /UKH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麥芽汁 135ml、瓊脂10.00g/L，控制培養基PH值為6.0，在22~23°C下暗培養53天，組織塊表面長出絨毛狀白色菌絲；將菌絲在上述誘導培養基中繼代擴繁2次；
再將菌絲體轉入含固體培養基的直徑為9cm培養皿中，在22~23 °C下暗培養73天，待菌絲長至3.8cm時，轉接，培養3代；所述的固體培養基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖16g/L、酵母膏 1.25g/L、ZnSO40.55 g/L、MgSO40.55g/L、玉米素 ZTL 15mg/L、複合生境物質 94g/L、瓊脂10.00g/L，控制培養基PH值為6.0 ;所述複合生境物質的製備方法如下:在紅託鵝膏生長地，取生長土、共生的滇青R樹根、滇青R落葉，帶回實驗室，烘乾，用高速粉碎機分別粉碎，按土:根:葉=1:1:1的比例混合；
取培養皿中經固體培養4代的菌絲體，用直徑為6mm的無菌打孔器，無菌條件下切取菌片，剔除上面的培養基，轉入含100ml液體培養基的250ml三角瓶中，每瓶接種4塊，置於轉速為150r/min、溫度為25°C的搖床上培養，20天後，待菌絲長成分散的刺突狀的細小菌球時，取IOml所培養的菌液移入新配的培養基中進行繼代，21天，待小菌球逐漸變大，呈絮狀的團塊時，即可繼代或轉回固體培養基中；其所述的液體培養基成分為:馬鈴薯200g/L、葡萄糖 16g/L、酵母膏 1.30g/L,ZnSO40.55g/L,MgSO40.55g/L、ZTl.10mg/L、複合生境物質水提液430ml，控制培養基PH值為6.0 ;所述複合生境物質水提液的製備方法如下:取以上複合生境物質200g，加入1000ml蒸餾水浸泡I天后，加熱煮沸1.2hr，過濾，濾液加熱濃縮成430ml ；
將經過液體培養4代的絮狀菌絲球，再按以上固體培養方法培養2代，菌絲生長速度為未經液體培養前的8.5倍，生長 明顯加快。
【權利要求】
1.一種紅託鵝膏菌絲體固液交替培養的方法，其特徵為，採用固液交替培養方法，可以大大加快菌絲體的繁殖速度，其所述的培養方法為:將已經誘導並擴繁的菌絲體，固體培養4~6代後，液體培養3~4代，再進行固體培養2~3代，即採用固體一液體一固體的培養方法。
2.根據權利要求1所述的紅託鵝膏菌絲體固液交替培養的方法，其特徵在於，紅託鵝膏菌絲體的誘導及擴繁方法如下:野外採摘生長健狀、未開傘的幼嫩子實體；取菌蓋與菌柄交接處的內部無菌組織塊約0.3cm2大小，輕輕嵌入誘導培養基，所述的培養基成分為:馬鈴薯 200g/L、葡萄糖 13 ~15g/L、酵母膏 1.20 ~1.40g/L,MgSO4L 00g/L,CaCl2 1.0Og /L、KH2PO4 0.50g/L、16.0波美的麥芽汁120~140ml、瓊脂10.00g/L，控制培養基PH值為5.8~6.0，在22~23°C下暗培養46~55天，組織塊表面長出絨毛狀白色菌絲；將菌絲在上述誘導培養基中繼代擴繁2~3次。
3.根據權利要求1所述的紅託鵝膏菌絲體固液交替培養的方法，其特徵在於，固體培養方法如下:將菌絲體轉入含固體培養基的直徑為9cm培養皿中，在22~23°C下暗培養70~80天，待菌絲長至3.5~4.5cm時，轉接，培養3~6代；所述的固體培養基成分為:馬鈴薯 200g/L、葡萄糖 15 ~18g/L、酵母膏 1.20 ~1.40g/L、ZnSO40.40 ~0.60 g/L、MgSO40.40 ~0.60g/L、玉米素 ZT 1.00 ~1.20mg/L、複合生境物質 90 ~100g/L、瓊脂10.00g/L，控制培養基PH值為5.8~6.0。
4.根據權利要求3所述的固體培養方法，其特徵在於，所述的固體培養基中的複合生境物質的製備方法如下:在紅託鵝膏生長地，取生長土、共生的滇青R樹根、滇青R落葉，帶回實驗室，烘乾，用高速粉碎機分別粉碎，按土:根=Bf=I:1:1的比例混合。
5.根據權利要求1所述的紅託鵝膏菌絲體固液交替培養的方法，其特徵在於，液體培養方法如下:取培養皿中經固體培養3~6代的菌絲體，用直徑為6_的無菌打孔器，無菌條件下切取菌片，剔除上面的培養基，`轉入含100ml液體培養基的250ml三角瓶中，每瓶接種4塊，置於轉速為150r/min、溫度為25°C的搖床上培養，20天後，待菌絲長成分散的刺突狀的細小菌球時，取IOml所培養的菌液移入新配的培養基中進行繼代，20~25天，待小菌球逐漸變大，呈絮狀的團塊時，即可繼代或轉回固體培養基中；其所述的液體培養基成分為:馬鈴薯 200g/L、葡萄糖 15 ~18g/L、酵母膏 1.20 ~1.40g/L、ZnSO40.40 ~0.60g/L、MgSO40.40~0.60g/L、ZTl.00~1.20mg/L、複合生境物質水提液400~500ml，控制培養基PH值為5.8~6.0。
6.根據權利要求5所述的液體培養方法，其特徵在於，複合生境物質水提液的製備方法如下:取權利要求4中的複合生境物質200g，加入1000ml蒸餾水浸泡I天后，加熱煮沸I~2hr,過濾,濾液加熱濃縮成400~500ml。
7.根據權利要求5所述的液體培養，其特徵在於，經過液體培養3~4代的絮狀菌絲球，再按權利要求3進行固體培養2~3代，菌絲生長速度為未經液體培養前的8~10倍，生長明顯加快。
【文檔編號】C05G3/00GK103688753SQ201310702241
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月19日 優先權日:2013年12月19日
【發明者】李宗菊, 李彪, 張曦予, 馮遼遼, 趙昱, 左奎 申請人:雲南大學