克倫特羅液相晶片探針的製備方法

2023-09-21 20:44:05

專利名稱：克倫特羅液相晶片探針的製備方法
技術領域：
本發明涉及免疫化學技術領域的一種克倫特羅檢測試劑的製備方法，尤其涉及一 種克倫特羅液相晶片探針的製備方法。
背景技術：
克倫特羅(Clenbuterol，CL)是一種合成的β 2_受體激素，添加於飼料中後能提 高几種家畜包括豬的瘦肉率，其作用機理在於，克倫特羅在家畜和人體內吸收好，豬食用後 在代謝過程中促進蛋白質合成，加速脂肪的轉化和分解，提高了豬肉的瘦肉率，因此稱為瘦 肉精。與其它β-興奮劑相比，它的生物利用度高，以至食用了含有克倫特羅的豬肉出現中 毒。人食用豬肝或豬肺足夠引起中毒。世界沒有任何正規機構批准克倫特羅作為飼料添加 劑用於動物促生長，我國於2002年開始禁止克倫特羅作為飼料添加劑用於動物促生長。對 於動物食品中克倫特羅的殘留，國內外多以色譜_質譜聯用法、酶聯免疫法為主，色譜-質 譜聯用法檢測靈敏度高，但是對實驗室儀器和人員要求高，檢測方法複雜，檢測通量較低， 成本較高，實際中難以滿足大量樣本的檢測需求。酶聯免疫法檢測成本較低，但是一般檢測 藥物種類單一，檢測線性範圍窄。液相晶片技術是美國Luminex公司開發的一種多功能的分析平臺。它將流式檢測 與晶片技術有機地結合在一起，在保持高通量檢測的同時，將反應體系由液相-固相反應 改變為液相反應體系，對於確保高級結構之上的蛋白質相互作用尤為關鍵。液相晶片技術 的載體是聚苯乙烯所製作的微珠，包覆不同比例的紅光及紅外光發色劑，可產生100種不 同比例顏色的微珠，每一種用於標記探針的微珠都帶有一個獨特的色彩編號。每一種微球 採用不同探針標記，並將標記探針的微珠與待測物在液相中反應，反應產物通過液相晶片 的檢測通道，每次僅允許一個微球通過檢測通信道，通過兩種雷射檢激發測，紅色雷射可定 位微球的編碼地址，綠色雷射則激發待測樣本的報告分子(R-澡紅蛋白)實現樣本目標物 的定量分析。液相晶片的檢測模式可以實現檢測目標物的多樣性，對樣品利用率高，檢測速 度快，可根據實際檢測對象的需要對不同種類的探針進行組合，靈活性大。近年來，在液相晶片系統中實現了對小分子藥物的檢測。小分子藥物液相晶片探 針的製備工藝常見的方法為首先製備小分子半抗原與載體蛋白的偶聯物，然後將這種偶 聯物與羧基化的螢光微球反應，從而得到該小分子的液相晶片探針。這種工藝採用載體蛋 白為連接臂，由於載體蛋白與小分子偶聯反應以及偶聯物與微球的反應重複性較差，限制 了其實際中的應用推廣。

發明內容
本發明的目的在於提出一種克倫特羅液相晶片探針的製備方法，其採用在液相芯 片用的螢光微球表面標記克倫特羅分子的方式，構建出一種可特異性識別克倫特羅抗體的 新型免疫分析固相界面，其可進一步開發應用於克倫特羅的液相晶片模式檢測，從而克服 了現有技術的不足。
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為實現上述發明目的，本發明採用了如下技術方案—種克倫特羅液相晶片探針的製備方法，其特徵在於，該方法為(1)取羧基化聚苯乙烯螢光微球均勻分散於pH值為6. 0 7. 0，含0. 05M 0. 2M 的磷酸鹽緩衝溶液中，經超聲處理後，再加入過量新鮮配置的50mg/ml氮羥基琥珀醯亞胺 磺酸鹽和50mg/ml水溶性碳二亞胺水溶液，在室溫下暗處震蕩孵育15 60min，而後離心移 去上清，加入過量0.01 0. 的對-氨基苯甲酸、間-氨基苯甲酸或鄰-氨基苯甲酸溶 液，室溫下暗處孵育15 30min後，再次離心移去上清，以pH值為7. 2 8. 0，含0. 05M 0. 2M的磷酸鹽緩衝溶液洗滌沉澱物，製得初次活化後的螢光微球；(2)將上述初次活化後的螢光微球加入過量新鮮配製的含50mg/ml氮羥基琥珀 醯亞胺磺酸鹽和50mg/ml水溶性碳二亞胺的水溶液中，均勻混合後，室溫下暗處震蕩孵育 15 30min，完成對螢光微球的再次活化，其後加入過量的含0. 01 1 μ g/mL克倫特羅的 磷酸鹽緩衝溶液，室溫下暗處震蕩孵育1 2h，其後離心移去上清，以pH值為7. 2 8. 0， 含0. 05M 0. 2M的磷酸鹽緩衝溶液洗滌沉澱物，製得目標產物克倫特羅液相晶片探針。進一步地講，步驟(1)中，所述羧基化聚苯乙烯螢光微球是經水洗處理後，再被分 散於PH值為6. 0 7. 0、濃度為0. 05M 0. 2M的磷酸鹽緩衝溶液中的。步驟(1)中，所述超聲處理的時間為1 5min，超聲頻率為20KHz。所述克倫特羅液相晶片探針是被懸浮於貯存液中保藏的，所述貯存液為pH值為 7. 2 8. 0，濃度為0. 05M 0. 2M的磷酸鹽緩衝溶液(PBS)，其含0. 1 1. Owt %牛血清白 蛋白、0.01 0. 05wt%吐溫-20和0. Iwt %疊氮鈉。所述磷酸緩衝鹽溶液採用含0. 8% WtNaCl的磷酸鹽緩衝液。該方法具體為(1)取羧基化聚苯乙烯螢光微球，經過水洗，離心並去除上清液後，加入pH為 6. 0 7. 0，含0. 05M 0. 2M的磷酸鹽緩衝溶液中，漩渦混合lmin，令該磷酸鹽緩衝溶液 中所含螢光微球的濃度為5X IO3 2. 5X IO4個/ μ L，然後超聲1 5min，再加入過量新 鮮配置的50mg/ml氮羥基琥珀醯亞胺磺酸鹽和50mg/ml水溶性碳二亞胺水溶液，漩渦混合 IOs後，室溫下暗處震蕩孵育30 60min，而後離心移去上清，加入過量0. 01 0. Iwt %的 對-氨基苯甲酸、間-氨基苯甲酸或鄰-氨基苯甲酸溶液，室溫下暗處孵育15 30min後， 離心移去上清，以pH值為7. 2 8. 0、濃度為0. 05M 0. 2M的磷酸鹽緩衝溶液中洗滌沉澱 物兩次，製得初次活化後的螢光微球；(2)將初次活化後的螢光微球加入過量含50mg/ml氮羥基琥珀醯亞胺磺酸鹽 和50mg/ml水溶性碳二亞胺的水溶液中，漩渦混合IOs後，於室溫下暗處震蕩孵育15 30min，完成對螢光微球的二次活化處理，而後向上述水溶液中加入過量的含0. 01 1 μ g/ mL克倫特羅的磷酸鹽緩衝溶液形成混合反應體系，將該混合反應體系於室溫下暗處震蕩孵 育1 2h後，離心移去上清，沉澱經以pH值為7. 2 8. 0、濃度為0. 05M 0. 2M的磷酸鹽 緩衝溶液洗滌兩次，即製得目標產物克倫特羅液相晶片探針，該目標產物懸浮於貯存液中 保存，所述貯存液採用pH值為7. 2 8. 0，濃度為0. 05M 0. 2M的磷酸緩衝鹽溶液，其含 0. 1 1. 血清白蛋白、0. 01 0. 05wt%吐溫-20和0. 05 0. 2界1%疊氮鈉。本發明採用兩步法在螢光微球表面標記克倫特羅，第一步採用水溶性碳化二亞胺 法將微球表面的羧基與連接臂(對位、間位或鄰位的氨基苯甲酸)的氨基偶聯，第二步再同法將連接臂的羧基與克倫特羅分子的氨基偶聯，每一步反應都是定向的，微球表面標記探 針的量可以通過調節克倫特羅分子的濃度實現控制和重複。與現有技術相比，本發明的有益效果在於該克倫特羅液相晶片探針的製備方法 簡便操作，可控性強，重複性好，穩定性好，產率高，純度高，且產物具有優良的克倫特羅靶 向性，可為克倫特羅的液相晶片測試技術開發提供了更為方便的途徑。
以下結合附圖及具體實施例對本發明的內容作進一步說明。

圖1是實施例1中克倫特羅液相晶片探針對克倫特羅零標準溶液的抑制反應曲 線.
一入 ，圖2是實施例2中克倫特羅液相晶片探針對克倫特羅零標準溶液的抑制反應曲 線。
具體實施例方式實施例1該克倫特羅液相晶片探針的製備方法原理如下式所示
權利要求
一種克倫特羅液相晶片探針的製備方法，其特徵在於，該方法為(1)取羧基化聚苯乙烯螢光微球均勻分散於pH值為6.0～7.0，含0.05M～0.2M的磷酸鹽緩衝溶液中，經超聲處理後，再加入過量新鮮配置的50mg/ml氮羥基琥珀醯亞胺磺酸鹽和50mg/ml水溶性碳二亞胺水溶液，在室溫下暗處震蕩孵育15～60min，而後離心移去上清，加入過量0.01wt％～0.1wt％的對 氨基苯甲酸、間 氨基苯甲酸或鄰 氨基苯甲酸溶液，室溫下暗處孵育15～30min後，再次離心移去上清，以pH值為7.2～8.0，濃度為0.05M～0.2M的磷酸鹽緩衝溶液洗滌沉澱物，製得初次活化後的螢光微球；(2)將上述初次活化後的螢光微球加入過量新鮮配製的含50mg/ml氮羥基琥珀醯亞胺磺酸鹽和50mg/ml水溶性碳二亞胺的水溶液中，均勻混合後，室溫下暗處震蕩孵育15～30min，完成對螢光微球的再次活化，其後加入過量的含0.01～1μg/mL克倫特羅的磷酸鹽緩衝溶液，室溫下暗處震蕩孵育1～2h，其後離心移去上清，以pH值為7.2～8.0，濃度為0.05M～0.2M的磷酸鹽緩衝溶液洗滌沉澱物，製得目標產物克倫特羅液相晶片探針。
2.根據權利要求1所述的克倫特羅液相晶片探針的製備方法，其特徵在於步驟(1) 中，所述羧基化聚苯乙烯螢光微球是經水洗處理後，再被分散於PH值為6. 0 7. 0、濃度為 0. 05M 0. 2M的磷酸鹽緩衝溶液中的。
3.根據權利要求1所述的克倫特羅液相晶片探針的製備方法，其特徵在於步驟(1) 中，所述超聲處理的時間為1 5min，超聲頻率為20KHz。
4.根據權利要求1所述的克倫特羅液相晶片探針的製備方法，其特徵在於所述克倫 特羅液相晶片探針是被懸浮於貯存液中保藏的，所述貯存液為PH值為7. 2 8. 0，濃度為 0. 05M 0. 2M的磷酸緩衝鹽溶液，其含0. 1 1.血清白蛋白、0. 01 0. 05界1%吐 溫-20和0. Iwt %疊氮鈉。
5.根據權利要求1、2或4所述的克倫特羅液相晶片探針的製備方法，其特徵在於所 述磷酸緩衝鹽溶液採用含0. 8% WtNaCl的磷酸鹽緩衝液。
6.根據權利要求1所述的克倫特羅液相晶片探針的製備方法，其特徵在於該方法具 體為(1)取羧基化聚苯乙烯螢光微球，經過水洗，離心並去除上清液後，加入pH為6.0 7. 0，含0. 05M 0. 2M的磷酸鹽緩衝溶液溶液中，漩渦混合lmin，令該磷酸鹽緩衝溶液中所 含螢光微球的濃度為5 X IO3 2. 5 X IO4個/ μ L，然後超聲1 5min，再加入過量新鮮配置 的50mg/ml氮羥基琥珀醯亞胺磺酸鹽和50mg/ml水溶性碳二亞胺水溶液，漩渦混合IOs後， 室溫下暗處震蕩孵育30 60min，而後離心移去上清，加入過量0. 01 0. Iwt %的對-氨 基苯甲酸、間_氨基苯甲酸或鄰_氨基苯甲酸溶液，室溫下暗處孵育15 30min後，離心移 去上清，以pH值為7. 2 8. 0、濃度為0. 05M 0. 2M的磷酸鹽緩衝溶液中洗滌沉澱物兩次， 製得初次活化後的螢光微球；(2)將初次活化後的螢光微球加入過量含50mg/ml氮羥基琥珀醯亞胺磺酸鹽和50mg/ ml水溶性碳二亞胺的水溶液中，漩渦混合IOs後，於室溫下暗處震蕩孵育15 30min，完成 對螢光微球的二次活化處理，而後向上述水溶液中加入過量的含0. 01 1 μ g/mL克倫特 羅的磷酸鹽緩衝溶液形成混合反應體系，將該混合反應體系於室溫下暗處震蕩孵育1 2h 後，離心移去上清，以pH值為7. 2 8. 0、濃度為0. 05M 0. 2M的磷酸鹽緩衝溶液洗滌沉澱 物兩次，即製得目標產物克倫特羅液相晶片探針，該目標產物懸浮於貯存液中保存，所述貯存液採用PH值為7. 2 8. 0，濃度為0. 05M 0. 2M的磷酸緩衝鹽溶液，其含0. 1 1. Owt % 牛血清白蛋白、0. 01 0. 05wt%吐溫-20和0. 05 0. 2界1%疊氮鈉。
全文摘要
本發明涉及免疫化學技術領域的一種克倫特羅液相晶片探針的製備方法，其通過採用碳化二亞胺法，以對-氨基苯甲酸、間-氨基苯甲酸或鄰-氨基苯甲酸修飾羧基化聚苯乙烯螢光微球表面，再通過碳化二亞胺法將克倫特羅分子標記到螢光微球表面的方式，製成克倫特羅液相晶片探針。該克倫特羅液相晶片探針的製備方法簡便操作，穩定性好，且產物具有優良的克倫特羅靶向性，可為克倫特羅的液相晶片測試技術開發提供了更為方便的途徑。
文檔編號C08F8/30GK101962418SQ20101028136
公開日2011年2月2日 申請日期2010年9月15日 優先權日2010年9月15日
發明者劉麗強, 匡華, 彭池方, 胥傳來, 陳偉 申請人:江南大學