雌激素受體－β配體的製作方法
2023-09-21 13:46:10 1
專利名稱：雌激素受體－β配體的製作方法
技術領域：
本發明涉及一系列配體，更具體地說，涉及雌激素受體-β配體，它們與雌激素相比，對雌激素受體-β的選擇性優於對雌激素受體-α的選擇性，也涉及其生產方法和用於治療與雌激素受體-β有關的疾病、尤其阿爾茨海默病、焦慮症、抑鬱症、骨質疏鬆症、心血管疾病、類風溼關節炎或前列腺癌的用途。
背景雌激素置換治療(「ERT」)降低了阿爾次海默病的發病率，並改善了阿爾茨海默病患者的認識功能(Nikolov等人，Drugs of Today，34(11)，927-933(1998))。ERT也顯示出對骨質疏鬆症和心血管疾病的有益效果，而且可能有抗焦慮和抗抑鬱治療性能。然而，ERT顯示出有害的子宮和乳腺副作用，從而限制了它的使用。
ERT對絕經後婦女的有益效果，與雌激素在做了卵巢切除術的大鼠中對與認識功能、焦慮、抑鬱、骨損、和心血管損害有關的模型的有益效果是相呼應的。雌激素在動物模型中也產生子宮和乳腺肥大，讓人回憶起它對人體中這些組織的促有絲分裂效應。
ERT對絕經後婦女的有益效果，與雌激素在做了卵巢切除術的大鼠中對與認識功能、焦慮、抑鬱、骨損、和心血管損害有關的模型的有益效果是相呼應的，具體地說，實驗研究已經證實，雌激素通過提高膽鹼能機能、增加神經營養酶(neurotrophin)/神經營養酶受體表達、改變澱粉樣前體蛋白加工、提供對多種多樣損害的神經保護、增加穀氨酸能突觸傳輸、及其它效應，對中樞神經系統(「CNS」)產生影響。在臨床前研究中雌激素效應的總體CNS形象，與其在改善認識功能和延緩阿爾茨海默病進展方面的臨床效用是一致的。雌激素在子宮和乳腺組織中也產生促有絲分裂效果，表明它在人體中對這些組織的有害副作用。
人類、大鼠、和小鼠中的雌激素受體(「ER」)存在兩種亞型，即ER-α和ER-β，兩者在配體結合疇中各佔約50％同一性(Kuiper等人，Endocrinology 139(10)4252-4263(1998))。這些亞型的同一性差異解釋了如下事實已經有人證實，一些小化合物對一種亞型的結合優先於對另一種亞型的結合(Kuiper等人)。
在大鼠中，相對於ER-α而言，ER-β強烈地表達於大腦、骨骼和血管上皮中，但微弱地表達於子宮和乳腺中。進而，ER-α失效(ERKO-α)小鼠是不生育的，而且顯示出很少或沒有生殖組織激素反應的證據。ER-β失效(ERKO-β)小鼠是能生育的，而且顯示出乳腺和子宮組織的正常發育和機能。這些觀察表明，選擇性地以ER-β而不是ER-α為目標，可能會給若干重要的人類疾病例如阿爾茨海默病、焦慮症、抑鬱症、骨質疏鬆症、和心血管病帶來有益的效果而不會產生生殖系統副作用。對ER-β表達組織(中樞神經系統、骨骼等)而不對子宮和乳腺的選擇性作用可以通過那些能與ER-β而不與ER-α選擇性相互作用的藥劑來實現。
本發明的目的是確認那些可用於治療ERT對其有治療效益的疾病的ER-β選擇性配體。
本發明的另一個目的是確認那些有類似於ERT對大腦、骨骼和心血管機能的有益作用的ER-β選擇性配體。
本發明的又一個目的是確認那些能提高認識機能和延緩阿爾茨海默病進展的ER-β選擇性配體。
發明概要本發明涉及使用有如下一般結構的化合物 作為類似於ERT但缺少ERT所不希望的副作用的ER-β選擇性配體。這些化合物尤其滿足下式
(KiαA/KiβA)/(KiαE/KiβE)＞1，較好滿足(KiαA/KiβA)/(KiαE/KiβE)＞30，更好滿足(KiαA/KiβA)/(KiαE/KiβE)＞100。式中KiαA是該配體在ER-α中的Ki值；KiβA是該配體在ER-β中的Ki值；KiαE是雌激素在ER-α中的Ki值；而KiβE是雌激素在ER-β中的Ki值。
發明詳細說明本發明涉及一種與雌激素受體-β相聯繫的疾病的治療方法，包含給藥某一治療有效量的一種化合物的步驟，該化合物滿足方程(KiαA/KiβA)/(KiαE/KiβE)＞1，式中KiαA是該激動劑在ER-α中的Ki值；KiβA是該激動劑在ER-β中的Ki值；KiαE是雌激素在ER-α中的Ki值；而KiβE是雌激素在ER-β中的Ki值。較好的是該化合物滿足方程(KiαA/KiβA)/(KiαE/KiβE)＞100。與雌激素受體-β相聯繫的較好疾病選自阿爾茨海默病、焦慮症、抑鬱症、骨質疏鬆症、心血管病、類風溼關節炎和前列腺癌。更好的是，該疾病是阿爾茨海默病或抑鬱症。
本發明的化合物是如下結構的ER-β選擇性配體 在這個結構中，L1是-C(＝O)-、＝C(R6)-、-CH(R6)-、O、S、或NRa，較好的是-C(＝O)-、＝C(R6)-、-CH(R6)-或O；L2是＝C-或-CH-；L3是＝C(R6)-、-CH(R6)-或-C(＝O)-；而L4是-C(＝O)-、CH2、O、S、或NRa，較好的是-C(＝O)-、CH2或O，先決條件是當L1是-C(＝O)-時L4是CH2、O、S或NRa；當L4是-C(＝O)-時L1是CH2、O、S或NRa；且當L3是-C(＝O)-時L1是＝C(R6)-或-CH(R6)-，而L4是O或NRa。此外，當L1是＝C(R6)-時L2是＝C-；當L1是-CH(R6)-時L2是-CH-；當L3是＝C(R6)-時，L2是＝C-；而當L3是-CH(R6)-時，L2是-CH-。＝代表一個單鍵或雙鍵，因L1～L4的雜化而異。L2的結構只顯示三個鍵，因為第四個鍵是一個連接R1的單鍵。
R1是經由一個單鍵連接到L2上的，而且是苯基、有取代苯基、以下定義的Het、或有取代Het。R1較好的是 式中，R7是H、Cl、或甲基；R8是Br、Cl、F、Ra、ORa或烯丙基；R9是H、OH、NH2、Br、Cl；且R10是H或甲基；或者R8與R9可以組合成-OCH2O-，形成該苯基基團外部的一個次級5員環結構；或者R1是一個有如下結構的有取代或無取代雜環取代基 更好的是無取代的
R2、R3、R4、和R5各自獨立地是-Ra、-ORa、-SRa、-NRaRa、-NC(＝O)Ra、-NS(＝O)Ra、-NS(＝O)2Ra、滷素、氰基、-CF3、-CO2Ra、-C(＝O)Ra、-C(＝O)NHRa、硝基、-S(＝O)Ra或-S(＝O)2Ra，較好的是Ra、ORa、NR2a、NC(＝O)Ra、CF3、或滷素，較好的是氫、羥基或甲基。
R6是Ra、苯基或CF3。
Ra每次出現時各自獨立地是H或(C1-C5)烷基。
當L1是-C(＝O)-、且R2是羥基或氫、且R3是氫、且R4是羥基、且R5是氫、且R6是氫時，則R1不是對苯酚。
為了本發明之目的，「有取代」當用來修飾一個苯基或一個雜原子環時係指在一個或多個位置上獨立地有下列基團取代的這樣一個環-Ra、-ORa、-SRa、-NRaRa、-NC(＝O)Ra、-NS(＝O)Ra、-NS(＝O)2Ra、滷素、氰基、-CF3、-CO2Ra、-C(＝O)Ra、-C(＝O)NHRa、硝基、-S(＝O)Ra、或-S(＝O)2Ra。
此外，為了本發明之目的，「Het」係指從下列選擇的一個有取代或無取代的單環或雙環式雜環 式中，交叉的鍵代表該雜環可以連接在它所交叉的那個環上的任何可用位置。
雌激素受體結合測定一種化合物與ER結合的能力，是用它為與放射性標記雌激素〔125I〕-16α-碘-3，17β-雌二醇結合而競爭的能力衡量的(NEN，Cat#NEX-144)。該放射性配體以下稱為〔125I〕-雌二醇。
把ER-β(Gen Bank Accession#X99101)或ER-α(Gen BankAccession #M12674)cDNA克隆成表達載體pSG5(Stratagene)，轉變成大腸桿菌株DHαF，再陰離子交換樹脂柱(Qiagen Cat.#12125)精製。受體蛋白質是用TNT T7快速偶合網狀細胞溶胞產物系統(Promega Cat. #L 1170)進行這些質粒的離體轉錄和轉譯來製備的。網狀細胞溶胞產物(12.5mL)用312.5μg ER-α和625μg ER-β質粒在30℃培養90分鐘。然後，把編程的溶胞產物分成等分部分，於-80℃冷凍貯存。
各化合物以10pM-3μM範圍內的半對數濃度用雙份試樣進行測試。各化合物先製備成1mM的DMSO儲備溶液，然後用結合試驗緩衝劑(以mM表示20 HEPES、150 NaCl、1 EDTA、6-硫代甘油和10 Na2MoO4；10％(重量/體積)甘油，且pH＝7.9)在一個96孔平皿上稀釋成一系列濃度遞差三倍的20mL等分溶液。受體等分樣品在冰上解凍、用結合試驗緩衝劑適當稀釋(見以下)。向每個孔中添加稀釋的受體(每孔30μL)。用結合試驗緩衝劑把〔125I〕-雌二醇從製造商的乙醇儲備溶液稀釋成900 pM工作溶液。最終試驗體積是60μL、包括20μL一種按照本發明的化合物、30μL編程的網狀細胞溶胞產物、和10μL 900pM〔125I〕-雌二醇。〔125I〕-雌二醇的最終濃度是150pM。含有最終試驗混合物的平皿在一臺振蕩機上混合2分鐘，並在4℃培養過夜(～16小時)。
通過在交聯葡聚糖柱上過濾，將受體結合的和未結合的放射性配體分離。各柱(45μL床體積)是通過向96孔柱模板(Millipore MultiSereen Plates Cat#MAHVN 4510)中添加幹柱介質(Pharmacia Cat#G-25)來製備的。然後，各柱用300μL結合試驗緩衝劑飽和，並於4℃貯存。使用之前，貯存的柱以2000rpm旋轉10分鐘，然後用200μL新鮮的結合緩衝劑洗滌兩次。然後，將結合試驗混合物(每份50μL)加到各柱上，並立即向各該柱上加另外35μL的洗脫體積。然後，以2000rpm離心分離10分鐘，從該柱上洗脫受體結合的放射性配體。向洗脫的放射性配體/受體複合物中添加一種閃爍雞尾酒(145μL)，再用液體閃爍計數法測定放射性標記。
非專性結合是通過與150nM二甲基己烯雌酚(DES)競爭來界定的。結合親合性表達為Ki，是利用Cheng-Prushoff公式按照通過使濃度與百分率專性結合(SB)的關係與如下方程擬合產生的IC50值計算的％SB＝最大值-(最大值-最小值)/(1+10(logIC50-log〔化合物〕))在本試驗中，標準雌激素受體配體雌二醇和DES被檢測為ER-β和ER-α的高親合性(Ki＜1nM)非選擇性配體。
要添加到該結合試驗中的受體編程網狀細胞溶胞產物的體積，是從對所製備的每批受體所做的兩次測定獨立地確定的。首先，利用該受體製劑的一系列稀釋，確定各標準化合物的Ki。以這些受體稀釋進行配體結合親合性的Scatchard分析，產生了這些化合物的所報告Ki和可接受的信噪比(～10)。這些實驗指出〔125I〕-雌二醇的KD為0.1～1nM、Bmax為5～30pmol。
給藥和用途本發明的化合物已顯示對ER-β有優於對ER-α的高選擇性，而且可能具有對ER-β的激動劑活性而無所不希望的子宮作用。因此，這些化合物和含有這些化合物的組合物可以作為治療劑用於治療諸如阿爾茨海默病等與ER-β有關的各種中樞神經系統疾病。
本發明也提供包含某一有效量的本發明化合物、包括其無毒的加成鹽、醯胺和酯類的組合物，該組合物可以用來提供以上提到的治療效益。這樣的組合物也可以連同生理上可耐受的液體、凝膠或固體稀釋劑、輔藥和賦形劑一起提供。本發明化合物也與其它已知要用來作為上述或其它指徵的治療劑的化合物組合。
這些化合物和組合物可以由有資格的保健專業人員以類似於其它治療劑的方式對人類給藥，此外，還可以為了獸醫用途而給其它哺乳動物例如家畜給藥。典型地說，這樣的組合物可以製備成注射劑，要麼成為液體溶液劑要麼成為懸浮液劑；還可以製備適合於在注射前溶解或懸浮於液體中的固體劑型。該製劑也可以乳化。該有效成分往往是與生理上可耐受而且與該有效成分兼容的稀釋劑或賦形劑混合。適用的稀釋劑和賦形劑是例如水、食鹽水、葡萄糖、甘油等，及其組合。此外，如果希望，該組合物還可以含有少量輔助物質，例如潤溼劑或乳化劑、穩定劑或pH緩衝劑等。
這些組合物慣常地是以非經腸方式、例如經由皮下注射或經由靜脈內注射的方式給藥。適用於其它給藥方式的另一些配方包括栓劑、鼻內氣霧劑、和在一些情況下的經口配方。對於栓劑來說，傳統的粘結劑和賦形劑可以包括例如聚亞烷基二醇或甘油三酸酯；這樣的栓劑可以從含有該有效成分的混合物形成。經口配方包括諸如通常採用的賦形劑，例如醫藥級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物的劑型為溶液劑、懸浮液劑、片劑、丸劑、膠囊劑、緩釋配方或散劑。
本發明化合物可以配製成中性形式或鹽形式的組合物。醫藥上可接受的無毒鹽包括(與游離氨基基團生成的)和與無機酸例如鹽酸或磷酸、或者有機酸例如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸等生成的酸加成鹽。與游離羧基基團生成的鹽可以從無機鹼例如氫氧化鈉、鉀、銨、鈣、或鐵以及有機鹼例如異丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因等衍生而成。
除了顯示ER-β活性的本發明化合物外，本發明的化合物也可以作為中間體用於合成這樣的有用化合物。
合成本發明範圍內的化合物可以用技術上眾所周知的手段化學合成。以下實施例意在顯示一般合成方案，它們可以用來通過採用各種商業上可得的起始原料而產生很多不同變化。這些實施例僅旨在作為關於如何在本發明範圍內製作一些化合物的指南，而不應當解讀為本發明範圍的限制。
實施例實施例1(路線A)(3-溴-4-羥基苯基)-5，7-二羥基-4H-1-苯並吡喃-4-酮1，3，5-三羥基苯甲醛(1.01g，6.25mmol)和3-溴-4-羥基苯乙酸(1.44g，6.25mmol)懸浮在POCl3(4mL)中。1分鐘後，發生放熱反應。讓混合物冷卻到室溫。添加氯化鋅(1M乙醚溶液，4.7mmol)，混合物在75℃加熱1小時。冷卻後，該混合物分配於乙酸乙酯與1M HCl水溶液中。有機層用食鹽水洗滌、用MgSO4乾燥。在矽膠上精製(MeOH/二氯甲烷，梯度)給出褐色固體狀1-(2，4，6-三羥基苯基)-2-(3-溴-4-羥基苯基)乙酮(390mg)。
在氮氣下向1-(2，4，6-三羥基苯基)-2-(3-溴-4-羥基苯基)乙酮(370mg)的DMF(5mL)溶液中滴加BF3-Et2O(0.83mL，6.55mmol)，隨後添加甲磺醯氯(0.507mL，6.55mmol)。混合物在室溫攪拌10分鐘，在55℃加熱30分鐘。冷卻後，該混合物分配於乙酸乙酯/1M HCl水溶液中。有機層用1M HCl和食鹽水洗滌，用C18HPLC精製，給出標題化合物(55mg)。
實施例2(化合物No.28路線B)3-(4-羥基苯基)-7-羥基-4-甲基香豆素2，4-二羥基乙醯苯(1.1g，7.24mmol)、4-羥基苯乙酸(1.45g，9.5mmol)和乙酸鉀(0.9g，9.2mmol)在乙酸酐(10mL)中的溶液在回流下加熱18小時。冷卻後，將混合物傾入冰水中。將固體濾出、用乙醚洗滌、在真空下乾燥，給出3-(4-乙醯氧基苯基)-7-乙醯氧基-4-甲基香豆素(1.83g)。
3-(4-乙醯氧基苯基)-7-乙醯氧基-4-甲基香豆素(500mg)在THF(10mL)和1N氫氧化鈉水溶液(10mL)中的懸浮液攪拌1小時。混合物用濃HCl酸化到pH＝1，用乙酸乙酯/水萃取。有機層用食鹽水洗滌、用MgSO4乾燥。溶劑蒸發、殘渣用乙醚研製，給出標題化合物(140mg)。
HPLC條件(HPLC 4.6×250mm C185μm Vydax 218TP54柱，流量率1.5mL/分鐘，乙腈/水0.1％TFA在30分鐘內從10∶90到50∶50的線性梯度，UV檢測254nm)稱為條件A。
HPLC條件(HPLC 2.1×30mm C183.5μm Zorbax快速拆分柱，流量率0.7mL/分鐘，水-0.05％TFA 0.5分鐘，然後90％乙腈水溶液/水0.05％TFA在9.5分鐘內從0∶100到80∶20的線性梯度，UV檢測)稱為條件B。
按照這些路線，用有關起始原料，製備了下列化合物。
表1
表1(續)
表2精製、性能、和合成路線
*化合物是商業上可得的。注a)按照方法A製備；環化步驟是用三氟乙酸酐按照J.Med.Chem.1992，35，3519進行的。注b)按照J.Org.Chem，1946，11，34中發展的方法，先用POCl3使對應2，4-二芳基丁酸環化，隨後使甲氧基醚脫甲基化來製備。注c)按照Aust.J.Chem，1978，31，1011製備。
權利要求
1.一種與雌激素受體-β有關的疾病的治療方法，包含給藥某一治療有效量的一種滿足如下方程的化合物的步驟(KiαA/KiβA)/(KiαE/KiβE)＞1，式中KiαA是該激動劑在ER-α中的Ki值；KiβA是該激動劑在ER-β中的Ki值；KiαE是雌激素在ER-α中的Ki值；和KiβE是雌激素在ER-β中的Ki值。
2.按照權利要求1的方法，其中，該化合物滿足如下方程(KiαA/KiβA)/(KiαE/KiβE)＞100。
3.按照權利要求2的方法，其中，要治療的疾病選自下列組成的一組阿爾茨海默病、焦慮症、抑鬱症、骨質疏鬆症、心血管病、類風溼關節炎和前列腺癌。
4.按照權利要求3的方法，其中，該化合物具有下式結構 式中L1是-C(＝O)-、＝C(R6)-、-CH(R6)-、O、S、或NRa；L2是＝C-或-CH-；L3是＝C(R6)-、-CH(R6)-或-C(＝O)-；L4是-C(＝O)-、CH2、O、S、或NRa；式中L1是-C(＝O)-時，L4是CH2、O、S、或NRa；L4是-C(＝O)-時，L1是CH2、O、S、或NRa；L3是-C(＝O)-時，L1是＝C(R6)-或-CH(R6)-，且L4是O或NRa；L1是＝C(R6)-時，L2是＝C-；L1是-CH(R6)-時，L2是-CH-；L3是＝C(R6)-時，L2是＝C-；和L3是-CH(R6)-時，L2是-CH-；Ra每次出現時獨立地是H或(C1-C5)烷基；R1是苯基、有取代苯基或Het；R2、R3、R4和R5獨立地選自下列組成的一組-Ra、-ORa、-SRa、-NRaRa、-NC(＝O)Ra、-NS(＝O)Ra、-NS(＝O)2Ra、滷素、氰基、-CF3、-CO2Ra、-C(＝O)Ra、-C(＝O)NHRa、硝基、-S(＝O)Ra和-S(＝O)2Ra；R6是H、(C1-C5)烷基、苯基或CF3；和式中，當L1是-C(＝O)-、且R2是羥基或氫、且R3是氫、且R4是羥基、且R5是氫、且R6是氫時，則R1不是對苯酚；以及其任何醫藥上可接受的鹽。
5.按照權利要求4的方法，其中，R1是Het。
6.按照權利要求4的方法，其中，R1有如下結構 式中R7是H、Cl或甲基；R8是Br、Cl、F、Ra、ORa或烯丙基；R9是H、OH、NH2、Br或Cl；和R10是H或甲基；或R8和R9組合形成-OCH2O-；或者R1是下列之一的有取代或無取代基團
7.按照權利要求1～6中任何一項的方法，其中，該疾病是阿爾茨海默病或抑鬱症。
8.按照權利要求6的方法，其中，R2、R3、R4和R5獨立地選自由Ra、ORa、NR2a、NC(＝O)Ra、CF3和滷素組成的一組。
9.按照權利要求8的方法，其中R2是羥基或氫；R3是氫或甲基；R4是羥基或氫；和R5是氫或羥基。
10.按照權利要求8的方法，其中L4是-C(＝O)-。
11.按照權利要求8的方法，其中L3是-C(＝O)-。
12.按照權利要求8的方法，其中L1是-C(＝O)-。
13.按照權利要求9的方法，其中R1是下式的無取代基團
全文摘要
一種與雌激素受體－β有關的疾病的治療方法,包含給藥某一治療有效量的一種化合物的步驟,該化合物滿足方程(K
文檔編號A61K31/00GK1358091SQ0080900
公開日2002年7月10日 申請日期2000年4月11日 優先權日1999年4月16日
發明者B·C·巴拉爾姆, T·M·皮塞爾 申請人:阿斯特拉曾尼卡有限公司