一種鏈黴菌及其生產米爾貝黴素A4的方法與流程
2023-09-22 01:06:00
本發明涉及一種新的鏈黴菌、通過發酵培養該菌生產米爾貝黴素A4的方法。
背景技術：
米爾貝黴素是微生物天然產物農藥，已有數據表明它是當今世界上最優良的殺蟎劑之一。美國環保署認定其為低危險性殺蟲劑，荷蘭批准其為「GNO」(作物生產中的天然產物)。它屬生態友好型農藥，適用於有機農業病蟲害的綜合防治，在發達國家已成為一種受歡迎的殺蟲殺蟎劑。
米爾貝黴素是日本三共公司以二斑葉蟎作為試蟲，從微生物的發酵液中篩選出的具有抗蟲活性的代謝產物(US3,950,360)。經過大量基礎研究，1983年米爾貝黴素(milbemycin)A3和A4組分的混合物(A3：A4＝3：7)被用作殺蟎劑，米爾貝黴素A3和A4結構如式I所示。1990年，1％的米爾貝黴素乳油(milbeknock)在日本作為殺蟎劑用於茶葉、茄子。1993年，1％的米爾貝黴素乳油用作梨、桃、西瓜、草莓、茄子、花卉的殺蟲劑也在日本登記。當前，米爾貝黴素已在日本、歐美等多個國家登記，並且作為安全、對環境友好的殺蟲殺蟎劑被美國環保局推薦使用。
日本三共公司是米爾貝黴素的原研廠，其1980年發表的文獻中表明米爾貝黴素A3+A4的含量僅僅只有150mg/L左右(Yo Takiguchi et al,The J.of Antibiotics,1980,OCT,1120-1127)。後經過菌種誘變和發酵條件優化，1990年米爾貝黴素A3+A4的含量達到530mg/L(Koicchi Nonaka et al,Actinomycetol.1990， 13:32-41)。國內米爾貝黴素研發啟動較晚，主要集中在東北農業大學項文勝課題組，目前也取得了較大的突破，如在2011年發表的文獻中米爾貝黴素A3+A4的單位含量最高達到了1595mg/L(Zhang Baoxin et al，African J Biotechnol10(37):7225-7235)，在中國專利CN 103468625 A中米爾貝黴素A3+A4的單位含量提高至2237mg/L。
米爾貝黴素發酵液組分複雜，米爾貝黴素A3，A4為主要成分，另外還含有其他結構類似物。通常情況下米爾貝黴素發酵液中米爾貝黴素A3和A4的比例大約為1:2，因此現有的商業化產品也是A3，A4的混合組分。導致這一結果最主要的原因在於要從A3，A4比例相近的發酵液中單獨分離出A3，A4單組分難度較大，影響最終收率。實現A4的單一組分生產，可進一步推動米爾貝黴素A4單組分在其他領域的應用。而得到單組分最有效的方法是獲得能夠生產單一組分的新菌種，並進一步提高發酵單位。
技術實現要素：
鑑於此，本發明的目的之一在於提供一種能提高米爾貝黴素A4單位產量的微生物菌種，該菌種的特點在於其發酵液中米爾貝黴素A4的含量佔A3和A4總含量的百分比大於80％，且米爾貝黴素A4的單位產量可以達到大於4000ug/ml，米爾貝黴素A3+A4的單位產量可以達到大於5000ug/ml，發酵單位高，雜質含量低。
本發明的鏈黴菌HS7522的微生物菌種於2014年9月16日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區北辰西路1號院，中國科學院微生物研究所)，保藏號為CGMCC NO.9671，分類命名為吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)，並登記入冊，證明存活。
本發明的鏈黴菌HS7522主要生物學特徵為：ISP1上菌落顏色白色，ISP2上菌落卵石灰，ISP3上亮象牙色，圓形，中間稍凸起，多皺，直徑大小為中型(約6mm左右)，除ISP1外，孢子量豐富，基內菌絲髮達，菌絲與培養基結合緊密，不易挑起。在ISP1，ISP2培養基上無色素產生，在ISP3上有土黃灰色色素產生。
本發明描述了鏈黴菌HS7522的形態學和分子水平上的特徵，經過和已知米爾貝黴素生產菌進行形態學和分子水平的比較，可以認定鏈黴菌HS7522屬吸水鏈黴菌。鏈黴菌HS7522與Streptomyces sp.NRRL 5739 16s rRNA同源性99.5％， 與Streptomyces bingchenggensis BCW-1同源性99.9％。本菌株與多數米爾貝生產菌在形態上最大的差異在於其他菌種如Streptomyces sp.CGMCC 7677的菌落在生產平板上會分泌金黃淚珠體於菌落表面。而HS7522在同樣的培養基上顏色鼠灰，表面無淚珠(見附圖1)。
本發明的還提供了一種採用鏈黴菌HS7522(CGMCC NO.9671)製備米爾貝黴素的方法。該方法包括採用鏈黴菌HS7522(CGMCC NO.9671)在含有可同化的碳、氮源的營養培養基裡，進行有氧發酵的過程。
優選的實施方案中，上述可同化的碳源優選自澱粉、糊精、葡萄糖、工業糖蜜、甘油、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、木聚糖、甘露醇、山梨醇之一或上述物質的組合。
優選的實施方案中，上述可同化的氮源優選自酵母抽提物、酵母粉、牛肉浸膏、胰蛋白腖、蛋白腖、脫脂奶粉，全脂奶粉，黃豆餅粉、棉籽餅粉、花生餅粉、麩質粉、玉米漿乾粉、麩皮、尿素、銨鹽之一或上述物質的組合。
優選的實施方案中，所述發酵培養的溫度優選為20℃-40℃，優選25℃-35℃，培養基pH為6.0-8.0，優選7.0左右；培養時間為300-360小時；通氧量為0.5-1.0vvm。
所述發酵方式為液體深層發酵。
米爾貝黴素可以通過以下方法進行檢測：
取發酵液0.5ml，加入4.5ml 75％乙醇，混合均勻，3000rpm、15分鐘離心，取上層液進樣。
HPLC柱：Zorbex RX-C8；150mm*4.6mm；5μm
紫外吸收波長：240nm
溫度控制：攝氏22度
HPLC流動相條件：梯度洗脫
進樣量：10μl
本發明採用的米爾貝黴素產生菌為鏈黴菌HS7522(CGMCC NO.9671)、鏈黴菌HS7522(CGMCC NO.9671)自發的突變株或通過常規的誘變得到的突變株。
本發明的主要優點在於：
1.本發明提供了一種生產米爾貝黴素的新菌鏈黴菌HS7522及其生產米爾貝黴素的方法。本發明鏈黴菌HS7522的特點在於其發酵液中米爾貝黴素A4的含量佔A3和A4總含量的百分比大於80％，且米爾貝黴素A4的單位產量可以達到大於4000ug/ml，米爾貝黴素A3+A4的單位產量可以達到大於5000ug/ml，發酵單位高，雜質含量低。
2.由於本發明所述的鏈黴菌HS7522通過發酵方法提高米爾貝黴素A4在發酵產物中的比例，降低了製備米爾貝黴素A4單一組分的難度，有利於降低生產成本和擴大米爾貝黴素A4單組分的應用範圍。
3.提高了米爾貝黴素A4發酵單位。本發明所述的鏈黴菌HS7522生產米爾貝黴素A4的效價較原始菌Streptomyces milbemycinicus CGMCC NO.7677大幅提高，有利於實現產業化生產。
附圖說明：
圖1：本發明鏈黴菌HS7522菌株的菌落形態與鏈黴菌Streptomyces milbemycinicus NO.CGMCC 7677對比圖，其中B為鏈黴菌Streptomyces milbemycinicus NO.CGMCC 7677菌落形態，A為本發明鏈黴菌HS7522菌落形態。
圖2：本發明鏈黴菌HS7522在實施例6的50L發酵罐中生產米爾貝黴素A3和A4的發酵曲線。
圖3：本發明鏈黴菌HS7522在實施例6條件下產生的米爾貝黴素A4的HPLC圖譜，米爾貝黴素A4含量為4100mg/L，A3含量962mg/L，米爾貝黴素A4的含量佔A3和A4總含量的百分比為81％。
具體實施方式
實施例1：菌株來源
本發明鏈黴菌Streptomyces hygroscopicus HS7522系在米爾貝黴素產生菌種Streptomyces milbemycinicus CGMCC 7677(見中國專利CN103789339A)的基礎上，通過多輪的誘變選育(包括NTG，EMS，UV等誘變手段)得到的米爾貝黴素A4高比例菌種。該菌種與原始菌種相比，其外觀形態發生了較大的變化，屬於形態突變株。
鏈黴菌Streptomyces milbemycinicus CGMCC NO.7677菌株在ISP3斜面培養基中28℃培養10-12天後，在無菌條件下用接種鏟將菌絲體刮下，在磨口試管中磨碎菌絲體並懸浮於無菌水中，製得菌懸液，採用NTG(亞硝基胍)，EMS(甲基磺酸乙酯)，UV(紫外線)誘變處理。
稱取NTG晶體10mg，溶解在10ml無菌Tris緩衝液(pH8.0)中，再用移液管加入1ml菌懸液，置於28℃培養基中旋轉式或往復式搖床上振蕩處理30min。將處理過的菌懸液經適當稀釋塗布於ISP3平板上。未作誘變處理的菌懸液亦經適當稀釋塗布於ISP3平板作為對照。28℃培養10天後，檢查菌落數，並計致死率。
取10-1或10-2梯度的單細胞菌懸液5ml-10ml到帶一根回形針的平板內(直徑9cm)，置UV誘箱內,置磁力攪拌器上，開蓋於UV15W，30cm處照射數分鐘(一般2-5分鐘)，邊照邊攪拌，照後用黑布包好.然後用生理鹽水(0.9％氯化鈉溶液)稀釋10-2—10-7，分別塗ISP3平板得誘變組。
吸取1ml EMS溶於2ml無水乙醇中，再加入22ml，pH7.2的0.1mol/L磷酸緩衝液。取10-1或10-2梯度的單細胞菌懸液5ml到帶一根回形針的平板內，加入5ml，4.0％EMS溶液，最後EMS溶液濃度為2.0％，置磁力攪拌器上，攪拌處理20分鐘至60分鐘。誘變平板內加入10ml 5％的硫代硫酸鈉即可中止反應，用生理鹽水依次稀釋10-2—10-7，塗ISP3平板得誘變組。
挑選經過多輪上述單個或組合誘變後的單菌落不少於10000株，進行搖瓶發酵，HPLC檢測米爾貝黴素的產量。經過多輪誘變，篩選出突變菌株Streptomyces hygroscopicus HS7522。
實施例2：鏈黴菌HS7522菌種培養特徵
參照《鏈黴菌鑑定手冊》、《放線菌的分類與鑑定》、《常見細菌系統鑑定手冊》中的有關內容進行實驗。
採用ISP1、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、高氏一號、蘋果酸鈣、營養瓊脂、YMS和查氏十種培養基，28℃培養7～10天後，觀察菌絲體的顏色及色素情況(培養特徵見表1)。
表1 鏈黴菌HS7522在10種培養基上的培養特徵
備註：表1中「/」為不產生色素。
實施例3：生理生化試驗
參照《鏈黴菌鑑定手冊》、《放線菌的分類與鑑定》、《常見細菌系統鑑定手冊》中的有關內容進行實驗。除溫度實驗外，均為28℃培養7～10天。
1)碳源的利用：採用ISP9作為基礎培養基，各種碳源的終濃度均為1.0％。(結果見表2)
2)無機氮源的利用：採用ISP9作為基礎培養基，硝酸鉀和硫酸銨的濃度均為0.1％。(結果見表2)
3)降解試驗和NaCl耐受實驗(結果見表7)採用基礎培養基為GYEA(pH6.8)，各種降解物的濃度見表3。(結果見表3)
4)氧化酶和過氧化氫酶試驗(結果見表4)、pH試驗(結果見表5)和溫度試驗(結果見表6)均採用YMS培養基。
表2 鏈黴菌HS7522菌株的碳源和氮源的利用情況
表3 鏈黴菌HS7522菌株的降解試驗結果
表4 鏈黴菌HS7522菌株主要的生理生化特徵
表5 鏈黴菌HS7522菌株生長的pH試驗
表6 鏈黴菌HS7522菌株生長的溫度試驗
表7 鏈黴菌HS7522菌株對NaCl的耐受性
備註：表2-7中，0：無生長；1：生長很弱；2：能生長，有少量孢子；3：生長良好，有大量孢子；4：生長最好，有豐富孢子；+：陽性；-：陰性。
實施例4：16S rDNA序列分析
收集在ISP2上生長好的本發明菌絲體，接於含玻璃珠的TSB液體培養基中，置於28℃的培養箱中，250r/min震蕩培養2-4d。離心收集菌絲體，用無菌水洗滌2次後保存於4℃備用。
(1)菌絲體1000rpm離心1min。
(2)加終濃度為3-4mg/ml的溶菌酶溶液(菌絲體體積:溶菌酶溶液體積＝1:5-10)，37℃水浴1-3hr。
(3)加50-100ug/ml蛋白酶K及1％SDS，37℃水浴0.5-3h。
(4)加等體積的中性酚/氯仿，振蕩30sec，12000rpm離心5min。
(5)上清加1/10體積的3M NaAc溶液和等體積的異丙醇，混勻。室溫放置5min，12000rpm離心5min。
(6)沉澱用70％乙醇洗滌2遍，乾燥後溶於TE/RNase。
(7)將提取的基因組作為模板，採用通用引物進行PCR擴增。
上遊引物27F為5』-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3』
下遊引物1495R為5』-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3』
反應在PCR擴增儀上進行。其程序是：95℃預變性5min，94℃變性45s，55℃復性45s，72℃延伸90s，進行30個循環，72℃延伸10min。反應體系如下：
用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。選用條帶清晰的產物進行純化。擴增產物經凝膠電泳回收，並連接到T載體後進行測序，獲得了該菌株16S rDNA一級結構的序列。通過在Genebank資料庫中進行相似性搜索(blast)，結果顯示與Streptomyces sp.NRRL 573916s rRNA同源性99.5％，與Streptomyces bingchenggensis BCW-1同源性99.9％。
表8 鏈黴菌HS7522和相關菌株的同源性
鏈黴菌HS7522與已知的米爾貝黴素產生菌的比較
據CN101100651A報導，米爾貝黴素產生菌冰城鏈黴菌(streptomyces bingchengsis sp.nov)CGMCC NO.1734在高氏一號培養基上菌落表面灰色(有黑色吸水斑)，菌落背面黃灰色，有黃褐色色素產生。而本發明鏈黴菌HS7522在高氏一號培養基上菌落表面白色，菌落背面米褐色，無色素產生。
據US3950360報導，米爾貝黴素產生菌Streptomyces NRRL NO.5739在ISP2培養基上氣生菌絲灰色，背面黃褐色，菌落表面有許多黃色淚珠，有黃色色素產生； 在ISP4培養基上氣生菌絲灰色，背面土黃，菌落表面也有許多黃色淚珠，有明亮的橄欖綠會色素產生，能夠利用阿拉伯糖和木糖。而本發明鏈黴菌HS7522在SP2培養基上氣生菌絲卵石灰，背面米紅色，菌落表面無淚珠，無色素產生；在ISP4培養基上氣生菌絲象牙色，背面象牙色，菌落表面無淚珠，無色素產生，不能利用阿拉伯糖和木糖。
綜上所述，本發明鏈黴菌HS7522屬於鏈黴菌屬，但它不同於已知的米爾貝黴素產生菌Streptomyces NRRL NO.5739，菌冰城鏈黴菌(streptomyces bingchengsis sp.nov)CGMCC NO.1734，鏈黴菌HS7522是一株全新的菌種。
實施例5：製備米爾貝黴素A4
(1)斜面菌絲體的製備與培養
斜面孢子培養基配方(g/L)：酵母抽提物2，麥芽抽提物2，蔗糖10，脫脂奶粉1.2，瓊脂20，消前pH 7.0-7.2，試管30×200mm，裝量20mL，經121℃滅菌20分鐘後，冷卻到50-60℃擺斜面，接入一環菌絲體經28±1℃培養10天後，菌絲成熟。
(2)種子液的製備與培養
種子培養基配方(g/L)：酵母抽提物5，蛋白腖5，蔗糖20，脫脂奶粉3，磷酸氫二鉀0.8，消前pH6.8-7.2，搖瓶裝液量為250mL三角瓶裝30mL，經121℃滅菌20分鐘。菌體接種量為105-106c.f.u./mL，培養溫度28±1℃，250rpm，搖床振蕩培養48小時。
(3)米爾貝黴素A4發酵培養基的製備與培養
發酵培養基配方(g/L)：酵母抽提物5，蔗糖100，脫脂奶粉11，黃豆餅粉10，棉籽餅粉14，磷酸氫二鉀1，七水硫酸亞鐵0.1，硫酸鋅0.02，碳酸鈣5，硫酸銅0.05，鉬酸鈉0.5，搖瓶裝液量為250mL三角瓶裝30mL，經121℃滅菌20分鐘。將種子液以10％(體積百分比)的接種量接入，在28±1℃，250rpm搖床振蕩培養14天，發酵結束後，發酵液經HPLC測定，測得米爾貝黴素A4含量為3900mg/L，A3含量為967mg/L，米爾貝黴素A4的含量佔A3和A4總含量的百分比為80.1％。實施例6：製備米爾貝黴素A4
(1)種子罐種子液的製備
在15L種子罐中投入10L的種子培養基(種子培養基的配比見實施例5，同時添加0.25％的泡敵作消泡劑)，滅菌採用蒸汽滅菌，121℃條件下30分鐘，待 冷卻後，接入200ml搖瓶種子液，培養溫度28±1℃，攪拌轉速150rpm，通氣量1vvm，培養48小時。
(2)發酵罐培養基的配製與培養
發酵培養基的配方與前述實施例5相同，但要添加0.25％泡敵作為消泡劑，發酵罐50L，投料體積為35L，消前pH7.0-7.6，於121℃下蒸汽滅菌25分鐘，冷卻後，接入約3.5L種子罐培養液，發酵溫度28±1℃，攪拌槳轉速底限150rpm，與溶氧關聯，溶氧不低於35％。通氣量為0.6vvm，發酵培養14天，放罐，發酵液經HPLC測定，測得米爾貝黴素A4含量為4100mg/L，A3含量為962mg/L，米爾貝黴素A4的含量佔A3和A4總含量的百分比為81％。
實施例7：製備米爾貝黴素A4
(1)種子罐種子液的製備
在15T種子罐中投入8T的種子培養基(種子培養基的配比見實施例5，同時添加0.25％的泡敵作消泡劑)，滅菌採用蒸汽滅菌，121℃條件下35分鐘，消後體積10T，待冷卻後，接入2L搖瓶種子液，培養溫度28±1℃，攪拌轉速100rpm，通氣量0.8vvm，培養48小時。
(2)發酵罐培養基的配製與培養
發酵培養基的配方與前述實施例5相同，但要添加0.3％泡敵作為消泡劑，發酵罐70T，投料體積為55T，消前pH6.8-7.6，於121℃下蒸汽滅菌35分鐘，冷卻後，接入約6T種子罐培養液，發酵溫度28±1℃，攪拌槳轉速底限50rpm，與溶氧關聯，溶氧不低於35％。通氣量為0.5vvm，發酵培養14天，放罐，發酵液經HPLC測定，測得米爾貝黴素A4含量為4020mg/L，A3含量為961mg/L，米爾貝黴素A4的含量佔A3和A4總含量的百分比為80.7％。
實施例8：製備米爾貝黴素A4
種子培養基配方(g/L)：酵母浸粉5，蛋白腖5，蔗糖40，磷酸氫二鉀0.5，消前pH7.0-7.4。搖瓶裝液量為250mL三角瓶裝25mL，經121℃滅菌20分鐘。從實施例5中的斜面上挖取1×2cm面積的菌塊接入種子瓶中，28±1℃下培養45hr。取上述種子培養液2.5mL接入發酵培養基：酵母膏12，糖蜜200，脫脂奶粉11，黃豆餅粉11，棉籽餅粉11，磷酸氫二鉀1，七水硫酸亞鐵0.1，硫酸鋅0.02，碳酸鈣5，硫酸銅0.05，鉬酸鈉0.5，搖瓶裝液量為250mL三角瓶裝30mL， 經121℃滅菌20分鐘，在28±1℃，250rpm搖床振蕩培養14天，發酵結束，發酵液經HPLC測定，測得米爾貝黴素A4的含量為3960mg/L，A3含量為929mg/L，米爾貝黴素A4的含量佔A3和A4總含量的百分比為81％。
實施例9：製備米爾貝黴素A4
種子液按實施例8進行，然後2.5mL種子液接入發酵培養基：蛋白腖10，蔗糖140，玉米漿10，黃豆餅粉10，麩質粉15，磷酸氫二鉀1，七水硫酸亞鐵0.1，硫酸鋅0.02，碳酸鈣5，硫酸銅0.05，鉬酸鈉0.5，搖瓶裝液量為250mL三角瓶裝30mL，經121℃滅菌20分鐘，在28±1℃，250rpm搖床振蕩培養14天，發酵結束後，發酵液經HPLC測定，測得米爾貝黴素A4的含量為4100mg/L，A3含量為900mg/L，米爾貝黴素A4的含量佔A3和A4總含量的百分比為82％。對比實施例1：本發明鏈黴菌HS7522與原始菌CGMCC 7677生產米爾貝黴素的對比實驗
(1)斜面，種子，發酵培養基組成和培養條件同實施例5，菌種採用原始菌CGMCC 7677，進行五組平行發酵培養，發酵結束後，發酵液經HPLC測定，測得米爾貝黴素A4的平均含量為729mg/L，A3的平均含量為297mg/L，米爾貝黴素A4的含量佔A3和A4總含量的百分比為71％。
(2)斜面，種子，發酵培養基組成和培養條件同實施例5，菌種採用本發明鏈黴菌HS7522，進行五組平行發酵培養，發酵結束後，發酵液經HPLC測定，測得米爾貝黴素A4的平均含量為4016mg/L，A3的平均含量為942mg/L，米爾貝黴素A4的含量佔A3和A4總含量的百分比為81％。