硼替佐米在製備預防或治療骨巨細胞瘤藥物中的應用的製作方法

2023-09-21 18:31:15

硼替佐米在製備預防或治療骨巨細胞瘤藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於醫藥【技術領域】。本發明提供了硼替佐米在預防或治療骨巨細胞瘤（giant?cell?tumor?of?bone,GCTB）藥物中的應用。本發明從體外細胞培養和體內動物實驗兩個方面，研究硼替佐米對GCTB的治療作用，並從分子水平探討其可能的作用機制，實驗結果顯示硼替佐米能夠抑制GCTB破骨細胞的形成和骨片的吸收，誘導基質細胞凋亡，抑制基質細胞的增殖。
【專利說明】硼替佐米在製備預防或治療骨巨細胞瘤藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫藥【技術領域】，具體涉及硼替佐米在預防或治療骨巨細胞瘤藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]骨巨細胞瘤(giant cell tumor of bone, GCTB)為骨組織原發性、侵襲性腫瘤，好發生於四肢和脊柱，時常因侵襲性、溶骨性破壞，導致病理性骨折、椎節不穩、神經功能損傷甚至截癱等臨床症狀嚴重損害患者健康(Shikata J., Yamamuro T., Shimizu K., etal.Surgical treatment of giant-cell tumors of the spine[J].Clin Orthop RelatRes, 1992,3(278):29-36.)。GCTB在我國的發病率較高，佔全部骨腫瘤的20%左右，其中幹飯段是 GCTB 好發部位之一 (Sung H.ff., Kuo D.P., Shu W.P., et al.Giant-cell tumorof bone:analysis of two hundred and eight cases in Chinese patients[J].J BoneJoint Surg Am，1982,64(5):755-761.)。GCTB是由單核細胞、多核的巨細胞以及基質細胞三種細胞共同組成。其中，基質細胞被認為是GCTB的腫瘤成分。它具有在體外無限增殖的能力；並可向多種細胞分化，比如成骨細胞、脂肪細胞等；還可以通過分泌多種細胞因子，如SDF-1、M-CSF、RANKL等募集單核細胞，促進單核細胞向多核的巨細胞分化，進而導致多核巨細胞活化，引起溶骨性的病理損傷。雖然GCTB的致死率不高，但其具有較強的侵襲性和較高的復發性，術後局部復發率高達50-70%，還有少部分患者可出現惡性病變和肺部轉移(Hart R.A., Bori ani S., Biagini R., et al.A system for surgical staging andmanagement of spine tumors.A clinical outcome study of giant cell tumors of thespine [J].Spine (Phila Pal976)，1997，22 (15): 1773-1782; discussionl783.)。對於 GCTB術後復發的患者，由於局部解剖結構的改變、腫瘤惡性程度的升級，使得再次手術切除的難度明顯加大，甚至無法進行手 術。因此，治療GCTB已成為腫瘤外科領域的一大難題，亟需探尋新的治療方法。
[0003]目前用於治療GCTB的藥物有雙磷酸鹽和地諾單抗，其中地諾單抗正在進行臨床2 期實驗(Balke M., Campanacci L., Gebert C., et al.Bisphosphonate treatment ofaggressive primary, recurrent and metastatic Giant Cell Tumour of Bone[J].BMCCancer, 2010, 10(462):1-8.Thomas D., Henshaw R., Skubitz K., et al.Denosumab inpatients with giant-cell tumour of bone:an open-label, phase2study[J].LancetOncol, 2010, 11 (3):275-280.)。但以上兩種藥物僅是針對破骨細胞起作用，而對腫瘤成分的基質細胞並沒有明顯的抑制作用。
[0004]硼替佐米(英文名:Bortezomib，CAS登記號:179324_69_7)，是哺乳動物細胞中26S蛋白酶體糜蛋白酶樣活性的可逆抑制劑，目前主要應用於治療多發性骨髓瘤的藥物。它通過核轉錄因子-KB (NF-KB)信號通路，抑制腫瘤細胞內蛋白抑制因子1-KBa的泛素化，增加其胞內濃度，從而降低NF- K B活性，抑制腫瘤細胞的生長；其次，硼替佐米還可通過上調P53 (最重要的抑癌基因之一)的表達，從而抑制細胞周期；並上調細胞內前凋亡因子NOXA的表達，同時激活Caspase信號通路，誘導細胞凋亡。硼替佐米還通過阻止細胞因子循環和細胞黏附影響骨髓微環境，抑制多發性骨髓瘤患者骨髓的內皮細胞生長，從而減少月中瘤血管新生(Adams J.The development of proteasome inhibitors as anticancerdrugs[J].Cancer Cell, 2004，5(5):417-421.)。
[0005]多發性骨髓瘤是一種起源於B細胞系的惡性腫瘤，其特徵為產生單克隆免疫球蛋白的異常漿細胞增多，並在骨髓內惡性增殖，引起骨折和骨髓功能衰竭，其屬於血液性腫瘤。而GCTB是一種由增殖性基質細胞和破骨細胞樣多核巨細胞構成的具有局部復發傾向的侵襲性、原發性骨腫瘤。兩種腫瘤的發病機制、診斷標準以及臨床特徵存在較大的差異(Palumbo A, Anderson K.Multiple myeloma[J].N Engl J Med, 2011, 364(11):1046-1060.Salerno M., Avnet S., Alberghini M., et al.Histogenetic characterization of giantcell tumor of bone [J].Clin Orthop Relat Res, 2008，466 (9): 2081-2091.)。已有的文獻和診療指南報導，用於治療多發性骨髓瘤的藥物主要有:免疫調節劑(沙利度胺)、蛋白酶體抑制劑(硼替佐米、卡非佐米等)、法尼基轉移酶抑制劑、組蛋白去乙醯化酶抑制劑、熱休克蛋白抑制劑等；而用於治療GCTB的藥物目前只有雙磷酸鹽和地諾單抗。目前治療多發性骨髓瘤和GCTB的治療藥物之間沒有存在相互通用的文獻報導和臨床實踐。
[0006]目前尚未有任何文獻報導硼替佐米具有治療GCTB中的作用；以及通過體內和體外實驗研究，證明硼替佐米能夠抑制GCTB細胞的生長、破骨細胞的形成和骨破壞。

【發明內容】

[0007]本發明的目的在於提供硼替佐米的新用途，特別是在預防或治療骨巨細胞瘤(GCTB)藥物中的應用。
[0008]本發明人在前期的實驗中，通過血清酶聯免疫吸附法檢測和免疫組織化學分析，發現GCTB的泛素-蛋白酶體通路(ubiquitin-proteasome pathway, UPP)過度活化；進一步，通過藥物篩選，發現硼替佐米(Bortezomib)具有較好的抑制GTCB原代細胞增殖的作用。
[0009]本發明人在藥物篩選過程中，同時選擇了小菊內酯、硼替佐米、吡咯烷二硫代氨基甲酸等UPP信號通路抑制劑，僅發現硼替佐米具有較好的抑制GTCB原代細胞增殖的作用。
[0010]本發明從體外細胞培養和體內動物實驗兩個方面，研究硼替佐米對GCTB的治療作用，並從分子水平探討其可能的作用機制。
[0011]本發明人通過實驗發現，硼替佐米能夠抑制GCTB破骨細胞的形成和骨片的吸收，並能誘導基質細胞凋亡，從而抑制基質細胞的增殖。動物實驗進一步證明，硼替佐米能明顯抑制人GCTB原代細胞在脛骨內的生長和骨質破壞。本發明涉及治療或/和預防人GCTB及其某些併發症的方法，該方法包含給予需要治療的患者有效、無毒且藥學上可接受量的硼替佐米。硼替佐米對GCTB的破骨細胞形成具有良好的抑制作用，對GCTB基質細胞的增殖抑制作用具有較好的選擇性，能明顯誘導基質細胞凋亡，對GCTB在骨環境中的骨破壞能力有明顯抑制作用。
[0012]本發明提供了硼替佐米在製備預防或治療骨巨細胞瘤(GCTB)藥物中的應用。
[0013]本發明所述的硼替佐米在製備預防或治療骨巨細胞瘤(GCTB)藥物中的應用，具體指硼替佐米能夠抑制GCTB破骨細胞的形成和骨片的吸收，誘導基質細胞凋亡，抑制基質細胞的增殖。
[0014]本發明所述的硼替佐米是指各種形式的硼替佐米及其衍生物。
[0015]本發明所述的硼替佐米為注射劑，給藥方式包括:靜脈、局部給藥等。
[0016]本發明所述的GCTB細胞具體指從患者腫瘤組織中分離得到的人GCTB原代細胞。
[0017]本發明為硼替佐米提供了一種新用途。
[0018]本發明也為GCTB的預防和治療提供了新的思路。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1:在體外，硼替佐米對不同患者的GCTB原代細胞均具有明顯的抑制作用。
[0020]其中A為硼替佐米處理72小時後，GCTB原代細胞的形態和數量改變，B為磺醯羅丹明B (Sulforhodamine B, SRB)比色法檢測硼替佐米處理72小時後，GCTB基質細胞和正常人成骨細胞的存活情況。由圖可見，GCTB細胞經過硼替佐米處理後，其細胞活性明顯下降，並呈現濃度依賴性。
[0021]圖2:硼替佐米能明顯誘導GCTB基質細胞凋亡。
[0022]其中，A為硼替佐米作用48小時後，基質細胞經Annexin V/PI染色，採用流式細胞儀分析細胞的凋亡情況；B為凋亡細胞百分比的統計結果；由圖可見，硼替佐米處理後GCTB基質細胞凋亡發生的比例明顯升高(右下和右上象限)；C為免疫印跡法檢測凋亡相關蛋白的表達水平，發現硼替佐米處理後GCTB基質細胞凋亡相關的PARP、caspase-3剪切體(cleavage PARP、cleavage caspase-3)表達量升高。
[0023]圖3:硼替佐米能明顯抑制T`NF- α誘導GCTB基質細胞NF- κ B下遊蛋白的表達和Ρ65的入核。
[0024]其中A為硼替佐米抑制TNF- α誘導的I κ B- α的降解；Β為基質細胞經TNF- α誘導和硼替佐米處理後，細胞核和細胞質中Ρ65的分布差異，可見基質細胞經硼替佐米處理後Ρ65的入核明顯減少；C為基質細胞經硼替佐米處理後，NF-kB下遊凋亡蛋白的表達差異，可見抗凋亡的蛋白表達水平下降；D為基質細胞經TNF-α誘導Ρ65的入核免疫螢光染色及硼替佐米抑制Ρ65入核的作用；Ε為293Τ細胞轉染NF- κ B Iuciferase報告基因後，經TNF-α誘導後的表達情況和硼替佐米的抑制作用，進一步證實了，硼替佐米能夠抑制TNF- α誘導的NF- κ B信號通路的活化。
[0025]圖4:硼替佐米能明顯抑制GCTB原代細胞破骨細胞的形成及其在骨片的骨吸收。
[0026]其中A為GCTB原代細胞經不同濃度硼替佐米處理後的TRAP染色、骨片吸收面積及吸收深度為GCTB原代細胞經不同濃度硼替佐米處理48小時後，TRAP陽性細胞數目的統計差異；C為骨片吸收深度的統計學差異。由圖可見，硼替佐米能抑制原代GCTB的破骨細胞形成和骨質吸收。
[0027]圖5:硼替佐米能明顯抑制GCTB條件培養基誘導的破骨細胞形成。
[0028]其中A為經過不同濃度硼替佐米處理後的GCTB基質細胞條件培養基(conditionmedia, CM)誘導小鼠骨髓單核細胞(bone marrow-derived macrophages, BMM)向破骨細胞分化情況為TRAP陽性細胞數目的統計差異。由圖可見，經過GCTB基質細胞條件培養基誘導後，BMM向破骨細胞分化的數目增多,而經過硼替佐米處理後其誘導BMM向破骨細胞分化的數目明顯減少。[0029]圖6:硼替佐米能明顯抑制GCTB誘導BMM的遷移和遷移相關基因的表達。
[0030]其中A為GCTB原代細胞誘導BMM遷移實驗(transwell實驗)；B為transwell實驗的遷移細胞計數統計圖；C、D、E和F分別為遷移相關基因SDF-1、VEGF、MCP-1和MMP-9的表達情況；由圖可見，硼替佐米能抑制GCTB原代細胞誘導的BMM細胞遷移，和GCTB原代細胞的遷移相關基因表達，並呈濃度依賴關係。
[0031]圖7:硼替佐米能明顯抑制GCTB原代細胞在裸鼠脛骨內的生長和骨破壞。
[0032]其中A為GCTB原代細胞注射到裸鼠脛骨後及藥物治療的骨質破壞和腫瘤細胞凋亡情況為三組裸鼠的體重變化情況；C為X-ray觀察後裸鼠脛骨骨損傷面積的統計結果；D STUNEL檢測裸鼠脛骨損傷部位的腫瘤細胞凋亡情況。由圖可見，將GCTB原代細胞注射到裸鼠脛骨內可引起明顯的骨損傷，而硼替佐米能夠減少GCTB原代細胞引起的骨損傷，促進腫瘤細胞的凋亡，並且沒有明顯的毒副作用。
【具體實施方式】
[0033]下面結合附圖和實施例對本發明作詳細描述，但本發明的實施不僅限於此。
[0034]實施例所用的硼替佐米(Bortezomib,商品名:萬河，Velcade),生產廠商為義大利 BSP Pharmaceuticals S.r.1.,分包裝企業為比利時 Janssen pharmaceutica N.V.或西安楊森製藥有限公司；劑型為注射劑，規格為1.0mg/瓶或3.5mg/瓶。採用二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide, DMSO)將硼替佐米稀釋成不同濃度的藥物溶液。
[0035]實施例所用的GCTB細胞是從上海長徵醫院臨床確診為骨巨細胞瘤患者的腫瘤組織中分離得到的人GCTB原代細胞。GCTB破骨細胞和基質細胞的分離方法參考Smink 等提供的方法(Smink JJ, Tunn PU, Leutz A.Rapamycin inhibits osteoclastformation in giant cell tumor of bone through the C/EBPbeta-MafB axis[J].J MolMed(Berl).2013, 90(1):25-30.)。
[0036]實施例1.硼替佐米對人骨巨細胞瘤基質細胞體外生長的抑制作用。
[0037]將處於對數生長期的GCTB基質細胞以5X IO3細胞/孔的密度接種於96孔板中，貼壁24小時後更換為含有不同濃度硼替佐米的完全培養基(GIBC0公司的α-ΜΕΜ，10%胎牛血清，1%的青-鏈黴素)，以未加硼替佐米組為空白對照，硼替佐米分別設5nM、IOnM,20nM.40nM.80nM五個濃度組，於藥物幹預72小時後，採用磺醯羅丹明B(Sulforhodamine B, SRB)比色法檢測細胞的增殖情況(Voigt ff.Sulforhodamine B assayand chemosensitivity[J].Methods in molecular medicine.2005;110:39-48.X
[0038]結果如圖1所示，硼替佐米對不同患者GCTB基質細胞的增殖，均具有明顯的抑制作用；而且隨著硼替佐米濃度的升高，其對GCTB基質細胞的增殖抑制作用逐漸增強。該實驗結果表明，在體外硼替佐米對GCTB基質細胞的增殖具有明顯抑制作用。
[0039]實施例2.硼替佐米誘導GCTB基質細胞凋亡的作用。
[0040]一、流式細胞儀檢測基質細胞凋亡情況:
[0041]將處於對數生長期的不同人GCTB基質細胞，以IX IO4個/ml的細胞密度接種於6孔板中，貼壁24小時後更換為含有硼替佐米(設10nM、20nM和40nM三個濃度)的完全培養基，以未加任何刺激的細胞組為空白對照。細胞培養箱中培養48小時，0.25%胰酶細胞消化液(Trypsin-EDTA Solution)消化細胞，1000rpm離心5min,經膜聯蛋白A5-綠色突光素/碘化丙啶(Annexin V/PI)細胞凋亡檢測試劑盒避光染色15min後，採用流式細胞儀檢測GCTB基質細胞的凋亡情況。結果如圖2A、B所示:流式細胞儀結果顯示，經硼替佐米處理後凋亡的基質細胞百分比明顯升高(右側上、下兩個象限之和)。
[0042]二、凋亡相關蛋白的表達情況:
[0043]將處於對數生長期的GCTB基質細胞，以I X IO4個/ml的細胞密度接種於6孔板中，貼壁24小時後更換為含有硼替佐米(設10nM、20nM和40nM三個濃度)的完全培養基，以未加任何刺激的細胞組為空白對照。細胞培養箱中培養48小時，採用RIPA (放射免疫測定法，radio immunoprecipitation assay,購自碧雲天生物技術有限公司)裂解細胞,收集細胞蛋白，通過蛋白印跡法(western blot)檢測凋亡蛋白PARP和caspase-3切割形式(cleaved PARP and cleaved caspase-3)的表達情況。結果如圖 2C 所不:cleaved PARP和cleaved caspase-3的表達量隨著硼替佐米濃度的升高而逐漸增加。
[0044]流式細胞儀分析的細胞凋亡數目和蛋白印跡法檢測的凋亡蛋白表達結果，均表明硼替佐米能夠誘導基質細胞凋亡和促進凋亡蛋白的表達，證明硼替佐米具有誘導GCTB基質細胞凋亡的作用，並呈濃度依賴性。
[0045]實施例3.硼替佐米抑制TNF- α誘導GCTB基質細胞NF- κ B下遊蛋白表達和Ρ65入核的作用。
[0046]一、NF- κ B信號通路關鍵蛋白I κ B- α和ρ65的表達情況:
[0047]將處於對數生長期的GCTB基質細胞以I X IO4個/ml的細胞密度接種於6孔板中，貼壁24小時後更換為含有20nM硼替佐米，以未加任何刺激的細胞組為空白對照，其他組給予0.2nM TNF-α刺激，於TNF-α刺激後的0、5、10、15、30、60分鐘後，採用RIPA裂解細胞，收集細胞蛋白，以及按「核質分離」方法分別收集細胞質和細胞核內的蛋白，通過蛋白印跡法檢測I κ B- α和Ρ65的分`布，觀察硼替佐米抑制TNF- α誘導NF- κ B下遊蛋白表達的時間梯度關係。結果如圖3Α、Β所示，硼替佐米能抑制ΙκΒ-α的降解，減少Ρ65入核。
[0048]二、NF- κ B信號通路下遊凋亡蛋白的表達情況:
[0049]將處於對數生長期的人骨巨細胞瘤基質細胞以I X IO4個/ml的細胞密度接種於6孔板中，貼壁24小時後更換為含有20nM硼替佐米，以未加任何刺激的細胞組為空白對照，其他組給予0.2nM TNF-α刺激，於TNF-α刺激後的12、24、36、48小時後，採用RIPA裂解細胞，收集細胞蛋白，通過蛋白印跡法檢測NF-κ B下遊抑制凋亡相關蛋白的表達。結果如圖3C所示，硼替佐米能減少抗凋亡蛋白XIAP、c-1AP-l、c-1AP-2、C-FILP、BCL-xl、BCL-2的表達。
[0050]三、P65的入核情況:
[0051]將處於對數生長期的GCTB基質細胞以5 X IO3個/孔的細胞密度接種於預先鋪有蓋玻片的24孔板中，貼壁24小時後更換為含有硼替佐米的培養基(設10nM、20nM和40nM三個濃度)，以未加任何刺激的細胞組為空白對照，單加TNF- α刺激的為陽性對照，其他組給予0.2nM TNF-α刺激5分鐘，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定10分鐘，0.l%Triton X-100通透5分鐘，封閉液封閉30分鐘，P65 一抗孵育過夜，二抗37°C孵育I小時，DAPI復染，螢光顯微鏡拍照觀察。結果如圖3D所示，GCTB基質細胞經TNF- α刺激後Ρ65的入核明顯增加，經硼替佐米處理後Ρ65入核數量明顯減少。
[0052]四、NF-κ B Iuciferase報告基因的表達情況:[0053]將NF-κ B Iuciferase報告基因轉染到293T細胞(購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)上，貼壁24小時後更換為含有硼替佐米(設5nM、10nM、20nM、40nM和80nM五個濃度)的培養基預處理4小時，以未加任何刺激的細胞組為空白對照，單加TNF-α刺激的為陽性對照，其他組給予0.2nM TNF-α刺激5分鐘，採用luciferase assay kit(promega)裂解、檢測螢光素梅的表達差異。結果如圖3E所示，293T細胞經TNF- α刺激後NF-kB luciferase報告基因明顯升高，硼替佐米能顯著抑制NF-κ B luciferase報告基因的表達，而且隨著硼替佐米濃度的增加，其抑制作用逐漸增強。
[0054]實施例4.硼替佐米能明顯抑制GCTB原代細胞中破骨細胞的形成和在骨片的骨吸收。
[0055]一、破骨細胞形成數目的影響:
[0056]將從新鮮腫瘤標本中分離得到的GCTB原代細胞，按2X IO4個/孔的細胞密度接種於48孔板，並給予不同濃度的硼替佐米(0、2.5、5、7.5、IOnM)處理48小時後，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定10分鐘，經0.l%TritonX-100通透5分鐘，PBST處理20分鐘，TRAP染液(抗酒石酸酸性憐酸酶，tartrate-resistant acid phosphate,購自Sigma公司)37°C染色60分鐘，去除TRAP染液，PBS清洗2次，倒置顯微鏡拍照計數，統計TRAP陽性的細胞數目。
[0057]二、骨吸收面積和骨吸收深度分析:
[0058]將從新鮮腫瘤標本中分離得到的GCTB原代細胞，按I X IO4個/孔的細胞密度接種於預先鋪好骨片的96孔板，並給予不同濃度的硼替佐米(0、2.5、5、7.5、10nM)處理48小時後，採用IM氨水破裂細胞I分鐘，4%戊二醛固定5分鐘，1%甲苯胺藍染色5分鐘，倒置顯微鏡和雷射共聚焦顯微鏡拍照、測量。
[0059]結果如圖4所示，GCTB原代細胞經硼替佐米處理後，破骨細胞的形成數目明顯減少，而且在骨片上形成的蝕骨面積和深度減輕。該實驗結果，表明硼替佐米具有抑制GCTB破骨細胞形成和骨質吸收的作用。
[0060]實施例5.硼替佐米能明顯抑制GCTB條件培養基誘導的破骨細胞形成。
[0061]收集經過不同濃度硼替佐米(0、2.5、5、7.5、10nM)處理48小時後的GCTB基質細胞條件培養基(condition medium，CM)，-80°C冰箱保存備用。按5X IO3個/孔的細胞密度，將BMM (Bone Marrow-Derived Macrophages,骨髓單核細胞)接種於96孔板，貼壁24小時後換成含10%CM的培養基，每兩天換液一次，誘導培養4-5天後，4%多聚甲醛固定lOmin，經
0.l%Triton X-100通透5分鐘，PBST處理20分鐘，採用TRAP染液37°C染色60分鐘，去除TRAP染液，PBS清洗2次，倒置顯微鏡拍照計數。結果如圖5所示:GCTB基質細胞條件培養基可明顯誘導BMM細胞向TRAP陽性的破骨細胞分化，而硼替佐米處理後的條件培養基能減少破骨細胞的形成，並呈濃度梯度依賴性。該實驗結果，進一步證明硼替佐米具有抑制GCTB誘導破骨細胞形成的作用。
[0062]實施例6.硼替佐米能明顯抑制GCTB誘導BMM的遷移和遷移相關基因的表達。
[0063]將GCTB原代細胞或人成纖維細胞系(hFOBl.19)按2 X IO4個/孔的細胞密度接種於24孔板，貼壁24小時後換成含有硼替佐米的培養基(設2.5nM、5nM、7.5nM和IOnM四個濃度)，以未加任何刺激的細胞組為空白對照，預處理24小時後，在transwell小室上層加入5X IO4個/孔的BMM，培養箱培養20小時後，經4%多聚甲醛固定10分鐘，2%結晶紫染色10分鐘後，倒置顯微鏡拍照、計數統計穿過小室的BMM數目。結果如圖6A、B所示:GCTB原代細胞能明顯促進BMM細胞遷移；而經硼替佐米處理後，GCTB原代細胞誘導BMM遷移的作用明顯減弱。
[0064]將GCTB原代細胞按5X IO4個/孔的細胞密度接種於12孔板，貼壁24小時後換成含有硼替佐米的培養基(設2.5nM、5nM、7.5nM和IOnM四個濃度)，以未加任何刺激的細胞組為空白對照，硼替佐米處理24小時後，採用Trizol抽提細胞的總RNA，經逆轉錄和real-time PCR檢測遷移相關基因SDF-1、VEGF、MCP-1和MMP-9的表達情況。結果如圖6C、
D、E、F所示:硼替佐米能抑制骨巨細胞瘤細胞遷移相關基因SDF-1、VEGF、MCP-1和MMP-9的表達。該實驗結果，表明硼替佐米能夠抑制GCTB原代細胞表達募集單核細胞的細胞因子。
[0065]實施例7.硼替佐米能明顯抑制GCTB原代細胞在裸鼠脛骨內的生長和骨破壞。
[0066]收集新鮮的GCTB腫瘤標本，採用膠原酶消化法分離GCTB原代細胞，經濾網(直徑=40um)過濾收集單細胞懸液，800rmp離心5分鐘，血細胞計數器計數後，採用PBS重懸，使細胞終濃度為5XlO4AAil GCTB原代細胞。採用眼科剪剪開裸鼠膝關節處皮膚，暴露脛骨，在X線觀察下將顯微注射器針頭插入裸鼠脛骨內，緩慢地將20ul上述GCTB原代細胞注射到裸鼠的脛骨髓腔內。經X-ray觀察模型成功後，按脛骨損傷面積排序，隨機分為模型組、唑來膦酸組和硼替佐米組，分別給予0.lmg/kg的唑來膦酸和0.3mg/kg的硼替佐米。唑來膦酸每周給藥一次，硼替佐米每3天給藥一次，定期採用X-ray觀察脛骨的骨損傷情況和腫瘤大小以及腫瘤細胞的凋亡情況。連續給藥3個月後取出脛骨，經micro-CT、HE及TUNEL染色觀察骨損傷體積、腫瘤大小、腫瘤細胞的凋亡數目。
[0067]結果如圖7所示 :將GCTB原代細胞注射到裸鼠脛骨髓腔內可引起明顯的溶骨性損傷；經過硼替佐米治療後可減輕骨損傷程度，而且腫瘤細胞凋亡數目明顯增多。該實驗結果表明硼替佐米具有治療GCTB的作用。
[0068]以上已對本發明創造的較佳實施例進行了具體說明，但本發明創造並不限於所述實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發明創造精神的前提下還可作出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的範圍內。
【權利要求】
1.硼替佐米在製備預防或治療骨巨細胞瘤藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的硼替佐米在製備預防或治療骨巨細胞瘤藥物中的應用，其特徵在於，該應用是指硼替佐米能夠抑制骨巨細胞瘤破骨細胞的形成和骨片的吸收，誘導基質細胞凋亡，抑制基質細胞的增殖。
3.根據權利要求1所述的硼替佐米在製備預防或治療骨巨細胞瘤藥物中的應用，其特徵在於，所述的硼替佐米是指各種形式的硼替佐米及其衍生物。
4.根據權利要求1所述的硼替佐米在製備預防或治療骨巨細胞瘤藥物中的應用，其特徵在於，所述的硼替佐米為注射劑。
5.根據權利要求4所述的硼替佐米在製備預防或治療骨巨細胞瘤藥物中的應用，其特徵在於，所述的硼替佐米的給藥方`式為靜脈給藥或局部給藥。
【文檔編號】A61K31/69GK103690927SQ201310717855
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月23日 優先權日:2013年12月23日
【發明者】肖建如, 劉明耀, 羅劍, 金蓉蓉, 徐樂勤, 楊興海, 吳志鵬, 萬維, 蔡小攀 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學, 華東師範大學