應激條件提高茂原鏈黴菌生產穀氨醯胺轉氨酶產量的方法
2023-09-21 18:32:55
專利名稱：應激條件提高茂原鏈黴菌生產穀氨醯胺轉氨酶產量的方法
技術領域：
本發明涉及鏈黴菌發酵生產穀氨醯胺轉氨酶技術領域，具體涉及一種採用應激條件提高發酵法製備穀氨醯胺轉氨酶的方法。
背景技術：
穀氨酸胺轉氨酶(Transglutaminase,簡稱TGase, EC 2.3.2.13, R-glutaminyl-peptide:amnie- Y -glutamyl-transferase)又名轉穀氨醯胺酶,它通過催化蛋白質中的穀氨酸殘基上的甲醯胺與賴氨酸殘基上的ε -氨基進行醯基轉移反應，使蛋白質在分子內或分子間形成交聯。
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在二十世紀八十年代，Ikura等人報導了穀氨醯胺轉氨酶對食物蛋白質的交聯作用。他們用哺乳動物源穀氨醯胺轉氨酶交聯幾種食物蛋白質，如酪蛋白、大豆蛋白等。這些蛋白的交聯，提高了其產品的功能性，如凝膠性、溶解性和乳化性等。然而，由於其高昂的價格和低效的利用率限制了它在食品工業上的應用。從鏈黴菌中成功分離到微生物源穀氨醯胺轉氨酶是促進其在食品工業上應用的一個裡程碑。它使得這種酶可以大規模地生產，並且被商業利用。由於鏈黴菌穀氨醯胺轉氨酶底物的催化特性，以及它在食品、紡織和醫藥行業中的廣闊應用前景，受到了國內外學者的廣泛關注，在亞洲的日本、臺灣，歐洲的丹麥、荷蘭、法國、德國、愛爾蘭以及巴西等國家均投入了大量的人力、物力、財力進行研究，並取得了突飛猛進的進展。穀氨醯胺轉氨酶的來源主要有3種:一是從動物的組織或體液中提取，例如牛、豬或魚等，由於動物組織種類有限、來源稀少、含量低、組織特異性又極高，而且分離精製過程複雜，價格十分昂貴；在歐洲，商業化的凝血因子XIII (穀氨醯胺轉氨酶的一種)主要通過宰殺牛或豬等動物來獲得，但由於血液中的穀氨醯胺轉氨酶通常需要凝血酶激活才具有活性，故很少應用於食品工業中。二是以大腸桿菌、棒狀桿菌和鏈黴菌等為宿主，用基因工程手段來生產此酶。基因工程菌表達效果較差，遠不能達到原有水平；雖然有些報導產量較高，但某些國家對基因工程產品限制比較嚴格。三是直接篩選產穀氨醯胺轉氨酶的微生物，通過發酵法來生產。由於此方法技術可行、成本較低、生產不受出發材料和季節限制，最有可能進行大規模生產和廣泛應用。但是目前食品級穀氨醯胺轉氨酶來源單一、產量較低、價格昂貴，限制了其在食品工業上的應用。國內外提高微生物穀氨醯胺轉氨酶產量的報導大多集中在優化發酵條件，改善培養基組成等方面。雖然這些研究都取得了一些成果，但是此酶的產量仍然較低。目前商業化的產品主要由日本味之素等公司生產。國內用微生物發酵法生產穀氨醯胺轉氨酶尚處於起步階段，產量較低。
發明內容
針對現有穀氨醯胺轉氨酶的製備方法存在的問題，本發明提供一種應激條件提高茂原鏈黴菌生產穀氨醯胺轉氨酶產量的方法。
本發明的發明目的是通過如下技術方案實現的:
採用茂原鏈黴菌為發酵菌株，經斜面培養和種子培養後，接種在發酵培養基中經液體發酵製備穀氨醯胺轉氨酶，在發酵過程中分別通過熱處理培養物、在發酵培養基中添加甲醇或NaCl，發酵96h，最終實現了提高穀氨醯胺轉氨酶產量的目標。具體技術方案如下:
1、菌種及發酵培養液:
(I)菌種:
茂原鏈黴菌印iOffiiFce1S mobaraense) DSM40587:購於日本 NBRC。(2)斜面培養基(g/L):高氏一號培養基。(3)種子培養基(g/L):聚蛋白腖20，可溶性澱粉20，磷酸氫二鉀2，磷酸二氫鉀2，酵母粉2，無水硫酸鎂2，pH 7.0。(4)初始發酵培養基(kg/1000L):聚蛋白腖30，可溶性澱粉10，果糖10，磷酸氫二鉀2，酵母粉2，無水硫酸鎂1，pH 7.0。
2、穀氨醯胺轉氨酶酶活的測定方法:
採用分光光度法37 1:下測定。吸取5(^1^發酵液，加入0.51^試劑4，371:水浴保溫IOmin,加入0.5mL試劑B，終止反應，500nm比色。試劑A:1OOmg 的 N-CBZ-Gln-Gly 溶解於 2mL、0.2mol/L 的 NaOH，依次加入 0.2mol/L、pH 6.0的Tris-HCl緩衝液4mL，0.lmol/L的羥胺2mL，0.01mol/L的還原型穀胱甘肽2mL，並調節pH至6.0。試劑B:3mol/L鹽酸、12%三氯乙酸、5%FeCl3.6H20 (溶解於0.lmol/L的鹽酸)按1:1:1的比例混合。I單位穀氨醯胺轉氨酶活性(U)定義為:37°C，pH 6.0的條件下反應，每分鐘產生濃度為Iymol的單羥肟酸所需的酶量。3、培養方法:
用5mL無菌生理鹽水將培養7d的斜面孢子洗下，接種於IOOmL種子培養基中，30°C、200r/min培養48h後，按10%的接種量添加到發酵培養基中，30°C、200 r/min採用提高穀氨醯胺轉氨酶產量的培養方式培養，將培養好的發酵液經板框過濾器過濾或壓濾，再經
0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾，製成無細胞的酶液，添加載體保護劑充分混溶，或這些保護劑與無細胞酶液充分混合再經0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾除菌。採用低溫噴霧乾燥或冷凍乾燥製成乾粉。4、上述提高穀氨醯胺轉氨酶產量的培養方式如下:
(I)熱處理提高酶產量的培養方式:
將發酵48 h茂原鏈黴菌發酵液，快速加熱至60-65 V，保持Imin後，將溫度快速冷卻到30°C,200 r/min條件下培養至96h,得到的穀氨醯胺轉氨酶酶活1.16U/mL,顯著地高於不加熱對照組0.71U/mL,為對照樣品的1.6倍。(2)甲醇脅迫提高酶產量的培養方式:
發酵起始時加入培養基重量的1%_3%甲醇，在30°C、200 r/min條件下培養96h後酶活達1.77U/mL，顯著地高於以未加入甲醇的發酵培養物對照組0.67U/mL。(3) NaCl脅迫提高酶產量的培養方式:在發酵起始時向培養基中添加0.15-0.25 mol/LNaCl，在30°C、200 r/min條件下培養96h酶活力為3.0U/mL，顯著地高於以未添加NaCl的發酵培養物對照組(1.25U/mL)，為對照組的2.4倍。5、載體保護劑添加:
上述所涉及的保護劑為以無細胞的酶液計蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%，經IOO0CU小時烘乾，無菌條件下混料機充分混合；或這些保護劑與無細胞酶液充分混溶再經0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾除菌。6、低溫噴霧乾燥或冷凍乾燥製成乾粉: 將載體添加保護劑後，採用低溫噴霧乾燥方法乾燥，條件為進風溫度80°C，出風溫度55- 60°C。或者採用真空冷凍乾燥機乾燥，凍幹機冷井溫度為_60°C，真空度為0.05MPa。本發明採用應激條件促進茂原鏈黴菌生產穀氨醯胺轉氨酶，本法得到的酶經純化後熱穩定性和PH穩定性均高於吸水鏈黴菌合成的穀氨醯胺轉氨酶，它在食品加工、紡織行業和組織支架製備行業中具有很大的潛力。所用的添加劑價格低廉，實施方法方便，可顯著提高穀氨醯胺轉氨酶產量，在其它培養條件相同的情況下，本發明比不改變培養條件的對照例產量分別提高60%、160%和140%，達到發酵法製備穀氨醯胺轉氨酶的先進水平。
具體實施例方式具體實施方式
一:在發酵48h後,將發酵培養物置於水浴60_65°C加熱Imin,繼續發酵96h時得到的酶活1.16U/mL。將培養好的發酵液經板框過濾器過濾或壓濾，再經
0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾，製成無細胞的酶液。載體保護劑蔗糖1-2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%經100°C、1小時烘乾，無菌條件下與無菌酶液充分混溶；或無細胞酶液與載體保護劑蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%充分混溶，再經0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾除菌，採用低溫噴霧乾燥方法乾燥，條件為進風溫度80°C，出風溫度55-60°C，或者採用真空冷凍乾燥機乾燥，凍幹機冷井溫度為_60°C，真空度為0.05MPa。
具體實施方式
二:發酵起始時向培養基中加入1%_4%甲醇，發酵96h後酶活達
1.77U/mL。將培養好的發酵液經板框過濾器過濾或壓濾，再經0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾，製成無細胞的酶液。載體保護劑蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%經100°C、I小時烘乾，無菌條件下與無菌酶液充分混溶；或無細胞酶液與載體保護劑蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%充分混溶，再經0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾除菌，採用低溫噴霧乾燥方法乾燥，條件為進風溫度80°C，出風溫度55-60°C，或者採用真空冷凍乾燥機乾燥，凍幹機冷井溫度為_60°C，真空度為0.05MPa。
具體實施方式
三:在發酵起始時向培養基中添加0.15-0.25 mol/L NaCl，發酵96h後酶活力為3.0U/mL。將培養好的發酵液經板框過濾器過濾或壓濾，再經0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾，製成無細胞的酶液。載體保護劑蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%經100°C、I小時烘乾，無菌條件下與無菌酶液充分混溶；或無細胞酶液與載體保護劑蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%充分混溶，再經0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾除菌，採用低溫噴霧乾燥方法乾燥，條件為進風溫度80°C，出風溫度55-60°C，或者採用真空冷凍乾燥機乾燥，凍幹機冷井溫度為_60°C，真空度為0.05MPa。
權利要求
1.應激條件提高茂原鏈黴菌生產穀氨醯胺轉氨酶產量的方法，採用茂原鏈黴菌為發酵菌株，經斜面培養和種子培養後，接種在發酵培養基中經液體發酵製備穀氨醯胺轉氨酶，其特徵在於在發酵過程中分別通過熱處理培養基、在發酵培養基中添加醇類或NaCl，發酵96h提高鏈黴菌穀氨醯胺轉氨酶的產量。
2.根據權利要求1所述的應激條件提高茂原鏈黴菌生產穀氨醯胺轉氨酶產量的方法，其特徵在於所述熱處理培養基的方法為將發酵48h的培養物加熱到60-65°C，處理0.5-1.5min，繼續發酵至96h。
3.根據權利要求1所述的應激條件提高茂原鏈黴菌生產穀氨醯胺轉氨酶產量的方法，其特徵在於在發酵起始時加入培養基重量比的1-3%甲醇或在發酵起始時添加0.15-0.25mol/L NaCl,發酵至 96h。
4.根據權利要求1、2或3所述的應激條件提高茂原鏈黴菌生產穀氨醯胺轉氨酶產量的方法，其特徵在於所述方法具體步驟如下:用5 mL無菌生理鹽水將培養7 d的斜面孢子洗下，接種於100 mL種子培養基中，30 0C, 200 r/min培養48 h後，按10%的接種量添加到發酵培養基中，30°C、200r/min採用提高穀氨醯胺轉氨酶產量的培養方式培養，將培養好的發酵液經板框過濾器過濾或壓濾，再經0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾，製成無細胞的酶液，添加載體保護劑充分混溶，採用低溫噴霧乾燥或冷凍乾燥製成乾粉。
5.根據權利要求4所述的應激條件提高茂原鏈黴菌生產穀氨醯胺轉氨酶產量的方法，其特徵在於所述保護劑為以無細胞的酶液計蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%。
6.根據權利要求4或5所述的應激條件提高茂原鏈黴菌生產穀氨醯胺轉氨酶產量的方法，其特徵在 於所述保護劑經100°C、1小時烘乾，在無菌條件下與無細胞的酶液充分混溶。
7.根據權利要求4或5所述的應激條件提高茂原鏈黴菌生產穀氨醯胺轉氨酶產量的方法，其特徵在 於所述保護劑與無細胞酶液充分混溶，再經0.22 μ m濾膜的微過濾裝置過濾除囷。
8.根據權利要求4所述的應激條件提高茂原鏈黴菌生產穀氨醯胺轉氨酶產量的方法，其特徵在於所述低溫噴霧乾燥的條件為進風溫度80°C，出風溫度55- 60°C。
9.根據權利要求4所述的應激條件提高茂原鏈黴菌生產穀氨醯胺轉氨酶產量的方法，其特徵在於所述冷凍乾燥採用真空冷凍乾燥機乾燥，凍幹機冷井溫度為_60°C，真空度為.0.05MPa。
全文摘要
應激條件提高茂原鏈黴菌生產穀氨醯胺轉氨酶產量的方法，涉及鏈黴菌發酵生產穀氨醯胺轉氨酶技術領域。本發明採用茂原鏈黴菌為發酵菌株，經斜面培養和種子培養後，接種在發酵培養基中經液體發酵製備穀氨醯胺轉氨酶，在發酵過程中分別通過熱處理培養物、在發酵培養基中添加甲醇或NaCl，實現了提高穀氨醯胺轉氨酶產量的目標，並添加保護劑製成低溫噴霧乾燥或冷凍乾燥乾粉。本發明得到的酶經純化後熱穩定性和pH穩定性均高於吸水鏈黴菌合成的穀氨醯胺轉氨酶，在食品加工、紡織行業和組織支架製備行業中具有很大的潛力。所用添加劑價格低廉，實施方法簡便，可顯著提高穀氨醯胺轉氨酶產量，產量分別提高60%，160%和140%。
文檔編號C12R1/465GK103146660SQ20131007202
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月7日 優先權日2013年3月7日
發明者張蘭威, 張莉麗, 易華西, 單毓娟, 馮鎮, 杜明, 韓雪, 張英春, 李洪波, 焦月華 申請人:哈爾濱工業大學