高純度單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉的製法

2023-09-21 19:17:55

高純度單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉的製法
【專利摘要】本發明涉及一種高純度的單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉的製法，是以新鮮豬腦為原料經過提取步驟和純化步驟進行製備，其中提取步驟包括制丙酮粉步驟、組織總脂的抽提步驟、folch分配步驟、脫病毒步驟、酸水解病毒滅活步驟；純化步驟包括脫鹽步驟、矽膠層析步驟、反相層析步驟、濃縮步驟、丙酮重結晶步驟、凍幹步驟。本發明的有益效果在於，採用高純度的單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉製得的注射劑，採用特定pH條件下的脫病毒步驟、酸水解病毒滅活步驟，經對100名使用者的跟蹤統計，不良反應發生率降低了47％。
【專利說明】高純度單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉的製法
【技術領域】
[0001]本發明屬於製藥領域，特別涉及一種高純度的單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉的製法。
【背景技術】
[0002]單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉(MonosialotetrahexosylganglioideSodium,GMl)的製法一般分為提取和純化兩個步驟。純化方法大致包括:
[0003]1、CN1814610A公開了採用大孔樹脂分離單唾液酸四己糖神經節苷脂的方法。
[0004]2、CN1353112A公開的純化步驟為:粗品經離子交換柱層析，反相柱層析，所得GMl純度大於98%。
[0005]3、CN1158295C公告了結合使用超濾膜分離技術、Iatrobeads及DEAE SephadexA25柱層析、高效液相色譜層析技術，純度達95%以上。
[0006]4>Momoi TaKashi建立了陰離子交換層析技術、親和層析技術。
[0007]現有技術都立足於提高產品純度、收率，降低產品成本，減少毒害有機溶劑(特別是氯仿)的使用量等方面進行了大量的研究，並且市場已有單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液、注射用單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉等多種產品在銷售使用。然而，由於來源於生物原料豬腦，單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉的不良反應比較多，特別是與藥物中的雜質、汙染物、添加劑、病毒或特殊代謝產物形成有關的過敏反應，嚴重的過敏反應可發生全身皮疹，尤其是黏膜處更多，且有潰爛。

【發明內容】

[0008]本發明提供了一種高純度的單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉的製法，該製法獲得的產品具有純度高、不良反應低的特點。本發明的技術方案包括如下內容:
[0009]本發明的一種高純度單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉的製法，是以新鮮豬腦為原料經過提取步驟和純化步驟進行製備，其中，
[0010]提取步驟包括制丙酮粉步驟、組織總脂的抽提步驟、folch分配步驟、脫病毒步驟、酸水解病毒滅活步驟；
[0011]純化步驟包括脫鹽步驟、矽膠層析步驟、反相層析步驟、濃縮步驟、丙酮重結晶步驟、凍幹步驟。
[0012]優選的本發明提取步驟包括，
[0013]制丙酮粉步驟:即`將新鮮豬腦搗碎，於-5-15°C用丙酮處理，得沉澱，在70_90°C烘烤，製得丙酮粉；
[0014]組織總脂的抽提步驟:即將丙酮粉以體積比3: 1-1: 3的氯仿甲醇混合液提取2-5次，得抽提液；
[0015]folch分配步驟:即將抽提液用0.05-0.15體積的水進行folch分配，有機層棄去，保留水層，得上清液；[0016]脫病毒步驟:將上清液加氫氧化鈉1-10重量份，於室溫下水解3-7小時，醋酸中和至PH7-9，用截留分子量為3000-50000的分子膜截留，得濾液；最優的為截留分子量為30000-50000的分子膜.[0017]酸水解病毒滅活步驟:將濾液用醋酸調節pH至3.5-4.5，於50_70°C水解8_12小時(巴氏滅菌法)，水解液冷卻，用氫氧化鈉調pH至中性，離心，乾燥，得總脂粗品乾粉。
[0018]最優的本發明提取步驟包括，
[0019]制丙酮粉步驟為:將新鮮豬腦搗碎，於-10°C用丙酮處理，得沉澱，在80°C烘烤，製得丙酮粉；
[0020]組織總 脂的抽提步驟為:將丙酮粉以體積比2: I的氯仿甲醇混合液提取3次，得抽提液；
[0021]folch分配步驟為:將抽提液用0.1體積的水進行folch分配，有機層棄去，保留水層，得上清液；
[0022]本發明的「Folch分配法」是指以二氯甲烷/甲醇液液相分離法來提取脂質的方法。
[0023]脫病毒步驟:將上清液加氫氧化鈉5重量份，於室溫下水解5小時，醋酸中和至PH8，用截留分子量為3000-50000的分子膜截留，得濾液；
[0024]酸水解病毒滅活步驟:將濾液用醋酸調節pH至4，於60°C水解10小時，採用巴氏滅菌法，水解液冷卻，用氫氧化鈉調pH至中性，離心，乾燥，得總脂粗品乾粉。
[0025]優選的本發明各項純化步驟為:
[0026]脫鹽步驟:以HI PREP?柱脫鹽，214nm紫外監測，電導率監測，水平衡後，將總脂粗品乾粉上柱，用水洗脫，收集紫外峰部分，得水相收集液；
[0027]本發明中，HiTrapTM、HiLoad?和 RESOURCE? 均可作為 HIPREP? 柱的替代。
[0028]矽膠層析步驟:體積比為3-9: 1-3: 0.1-0.3的氯仿、甲醇、水混合液平衡矽膠柱，將水相收集液上柱後，用上述氯仿、甲醇、水混合液洗脫，TLC檢測收集洗脫液，得收集液；
[0029]反相層析步驟:將收集液過Source RPC30柱，經水平衡，分別用80%甲醇分離和100%甲醇洗脫，214nm紫外監測，收集紫外洗脫峰，得反相收集液；
[0030]本發明的反相層析所用填料不限於Source RPC30。
[0031]濃縮步驟:將反相收集液濃縮、冷卻析晶，過濾、得單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉粗品;
[0032]丙酮重結晶步驟:將單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉粗品用丙酮重結晶，得結晶固體；
[0033]凍幹步驟:將結晶固體用水溶解後用0.22μπι濾膜除菌過濾，冷凍乾燥、得半成品，經外包裝、裝箱得成品。
[0034]上述純化步驟，最優選的矽膠層析步驟:體積比為3: I: 0.1的氯仿、甲醇、水混合液平衡矽膠柱，將水相收集液上柱後，用上述氯仿、甲醇、水混合液洗脫，TLC檢測收集洗脫液，得收集液；
[0035]本發明的新鮮豬腦包括如下步驟處理:
[0036]在新鮮狀態下於< _18°C冷凍保存一年；[0037]豬腦外觀應完整、清潔，色澤新鮮，無異味，無汙染雜質；
[0038]豬腦剖開後觀察，應質地良好，無腫塊、萎縮、壞死、出血、炎症等病變。
[0039]本發明的有益效果在於，採用高純度的單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉製得的注射劑，採用特定pH條件下的脫病毒步驟、酸水解病毒滅活步驟，經對100名使用者的跟蹤統計，不良反應發生率降低了 47%。
[0040]
【具體實施方式】
[0041]實施例1單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉的製備
[0042]先將新鮮豬腦搗碎，於-10°C用丙酮處理，得沉澱，在80°C烘烤，製得丙酮粉；將丙酮粉以體積比2: I的氯仿甲醇混合液提取3次，得抽提液；將抽提液用0.10體積的水進行fo I c h分配，有機層棄去，保留水層，得上清液；將上清液加氫氧化鈉I重量份，於室溫下水解5小時，醋酸中和至pH8，用截留分子量為30000-50000的分子膜截留，得濾液；將濾液用醋酸調節pH至4，於60°C水解10小時(巴氏滅菌法)，水解液冷卻，用氫氧化鈉調pH至中性，離心，乾燥，得總脂粗品乾粉。
[0043]HIPREP?柱脫鹽，214nm紫外監測，電導率監測，水平衡後，將總脂粗品乾粉上柱，用水洗脫，收集紫外峰部分，得水相收集液；用體積比為3: I: 0.1的氯仿、甲醇、水混合液平衡矽膠柱，將水相收集液上柱後，用上述氯仿、甲醇、水混合液洗脫，TLC檢測收集洗脫液，得收集液；將收集液過Source RPC30柱，經水平衡，分別用80%甲醇分離和100%甲醇洗脫，214nm紫外監測，收集紫外洗脫峰，得反相收集液；將反相收集液濃縮、冷卻析晶，過濾、得單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉粗品；將單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉粗品用丙酮重結晶，得結晶固體；將結晶固體用水溶解後用0.22 μ m濾膜除菌過濾，冷凍乾燥、得半成品，經外包裝、裝箱得成品，純度達> 99.1%。
[0044]實施例2單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉的製備
[0045]與實施例1基本步驟相同，所不同是參數數值。具體製法為:先將新鮮豬腦搗碎，於_15°C用丙酮處理，得沉澱，在75°C烘烤，製得丙酮粉；將丙酮粉以體積比3: I的氯仿甲醇混合液提取5次，得抽提液；將抽提液用0.15體積的水進行folch分配，有機層棄去，保留水層，得上清液；將上清液加氫氧化鈉3重量份，於室溫下水解4小時，醋酸中和至pH7，用截留分子量為30000-50000的分子膜截留，得濾液；將濾液用醋酸調節pH至3，於70°C水解8小時(巴氏滅菌法)，水解液冷卻，用氫氧化鈉調pH至中性，離心，乾燥，得總脂粗品乾粉。
[0046]將HIPREP?柱脫鹽，214nm紫外監測，電導率監測，水平衡後，將總脂粗品乾粉上柱，用水洗脫，收集紫外峰部分，得水相收集液；用體積比為2: I: 0.15的氯仿、甲醇、水混合液平衡矽膠柱，將水相收集液上柱後，用上述氯仿、甲醇、水混合液洗脫，TLC檢測收集洗脫液，得收集液；將收集液過Source RPC30柱，經水平衡，分別用80%甲醇分離和100%甲醇洗脫，214nm紫外監測，收集紫外洗脫峰，得反相收集液；將反相收集液濃縮、冷卻析晶，過濾、得單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉粗品；將單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉粗品用丙酮重結晶，得結晶固體；將結晶固體用水溶解後用0.22 μ m濾膜除菌過濾，冷凍乾燥、得半成品，經外包裝、裝箱得成品，純度達> 99.3%
[0047]實施例3原料豬腦的質量標準[0048]1.1 來源
[0049]符合國家食品衛生規定的肉聯廠，取材於檢疫合格的生豬，雌雄不限。
[0050]1.2質量標準
[0051]I)必須是具有檢疫合格證明的健康豬腦；
[0052]2)在新鮮狀態下於< _18°C冷凍保存一年；
[0053]3)豬腦外觀應完整、清潔，色澤新鮮，無異味，無汙染雜質；
[0054]4)豬腦剖開後觀察，應質地良好，無腫塊、萎縮、壞死、出血、炎症等病變。
[0055]5)應符合國家規定的食品衛生學和菌檢要求。
[0056]以上所述實施例僅僅是本發明的優選實施方式進行描述，並非對本發明的範圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通技術人員對本發明的技術方案作出的各種變形和改進，均應落`入本發明的權利要求書確定的保護範圍內。
【權利要求】
1.一種高純度單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉的製法，是以新鮮豬腦為原料經過提取步驟和純化步驟進行製備，其特徵在於: 所述提取步驟包括制丙酮粉步驟、組織總脂的抽提步驟、folch分配步驟、脫病毒步驟、酸水解病毒滅活步驟； 所述純化步驟包括脫鹽步驟、矽膠層析步驟、反相層析步驟、濃縮步驟、丙酮重結晶步驟、凍幹步驟。
2.如權利要求1所述的製法，其特徵在於， 所述制丙酮粉步驟為:將新鮮豬腦搗碎，於-5-15°C用丙酮處理，得沉澱，在70-90°C烘烤，製得丙酮粉； 所述組織總脂的抽提步驟為:將丙酮粉以體積比3: 1-1: 3的氯仿甲醇混合液提取2-5次，得抽提液； 所述folch分配步驟為:將抽提液用0.05-0.15體積的水進行folch分配，有機層棄去，保留水層，得上清液； 所述脫病毒步驟:將上清液加氫氧化鈉1-10重量份，於室溫下水解3-7小時，醋酸中和至PH7-9，用截留分子量為3000-50000的分子膜截留，得濾液； 所述酸水解病毒滅活步驟:將濾液用醋酸調節PH至3.5-4.5，於50-70水解8-12小時，水解液冷卻，用氫氧化鈉調 PH至中性，離心，乾燥，得總脂粗品乾粉。
3.如權利要求2所述的製法，其特徵在於， 所述制丙酮粉步驟為:將新鮮豬腦搗碎，於-10°C用丙酮處理，得沉澱，在80°C烘烤，製得丙酮粉； 所述組織總脂的抽提步驟為:將丙酮粉以體積比2: I的氯仿甲醇混合液提取3次，得抽提液； 所述folch分配步驟為:將抽提液用0.1體積的水進行folch分配，有機層棄去，保留水層，得上清液； 所述脫病毒步驟:將上清液加氫氧化鈉5重量份，於室溫下水解5小時，醋酸中和至PH8，用截留分子量為3000-50000的分子膜截留，得濾液； 所述酸水解病毒滅活步驟:將濾液用醋酸調節PH至4，於60°C水解10小時，採用巴氏滅菌法，水解液冷卻，用氫氧化鈉調pH至中性，離心，乾燥，得總脂粗品乾粉。
4.如權利要求2或3所述的任一製法，其特徵在於，所述純化步驟為: 所述脫鹽步驟:離子交換柱脫鹽，214nm紫外監測，電導率監測，水平衡後，將總脂粗品乾粉上柱，用水洗脫，收集紫外峰部分，得水相收集液； 所述矽膠層析步驟:體積比為3-9: 1-3: 0.1-0.3的氯仿、甲醇、水混合液平衡矽膠柱，將水相收集液上柱後，用上述氯仿、甲醇、水混合液洗脫，TLC檢測收集洗脫液，得收集液； 所述反相層析步驟:將收集液過反相層析凝膠柱，經水平衡，分別用80%甲醇分離和100%甲醇洗脫，214nm紫外監測，收集紫外洗脫峰，得反相收集液； 所述濃縮步驟:將反相收集液濃縮、冷卻析晶，過濾、得單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉粗品； 所述丙酮重結晶步驟:將單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉粗品用丙酮重結晶，得結晶固體； 所述凍幹步驟:將結晶固體用水溶解後用0.22m濾膜除菌過濾，冷凍乾燥、得半成品，經外包裝、裝箱得成品。
5.如權利要求4所述的製法，其特徵在於，所述純化步驟為: 所述離子交換柱為HIPREP?柱； 所述氯仿、甲醇、水混合液的體積比為3: I: 0.1 ； 所述反相層析凝膠柱為Source RPC30柱。
6.如權利要求1所述的製法，其特徵在於，所述新鮮豬腦包括如下步驟處理: 在新鮮狀態下於< _18°C冷凍保存一年； 豬腦外觀應完整、清潔，色澤新鮮，無異味，無汙染雜質； 豬腦剖開後觀察，應質地`良好，無腫塊、萎縮、壞死、出血、炎症等病變。
【文檔編號】C07H15/10GK103524572SQ201210354967
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2012年9月24日 優先權日:2012年9月24日
【發明者】蔡南桂 申請人:湖南賽隆藥業有限公司