脫細胞真皮基質的製備方法

2023-09-21 14:01:50

專利名稱：脫細胞真皮基質的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種脫細胞真皮基質的製備方法。
背景技術：
脫細胞真皮基質的製備方法很多，如單純緩衝液或培養液孵育法、高滲NaCl+SDS孵育法、單純酶消化法、酶消化+培養液孵育法、胰蛋白酶(Trypsin)消化+戊二醛交聯法、胰蛋白酶+TritonX-100浸泡法、Dispase/detergent(分離酶/TritonX-100)法、反覆凍融孵育法等。最佳的方法應該是能夠去除真皮內所有的細胞成分而最大限度保留真皮內膠原結構等的完整性。目前，效果肯定而最常用的方法為高滲NaCl+SDS孵育法、胰蛋白酶(Trypsin)/Dispase消化+戊二醛交聯法、胰蛋白酶+TritonX-100孵育法、Dispase/Detergent(分離酶/TritonX-100)孵育法。研究表明，Dispase較Trypsin能有效地去除皮膚的細胞成分，但兩者單獨酶處理時都不能充分去除所有的細胞和細胞碎片，必須聯合其它的方法。文獻報導製備脫細胞真皮中所用的化學製劑的殘留對脫細胞真皮上培養的角朊細胞或移植的表皮產生毒性作用；較高濃度(常用濃度為0.25％)的胰蛋白酶處理時，易破壞基底膜和真皮膠原纖維結構；用單純凍融法處理，需10次以上才能去除真皮內的細胞成分，但這又會破壞基底膜和真皮膠原。
三、技術內容技術問題本發明提供一種能夠保持基底膜和膠原成分完整且細胞成份脫淨率高的脫細胞真皮基質的製備方法。
技術方案本發明是一種脫細胞真皮基質的製備方法，其特徵在於將切取的斷層異體或異種皮膚浸入質量百分比為0.04％～0.06％的胰蛋白酶中於2℃～4℃消化16小時～20小時；將消化處理好的皮膚在無菌條件下揭去表皮，剩下的真皮在磷酸鹽緩衝液中持續震蕩洗滌，以去除分離的細胞；此後將其浸入0.04％～0.06％(質量百分比)的胰蛋白酶中於36.8℃～37.2℃消化30分鐘～60分鐘，然後用磷酸鹽緩衝液洗滌；最後，將其進行預冷，-70℃～-80℃冷凍和37℃～39℃下融化的凍融，如此反覆凍融不超過4次，再用磷酸鹽緩衝液充分洗滌後，置入含抗生素的磷酸鹽緩衝液中處理。
技術效果本發明採用低濃度(0.05％)胰蛋白酶消化加反覆凍融法處理3次，製備脫細胞真皮基質，此方法既能完全脫去細胞成分，又保留了真皮的正常膠原結構，而且避免了去垢劑等化學物質的殘留而影響角朊細胞的生長。經組織學、免疫組化染色、細胞培養和細菌培養證實，該法製備的真皮替代物是含基底膜的以膠原為主的細胞外基質，而且無菌、無細胞、無毒性，是一種簡便有效的方法，具體來說，此方法處理後的脫細胞真皮基質細胞成分去除乾淨，並含有完整的基底膜和膠原成分，不破壞組織結構，未採用化學製劑處理(如去垢劑)，避免了化學物質殘留而造成的不良影響，胰蛋白酶濃度低，反覆凍融次數少，避免了對基底膜和膠原結構的破壞，方法簡便，容易操作，實用性強。
四

圖1是處理後真皮基質組織學觀察圖。
圖2是處理後真皮基質免疫組化染色圖。
五、具體實施方案實施例1本發明是一種脫細胞真皮基質的製備方法，其特徵在於將切取的斷層異體或異種皮膚浸入質量百分比為0.04％～0.06％的胰蛋白酶中於2℃～4℃消化16小時～20小時；將消化處理好的皮膚在無菌條件下揭去表皮，剩下的真皮在磷酸鹽緩衝液中持續震蕩洗滌，以去除分離的細胞；此後將其浸入0.04％～0.06％(質量百分比)的胰蛋白酶中於36.8℃～37.2℃(該溫度的選擇應由人體正常體溫來確定，考慮到人體體溫的變化，將該溫度確定為36.8℃～37.2℃)消化30分鐘～60分鐘，然後用磷酸鹽緩衝液洗滌；最後，將其進行預冷，-70℃～-80℃冷凍和37℃～39℃下融化的凍融，如此反覆凍融不超過4次，在用磷酸鹽緩衝液充分洗滌後，置入含抗生素的磷酸鹽緩衝液中，本實施例採用3次反覆凍融，在置入含抗生素的磷酸鹽緩衝液中處理後再用磷酸鹽緩衝液洗滌2～4次。
實施例2本發明是一種脫細胞真皮基質的製備方法，其特徵在於將切取的斷層異體或異種皮膚浸入質量百分比為0.04％的胰蛋白酶中於2℃消化16小時；將消化處理好的皮膚在無菌條件下揭去表皮，剩下的真皮在磷酸鹽緩衝液中持續震蕩洗滌，以去除分離的細胞；此後將其浸入0.04％(質量百分比)的胰蛋白酶中於36.8℃(該溫度的選擇應由人體正常體溫來確定，考慮到人體體溫的變化，將該溫度確定為36.8℃)消化30分鐘，然後用磷酸鹽緩衝液洗滌；最後，將其進行預冷，-70℃冷凍和37℃下融化的凍融，如此反覆凍融不超過4次，在用磷酸鹽緩衝液充分洗滌後，置入含抗生素的磷酸鹽緩衝液中，本實施例採用3次反覆凍融，在置入含抗生素的磷酸鹽緩衝液中處理後再用磷酸鹽緩衝液洗滌2～4次。
實施例3本發明是一種脫細胞真皮基質的製備方法，其特徵在於將切取的斷層異體或異種皮膚浸入質量百分比為0.06％的胰蛋白酶中於4℃消化20小時；將消化處理好的皮膚在無菌條件下揭去表皮，剩下的真皮在磷酸鹽緩衝液中持續震蕩洗滌，以去除分離的細胞；此後將其浸入0.06％(質量百分比)的胰蛋白酶中於37.2℃(該溫度的選擇應由人體正常體溫來確定，考慮到人體體溫的變化，將該溫度確定為37.2℃)消化60分鐘，然後用磷酸鹽緩衝液洗滌；最後，將其進行預冷，-80℃冷凍和39℃下融化的凍融，如此反覆凍融不超過4次，在用磷酸鹽緩衝液充分洗滌後，置入含抗生素的磷酸鹽緩衝液中，本實施例採用3次反覆凍融，在置入含抗生素的磷酸鹽緩衝液中處理後再用磷酸鹽緩衝液洗滌2～4次。
實施例4本發明是一種脫細胞真皮基質的製備方法，其特徵在於將切取的斷層異體或異種皮膚浸入質量百分比為0.05％的胰蛋白酶中於3℃消化18小時；將消化處理好的皮膚在無菌條件下揭去表皮，剩下的真皮在磷酸鹽緩衝液中持續震蕩洗滌，以去除分離的細胞；此後將其浸入0.05％(質量百分比)的胰蛋白酶中於37℃(該溫度的選擇應由人體正常體溫來確定，考慮到人體體溫的變化，將該溫度確定為37℃)消化40分鐘，然後用磷酸鹽緩衝液洗滌；最後，將其進行預冷，-76℃冷凍和38℃下融化的凍融，如此反覆凍融不超過4次，在用磷酸鹽緩衝液充分洗滌後，置入含抗生素的磷酸鹽緩衝液中，本實施例採用3次反覆凍融，在置入含抗生素的磷酸鹽緩衝液中處理後再用磷酸鹽緩衝液洗滌2～4次。
權利要求
1.一種脫細胞真皮基質的製備方法，其特徵在於將切取的斷層異體或異種皮膚浸入質量百分比為0.04％～0.06％的胰蛋白酶中於2℃～4℃消化16小時～20小時；將消化處理好的皮膚在無菌條件下揭去表皮，剩下的真皮在磷酸鹽緩衝液中持續震蕩洗滌，以去除分離的細胞；此後將其浸入0.04％～0.06％(質量百分比)的胰蛋白酶中於36.8℃～37.2℃消化30分鐘～60分鐘，然後用磷酸鹽緩衝液洗滌；最後，將其進行預冷，-70℃～-80℃冷凍和37℃～39℃下融化的凍融，如此反覆凍融不超過4次，在用磷酸鹽緩衝液充分洗滌後，置入含抗生素的磷酸鹽緩衝液中處理。
2.根據權利要求1所述的脫細胞真皮基質的製備方法，其特徵在於在置入含抗生素的磷酸鹽緩衝液中處理後再用磷酸鹽緩衝液洗滌2～4次。
3.根據權利要求1所述的脫細胞真皮基質的製備方法，其特徵在於採用3次反覆凍融。
全文摘要
本發明是一種脫細胞真皮基質的製備方法，其特徵在於將切取的斷層異體或異種皮膚浸入質量百分比為0.04％～0.06％的胰蛋白酶中於2℃～4℃消化16小時～20小時；將消化處理好的皮膚在無菌條件下揭去表皮，剩下的真皮在磷酸鹽緩衝液中持續震蕩洗滌，以去除分離的細胞；此後將其浸入0.04％～0.06％(質量百分比)的胰蛋白酶中於36.8℃～37.2℃消化30分鐘～60分鐘，然後用磷酸鹽緩衝液洗滌；最後，將其進行預冷，－70℃～－80℃冷凍和37℃～39℃下融化的凍融，如此反覆凍融不超過4次，再用磷酸鹽緩衝液充分洗滌後，置入含抗生素的磷酸鹽緩衝液中處理。本發明具有方法簡便，容易操作，實用性強的優點。
文檔編號A61L27/00GK1522766SQ0315294
公開日2004年8月25日 申請日期2003年9月5日 優先權日2003年9月5日
發明者譚謙, 鄒忠桃, 譚 謙 申請人:東南大學