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因子vii融合多肽的製作方法

2023-09-21 11:01:35

專利名稱:因子vii融合多肽的製作方法
因子Vl I融合多肽本發明涉及具有延長半衰期的凝血因子VII (FVII)融合多肽,其中所述FVII多肽可被激活或者呈活化型。FVII是由肝臟產生的糖蛋白。FVII的活化型叫做FVIIa,在凝血中具有重要的作用。凝血過程是由於若干胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶之間的級聯相互作用實現的。這些酶中的大多數被合成為無活性的前體酶原,在限制性蛋白水解期間酶原經過切割產生其活化型。具體而言,FVII被激活為FVIIa,FVIIa結合組織因子,其為在某些細胞的膜上組成型表達的脂蛋白。已知包括FXa和FIXa在內的某些蛋白酶引起FVII激活為FVIIa。FVII 的激活涉及通過蛋白酶剪切Arg (152)和Ile (153)之間的肽鍵將單鏈的FVII轉化為雙鏈活化型(FVIIa)。Ile (153)和Asp (343)之間鹽橋的形成驅使從酶原樣到活化型的FVIIa轉化。當血管遭到破壞時,組織因子暴露於血液和循環中的FVIIa。隨後已結合的組織因子與FVIIa分別使因子IX (FIX)和因子X (FX)激活,形成FIXa和FXa。血友病患者很少有或沒有功能性凝血因子VIII或因子IX,並且一些患者產生了針對給予的因子的中和抗體,需要用旁路藥劑(bypassing agent)諸如因子Vila進行治療。儘管由於因子FVIIa的半衰期較短,利用因子VIIa進行預防在目前很麻煩並且昂貴,但是治療血友病的最佳方式仍是預防性的。為了將因子VIIa的血漿濃度在要求時間期間內保持高於閾值水平,需要重複給藥。開發了經修飾的FVII多肽,試圖解決半衰期短的問題。例如,W02006/018204中闡述通過在FVII多肽序列的140到152胺基酸之間插入來自FX或者FIX的激活肽來進行修飾的FVII多肽。然而,在W02006/018204中闡述的該修飾多肽不能被激活為FVIIa。因此,仍然需要用於在保留FVII被激活為FVIIa的能力的同時增加FVII和FVIIa的半衰期的方法。本發明人確證通過將來自FX或者來自FIX的活化肽序列加到FVII多肽的某個位置,產生了可被激活為FVIIa的融合FVII多肽,其中未激活的FVII多肽和活化FVII多肽(FVIIa)均具有延長的半衰期。本發明第一方面涉及包含FVII或FVIIa多肽或其同源物和FX或FIX活化肽或其同源物的多肽,其中FX或FIX活化肽在FVII或FVIIa多肽的C-末端融合。FVII/FVIIa多肽和FX/FIX活化肽的同源物是生物學活性同源物。FVII/FVIIa多肽同源物和活化肽同源物的「生物學活性」在以下定義。本文所用術語「FVII多肽」,指未激活的成熟FVII多肽。本文所用術語「FVIIa多肽」,指FVII多肽的活化型,即FVII多肽在Argl52-Ilel53處的單個肽鍵斷裂導致通過二硫鍵連接在一起的兩條多肽鏈的形成。因此,FVIIa多肽與FVII多肽具有相同的序列,但是FVIIa多肽由兩條多肽鏈而不是一條鏈形成。可將本發明的FVII或FVIIa多肽截短,然後在截短的多肽的C-末端融合FX或FIX活化肽。本文所用術語「截短的FVII或FVIIa多肽」,包括這樣的FVII或FVIIa多肽,其不包含在野生型或同源FVII或FVIIa多肽的C末端的起始1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基。本發明截短的FVII或FVIIa多肽具有生物學活性。亦可延長本發明FVII或FVIIa多肽,然後在延長多肽的C-末端融合FX或FIX活化肽。本文所用術語「延長的FVII或FVIIa多肽」,包括這樣的FVII或者FVIIa多肽,其另外包含在野生型或同源的FVII或FVIIa多肽的C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個胺基酸殘基。本發明延長的FVII或FVIIa多肽具有生物學活性。本發明FVII和FVIIa融合多肽分別與野生型FVII多肽和/或野生型FVIIa多肽相比具有延長的半衰期。「FIX活化肽」或「FX活化肽」,指當成熟的FIX或FX多肽分別從其無活性型(酶 原)轉化為其活性型時自成熟肽釋放的肽。可將FIX和FX活化肽截短。術語「截短的FIX肽」和「截短的FX肽」分別包括這樣的FIX肽或FX肽,其不包含在野生型或同源FIX或FX活化肽的C-末端和/或N-末端存在的起始1、2、3、4、5或6個胺基酸殘基。截短的FIX或FX活化肽具有生物學活性。亦可延長本發明FX或FIX活化肽。本文所用術語「延長的FX或FIX活化肽」包括這樣的FX或FIX活化肽,其包含在野生型或同源活化肽的N-末端和/或C-末端的另外1、2、3、4、5、6或更多個胺基酸殘基。延長的FVII或FVIIa多肽具有生物學活性。野生型FVII多肽和野生型FVIIa多肽的序列如SEQ ID NO: I所示。該序列代表無前導序列的成熟FVII或FVIIa多肽。SEQ ID NO: I中的三字母表示「GLA」意即4_羧基穀氨酸U -羧基穀氨酸)。野生型FIX活化肽的序列在SEQ ID NO: 2中闡述。野生型FX活化肽的序列在SEQID NO:3中闡述。在本發明的一個實施方案中,本發明涉及這樣的多肽,其包含SEQ ID NO: I所述的胺基酸序列的第 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個到 397、398、399、400、401、402、403、404、405或406個殘基或其同源物,所述活化肽包含SEQ ID N0:2所述胺基酸序列的第1、2、3、4、5或6個到30、21、32、33、34或35個殘基或其同源物,或SEQ ID NO: 3所述胺基酸序列的第
1、2、3、4、5或6個到47、48、49、50、51或52個殘基或其同源物。因此,本發明包括以下多肽序列,其為以SEQ ID N0:1的第1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 位殘基中的任一個開始並以 SEQ ID NO: I 的第 397、398、399、400、401、402、403、404 或405位殘基中的任一個結束的多肽序列,其在C末端與活化肽融合,所述活化肽以SEQ IDN0:2的第1、2、3、4、5或6位殘基中的任一個開始並以SEQ ID NO:2的第30、31、32、33、34或35位殘基中的任一個結束或以SEQ ID N0:3的第1、2、3、4、5或6位殘基中的任一個開始並以SEQ ID N0:3的第47、48、49、50、51或52位殘基中的任一個結束。本文術語「多肽」概括性地指通過肽鍵連接在一起的多個胺基酸殘基。它與肽、寡肽、寡聚物或蛋白質可互換使用並意思相同,並包括糖蛋白及其衍生物。術語「多肽」還意欲包括同源物,其中所述同源物與參考蛋白保持相同(或更高)的生物學活性。在本發明中,FVII或FVIIa多肽的同源物與在SEQ ID NO: I中所述的野生型FVII或FVIIa多肽具有相同或更高生物學活性。在本文中,術語同源物包括變體。
野生型FVIIa的生物學活性是該多肽將其底物FX轉變為活性FXa的能力。當本發明多肽是FVII多肽時,在可測定其生物學活性之前必須首先將其激活為FVIIa。FVIIa多肽的生物學活性可用如下的「體外蛋白水解測定」來確定
在含有0.1 M NaCl、5 mM CaCl2和I mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的100微升50 mMHepes (pH 7.4)中,將因子Vila (10 nM)和因子X (0.8 U M)於微滴板中孵育15分鐘。然後通過加入含有0. I M NaCl、20 mM EDTA和I mg/ml牛血清白蛋白的50微升50 mM Hepes(pH 7. 4)來終止FX切割。通過加入終濃度為0. 5 mM的顯色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-對硝基苯胺(S-2765,Chromogenix,瑞典)來測量產生的FXa的量。在SpectraMax (TM) 340讀板儀(Molecular Devices, USA)中連續測量其在405 nm處的吸光度。將在10分鐘期間顯 現的吸光度減去不含FVIIa的空白孔的吸光度後,用於計算同源FVIIa和野生型因子FVIIa(如SEQ ID NO: I中所述)的蛋白水解活性的比率
比率=(A405 nm因子VIIa同源物)/(A405 nm SEQ ID NO: I中所述的因子VIIa多肽)在本測試中,將高於0.8 (任選包括約為或高於1、1. 25和1.5)的比率定義為本發明生物活性多肽。在一個實施方案中,本發明的FVII或FVIIa多肽延伸至與SEQ ID NO: I中定義的野生型FVII或FVIIa多肽具有至少80%同源性的胺基酸序列。在另外的實施方案中,所述序列可與SEQ ID NO: I中的野生型FVII或FVIIa多肽胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 4% 或 99. 5% 的同源性 / 同一性。眾所周知,胺基酸水平的同源性一般是就胺基酸的相似性或同一性而言。可通過目測和數學計算來測定序列同源性百分比。用可公開獲得的計算機軟體例如BLAST或ALIGEN,可以以多種方式來實現用於測定胺基酸序列同一性百分比目的的比對。例如,可用XBLAST程序來進行蛋白質檢索,以獲得與本發明蛋白分子同源的胺基酸序列。本領域技術人員可確定用於測量比對的合適的參數,包括在所比較的序列全長範圍內的最大比對所需的任何算法。本發明FVIIa多肽的同源物與SEQ ID NO: I的野生型FVIIa多肽具有相同或更高的生物學活性。一旦FVII多肽被激活為FVIIa多肽,則本發明FVII多肽的同源物與SEQ ID NO: I的野生型FVIIa多肽具有相同或更高的生物學活性。本發明變體多肽包括在US2006/0166915、W002/077218、US2003/0100075、US2003/0130191 和 W02004/029090 中公開的所有變體多肽序列,這些公開內容通過弓I用全部併入本文。在一個實施方案中,本發明FIX或FX活化肽延伸至分別與SEQ ID N0:2或N0:3中的野生型FIX或FX活化肽有至少80%同源性的胺基酸序列。在另外的實施方案中,所述序列與所述野生型FIX或FX活化肽胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 4% 或 99. 5% 的同源性 / 同一性。在本發明背景下FIX或FX活化肽的生物活性,是提高本發明融合多肽的血漿半衰期高於添加活化肽之前FVII或FVIIa多肽血漿半衰期的能力。融合蛋白半衰期比添加活化肽之前的FVII或FVIIa多肽半衰期長大約或超過5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、100%或 200%。術語血楽;「半衰期」是指使對於特定蛋白而言,僅剩餘初始蛋白庫(protein pool)的50%所花的時間。半衰期可通過ELISA測量。
本發明FVII或FVIIa多肽或FIX或FX肽的同源物可為(i)其中一個或更多個胺基酸殘基被保守的或非保守的胺基酸殘基(優選保守的胺基酸殘基)取代的多肽,且所述取代的胺基酸殘基可由或可不由遺傳密碼編碼;或(ii)其中一個或更多個胺基酸殘基包括取代基的多肽。優選具有以上定義的多肽胺基酸序列的同源物,其中若干個例如5-10、1-5、1_3、
2、1或沒有胺基酸殘基以任意組合被取代、缺失或添加。其中尤其優選沉默取代、缺失和添加,其不改變本發明蛋白的性質和活性。在這方面還尤其優選保守取代。因此,胺基酸甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸(含有脂肪族側鏈的胺基酸)經常可以彼此取代。其中可能的取代優選用甘氨酸和丙氨酸來相互取代(因為它們有相對短的側鏈)和用纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸相互取代(因為它們有較大的疏水脂肪族側鏈)。可經常彼此取代的其它胺基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(含有芳香族側鏈的胺基酸);賴氨酸、精氨酸和組氨酸(含有鹼性側鏈的胺基酸);天冬氨酸和穀氨酸(含有酸性側鏈的胺基酸);天冬醯胺和穀氨醯胺(含有醯胺側鏈的胺基酸);半胱氨酸和甲硫 氨酸(含有含硫側鏈的胺基酸)。這種類型的取代通常被稱為「保守」或「半保守」胺基酸取代。亦可相對於用於以上提及的融合多肽的胺基酸序列進行胺基酸缺失。因此,例如,對多肽的活性沒有實質影響或至少不會消除所述活性的胺基酸可缺失。所述缺失可為有利的,因為可降低多肽的全長和分子量但同時保持活性。這可使特定目的所需的多肽的量降低一例如可降低劑量水平。亦可相對於以上融合多肽的序列來進行胺基酸插入。可實施插入以改變本發明的物質的性質(例如有助於鑑定、純化或表達,其如以上關於融合多肽所解釋的)。可用任何適當的技術例如通過用定向誘變來使相對於以上a)中所給的序列發生
胺基酸變化。應該了解,可用天然存在的或非天然存在的胺基酸來進行本發明範圍內的胺基酸取代或插入。不管使用的是天然還是合成的胺基酸,優選只存在L-胺基酸。在本發明又一實施方案中,本發明FVII或FVIIa多肽延伸至相對於SEQ ID NO: I的胺基酸序列包含一個或更多個取代的同源物,其中所述取代為用選自以下位置的任何一個或更多個胺基酸取代對應於SEQ ID NO: I胺基酸位置的第172、173、175、176、177、196、197、198、199、200、203、235、237、238、239、240、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、297、299、319、320、321、327、341、363、364、365、366、367、370 或 373 位。本文所用術語「任何一個或更多個胺基酸」是指與SEQ ID NO: I中胺基酸不同的一個或更多個胺基酸。這包括但不限於可由多核苷酸編碼的胺基酸。在一個實施方案中,不同的胺基酸呈天然的L-型,可由多核苷酸編碼,具體實例是L-半胱氨酸(Cys)。在以下實施方案中,表述「至少」是指僅指定的胺基酸被取代,或除分子中一個或更多個其它胺基酸發生變化外,還有特定胺基酸被取代。在以下實施方案中,關於SEQ ID NO: I的胺基酸取代如下字母代表在SEQ IDNO: I位置中天然存在的胺基酸,後面的數字代表在SEQ ID NO: I中的位置。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少G237被選自Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少T238被選自Ala、Gly、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys 或 Ser的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少T239被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys 或 Ser的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少Q286被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個或更多個胺基酸取代。
在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少L287被選自Gly、Ala、Val、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少L288被選自Gly、Ala、Val、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少D289被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少R290被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Cys> Thr 或 Ser的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少A292被選自Gly、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少T293被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys 或 Ser的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少A294被選自Gly、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少L295被選自Gly、Ala、Val、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少L297被選自Gly、Ala、Val、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少V299被選自Gly、Ala、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少M327被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少K341被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或V IIa多肽為同源物,其中至少S363被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys 或 Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少W364被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少G365被選自Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少Q366被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少Q366被選自Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser 的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少V172被選自Gly、Ala、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少N173被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少A175被選自Gly、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser> Val 或 Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少Q176被選自Gly、Ala、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、His、Lys> Arg、Cys> Ser> Val 或 Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少L177被選自Gly、Ala、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser> Val 或 Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少D196被選自Gly、Ala、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser> Val 或 Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少K197被選自Gly、Ala、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Arg、Cys> Ser> Val 或 Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少1198被選自Gly、Ala、Leu、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser> Val 或 Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少K199被選自Gly、Ala、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Arg、Cys> Ser> Val 或 Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少N200被選自 Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少N203被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少V235被選自Gly、Ala、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少N240被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少D319被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少S320被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys 或 Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少P321被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe、Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys、Arg、Cys> Ser 或Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少G367被選自Ala、Val、Leu、lie、Phe、Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少T370被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe、Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys 或 Ser的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少H373被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe、Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個或更多個胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少i) L287被選自Thr或Ser的胺基酸取代,ii) A294被選自Thr或Ser的胺基酸取代,和iii) M298被Lys取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少i) L287被選自Thr或Ser的胺基酸取代,ii) A294被選自Thr或Ser的胺基酸取代,iii) M298被Lys取代,和iv) E296被選自lie、Leu、Thr或Val的胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少i) L287被選自Thr或Ser的胺基酸取代,ii) A294被選自Thr或Ser的胺基酸取代,iii) M298被Lys取代,和iv) V185被選自Asp或Glu的胺基酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為同源物,其中至少i) L287被 選自Thr或Ser的胺基酸取代,ii) A294被選自Thr或Ser的胺基酸取代,iii) M298被Lys取代,和iv) E296被選自lie、Leu、Thr或Val的胺基酸取代,和v) V158被選自Asp或Glu的胺基酸取代。關於SEQ ID NO: I,以下闡述的用於胺基酸取代的術語如下
第一個字母代表在SEQ ID NO: I位置中天然存在的胺基酸。後面的數字代表在SEQ IDN0:1中的位置。第二個字母代表取代天然胺基酸的不同的胺基酸。實例為K197A-FVII,其中SEQ ID NO: I中197位置的賴氨酸被丙氨酸取代。在本發明又一實施方案中,因子VII或VIIa多肽為選自以下的多肽
¥ 151<0;12^71-\21148^£2%1 ^12 K-FVIIA; V15KD^.28TT/\294S^E296-V/M2l K-F¥]iA:
¥ 158D;L2 T/A294S^296L;M29KK-FVIIA; V15fSD;12K T/A294S/E296T^I298K-FVlIA: Vl5KDL2^7T^A294Tl;2%i-;M29SIC-FVilA; V15XD1. 2K T^A294T ¢296 V/M2 WK^F V i I A;
V15^D^1,2K7T'A2MFM29KK-PVIiA; V15K|).1,2K7T/A294T:T2%T,M29RK-FV1I A:
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V15X E/L,2K T. A294S4; 2961/M 29KK-FV11 A: V15KHI,2XT1'A294S/H2%V,;M 29XK-FV11 A:V15^Ei^H T^2Q4SB2%L;M29^K-FVIiA; V15KE/L2}T;M2t K-FVIiA:Vt58K/l.2HTr, A2941;E296|/M29KK-FVIIA; V15KK1 ^XT |VA94T>1i2 )6 V M 29SK-F V11 A;
V15S E;L2H T/A2 MT/E2%I, ^I29KK-F V11 A; V15KE:1 28 T^2 T;II296T/M2* K-F VIIA:\a5KE/L2l< S'V%294S1i29fti/M9KK4--VIIA; VI5KE/L2 S/A2y4S^E2%V;M2sIXIC-FViiA;
V15KE/i.2K S/A294S^E2961^/M 29HK-FV I! A; V 15HE/1^K7SA294S/B296T/M29HK.FV 11 A;
V15Klv:I.2N S/A294T/H2Wi'>l2c K-FVIIA; V15t^i:/L2K7S'/\294T'E2%V.:M2卵K-FVIW:\^5 1/1.2 75^2941^^-2%1/^2< ^1-'¥11/\, V15KH1 .IKIS-ASWlVHZWVr/MZWK-FVIIA,
權利要求
1.一種多肽,所述多肽包含因子VII (FVII)或因子Vila (FVIIa)多肽或其同源物和因子X (FX)或因子IX (FIX)活化肽或其同源物,其中所述FX或FIX活化肽在所述FVII或FVIIa多肽的C末端融合。
2.權利要求I的多肽,其中所述FVII或FVIIa多肽包含SEQID NO: I所述胺基酸序列或其同源物的第 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 到 397、398、399、400、401、402、403、404、405 或406位殘基,並且所述活化肽包含SEQ ID NO:2所述胺基酸序列或其同源物的第1、2、3、4、5或6到30、31、32、33、34或35位殘基或SEQ ID NO:3所述胺基酸序列或其同源物的第I、2、3、4、5 或 6 到 47、48、49、50、51 或 52 位殘基。
3.權利要求I或權利要求2的多肽,其中所述FVII或FVIIa多肽相對於SEQID NO: I的胺基酸序列包含一個或更多個取代,其中所述取代是被選自對應於SEQ ID NO:l的胺基酸位置的第 172、173、175、176、177、196、197、198、199、200、203、235、237、238、239、240、 286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、297、299、319、320、321、327、341、363、364、365、366、367、370或373位的任何一個或更多個胺基酸的取代。
4.權利要求1-3中任一項的多肽,其中所述多肽為分離多肽和/或為重組多肽。
5.—種核酸序列,其編碼權利要求1-4中任一項的多肽。
6.—種載體,其包含權利要求5的核酸。
7.—種宿主細胞,其包含權利要求5的核酸或權利要求6的載體。
8.—種產生FVII多肽的方法,所述方法包括在促進所述多肽表達的條件下培養權利要求7的宿主細胞,並從培養物中回收所表達的多肽。
9.權利要求8的方法,所述方法還包括純化所表達的多肽的步驟。
10.權利要求9的方法,其中所述純化步驟包括激活所述FVII多肽。
11.一種藥物組合物,其包含權利要求1-4中任一項的多肽。
12.權利要求1-4中任一項的多肽或權利要求11的藥物組合物,其用於藥物。
13.權利要求1-4中任一項的多肽在製備用於治療凝血缺陷的藥物中的用途。
14.權利要求13的用途,其中所述凝血缺陷是A型血友病出型血友病;因子XI缺陷和因子VII缺陷;包括手術或其它組織損傷出血在內的過量出血或不必要的出血;或因血小板功能缺陷、血小板減少症或血管性血友病而導致的出血。
15.一種治療與凝血缺陷相關病況的方法,所述方法包括給予受試者權利要求1-4中任一項的多肽或權利要求11的藥物組合物。
全文摘要
本發明涉及具有延長的半衰期的因子VII(FVII)融合多肽,其中所述FVII多肽可被激活或處於活化型。
文檔編號C12N15/62GK102753575SQ201180007544
公開日2012年10月24日 申請日期2011年1月27日 優先權日2010年1月28日
發明者E.珀森 申請人:諾沃—諾迪斯克保健股份有限公司

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