一種檢測微藻含油量的方法
2023-09-22 01:22:10 2
專利名稱：一種檢測微藻含油量的方法
技術領域：
本發明涉及產脂微藻，具體地說是一種檢測微藻含油量的方法。
背景技術：
作為一種重要的可再生資源，藻類具有分布廣泛、生物量大、光合作用效率高、環境適應能力強、生長周期短、產量高等突出特點，藻類尤其是微型藻類的進一步開發利用， 將提供新的資源來源。微藻作為能源原料的潛力巨大，其細胞中含獨特的初級或次級代謝產物，化學成分複雜，太陽能轉化效率可達到3. 5%，是生產藥品、精細化學品和新型燃料的潛在資源。從微藻中得到的脂肪酸可轉化成脂肪酸甲酯，即生物柴油；在沸石催化劑的作用下，微藻通過熱化學轉化可生產出汽油型燃料；生長在海水中的綠藻，能積累大量游離的甘油以平衡環境中的鹽濃度，其甘油的含量可佔自身乾重的85 %。另外，隨著全球石油能源短缺問題日益突出，微藻因具有光合作用效率高、含油量高、生長周期短、可減排CO2、可利用有機廢水、不與人爭糧地水等獨特優勢，而被認為是發展潛力巨大、最有可能替代石油的生物能源原料，微藻生物柴油開發方興未艾。微藻已經成為能源等領域研究開發的熱點，而研究開發的首要問題是獲得產脂性狀穩定、適應環境能力強的高效產脂微藻良種。儘管已有一些微藻藻株用於研究和中試規模生產，但仍存在產脂量不穩定、易汙染、適應環境能力差等問題，難以用於規模化生產。因此，通過探索創新相關的技術和方法，建立產脂微藻的優良品系高效篩選技術體系，通過對自然界藻種及現有種質庫藻種進行篩選和遺傳改良，獲得遺傳性狀穩定、生長速度快、抗逆性強、適合於規模化培養的高產脂微藻良種，已成為產脂微藻高效開發利用的迫切需求。目前產油微藻篩選主要指標是微藻的含油量和生物量，而檢測微藻含油量的方法主要有1)傳統的抽提法；幻染色螢光比色法；；3)氣相色譜法等。其中，傳統抽提法和色譜法都費時費力，而且對儀器設備要求較高；染色比色法比較省時，但是只能測定微藻油脂的相對含量。因此，目前急需一種快速、簡潔而且可以估算油脂含量的微藻油脂測定方法。
發明內容
本發明的目的活體檢測微藻油脂的含量，使培養過程和油脂檢測融為為一體，過程簡單方便，是簡單高效的定量檢測方法。一種檢測微藻含油量的方法，1)取進行微藻培養的藻液，計算藻液中微藻細胞的數量濃度C(個cell/ml)；2)微藻油脂觀察採用BODIPY 505/515染色螢光記錄法；使用有機溶劑二甲亞碸溶解BODIPY 505/515染料並配製成10 20mM的母液；染料使用液濃度為1 2mM，染色 1 aiiin後，使用激發波長488nm激發光，在螢光顯微鏡下觀察並拍照記錄單細胞油脂積累變化情況；根據照片記錄單細胞油滴顆粒數目(η)，並測定油滴直徑(d)，按照球體積公式計算每個油滴體積，每個細胞油脂含量為所有油滴體積的加和；
根據微藻數量濃度C和單個細胞油脂含量計算單位體積藻液油脂含量Vt = CV, C 為扁藻細胞濃度，V為單細胞油脂體積，Vt單位體積油脂含量。細胞計數法計算微藻細胞的數量；採用魯哥氏液固定微藻的方法；在光學顯微鏡下利用血球計數儀記錄各個時期微藻的細胞數目進而計算藻液濃度。藻細胞染色後在488nm激發波長下，使用雷射掃描共聚焦顯微鏡每隔 0. 01-0. 5 μ m對藻細胞斷層掃描並拍照記錄，後經3D合成軟體重建油滴3D圖片表明油滴近似正球體；採用顯微鏡照相軟體測定油滴顆粒直徑。1)以藻液中微藻細胞的培養時間為橫坐標，以藻液中微藻細胞的數量濃度C為縱坐標，建立微藻生長動力學曲線；2)根據微藻生長曲線和不同時期單細胞油脂體積，按上述試驗方法計算各個培養時期單位體積藻液油脂含量Vt的變化，進而確定最佳產油時期，為實際生產提供一種簡單、便捷、高效、低廉的檢測油脂含量的方法。實驗操作1、微藻培養。取處於對數生長期、活力旺盛的微藻作為實驗藻種。設置一定的生長培養條件(溫度、鹽度、營養鹽濃度等等)或培養方式(自養、異養等等)，研究並繪製微藻生長動力學曲線。本實驗主要研究了亞心型扁藻在一個生長周期中油脂積累的情況。2、細胞計數法計算微藻細胞的數量。採用魯哥氏液固定微藻的方法。在光學顯微鏡下利用血球計數儀記錄各個時期微藻的細胞數目進而計算藻液濃度。3、微藻油脂觀察採用BODIPY 505/515染色螢光記錄法。使用有機溶劑二甲亞碸溶解BODIPY 505/515染料並配製成IOmM的母液。染料使用液濃度為ImM，染色Imin後，使用488nm激發波長，在螢光顯微鏡下觀察並拍照記錄單細胞油脂積累變化情況。4、測量並記錄單細胞油滴顆粒數目(η)和直徑(d)，採用球體積公式計算單細胞油脂體積戶π of/6 + π《/6 +…π f/6。從而結合微藻生長曲線計算單位培養液中油脂的總量。實驗結果能夠快速、清晰地檢測單細胞油滴積累情況，包括油滴體積大小和數目多少的變化。同時結合微藻生長曲線，通過簡單的數學運算即可計算出各個培養時期單位體積培養液中油脂含量的變化。本發明的優點1.檢測快速簡單。本發明將微藻培養與檢測方法融為一體，過程簡單方便，即通過活體檢測測定微藻油脂含量。需要時間較常規方法明顯減少，單個樣品檢測只需要2分鐘。2.可以近似定量檢測單位體積油脂的含量。螢光顯微鏡觀察並測定油滴數目(η) 和油滴直徑(d)後，採用戶π ￠^/6 + π d^/6 +…π c/n3/6計算單個微藻的油滴體積， 從而通過生長曲線計算單位培養液中油脂的總量。3.成本低。檢測過程不需要高端的儀器設備和耗材，因此較常規方法成本低廉。4.應用效果好。實驗證明，BODIPY 505/515較尼羅紅更能清晰的反應出油滴的輪
廓和數量。
圖1為扁藻可見光㈧與螢光染色(B)圖片對比；圖2為扁藻生長曲線；圖3為單細胞油脂體積變化；圖4為單位體積藻液油脂含量變化。
具體實施例方式實施例材料與方法1)實驗藻種實驗用藻種亞心型扁藻(Platymonas subcordiformis)，取自中國水產科學院-黃海水產研究所微藻培養室。2)培養條件實驗用基本培養液配方為NaNO3 (120mg/L)，KH2PO4 (4mg/L)， FeC6H5O7 (5mg/L)，維生素B1 (200 μ g/L)，維生素B12 (200 μ g/L)。微藻培養採用室內恆溫培養法，在光化培養箱(G)CZ智能型，寧波江南儀器廠)中進行。設置光照強度為 120 μ mo 1 · πΓ2 · S、溫度 20 士 1°C，光周期 12h (L) 12h (D)。3)實驗方法3. 1)實驗設計在上述培養條件下，取對數生長期藻種作為實驗材料接種至上述培養液中，初始接種密度為2. 375士0. 916(X104cell/ml)。設置3個平行樣，測定扁藻生長曲線和油脂積累情況。3. 2)生長測定每隔2d從各實驗組中取ImL藻液，加1 2滴魯哥氏液固定藻細胞，以血球計數板在顯微鏡下計數藻細胞。每個樣品計數3次，3次的計數結果相比較標準偏差不超過20%，否則要進行第4次計數。3. 3)螢光染色親脂性螢光染料BODIPY 505/515溶解於有機溶劑(二甲亞碸)配製10mM/L的母液。使用時，取0. 1 μ L母液注入ImL藻液中染色Imin左右。使用螢光顯微鏡(Nikon Eclipse 80i)在藍色激發光G88nm)下隨機選取6個視野觀察並拍照記錄細胞內油脂顆粒分布情況。3. 4)油脂含量測定藻細胞染色後在488nm激發波長下，使用雷射掃描共聚焦顯微鏡(Nikon ECLIPSE TE 2000-U)每隔0. 5 μ m對藻細胞斷層掃描並拍照記錄，後經尼康 EZ-Cl軟體處理系統，重建油滴3D圖片表明油滴近似正球體。採用尼康NIS-elements BR 軟體測定油滴顆粒直徑，根據球體積公式計算每個油滴體積，每個細胞油脂含量為所有油滴體積的加和戶π + π這3/6 +…π義/6 (其中d為油滴直徑，η為單細胞油滴數)。根據扁藻生長曲線和單個細胞油脂含量計算單位體積藻液油脂含量Vt = CV (C為扁藻細胞濃度，V為單細胞油脂體積，Vt單位體積油脂含量)。4)數據方法實驗所有數據均表示為平均值士標準差(mean士 SD)，採用SPSS 17. 0 統計軟體進行單因子方差分析(One-Way AN0VA)和組間多重比較分析(LSD AN0VA)，P <0. 05為差異顯著水平。試驗結果1)扁藻可見光與螢光染色對比經親脂性螢光染料BODIPY 505/515染色後，在488nm激發波長下扁藻細胞內油脂顆粒可被清晰標記出來。使用雷射掃描共聚焦顯微鏡每隔0.5μπι對藻細胞斷層掃描並拍照記錄，後經尼康EZ-Cl軟體處理系統，重建油滴3D圖片表明油滴近似正球體。採用尼康NIS-elements BR軟體測定圖IB中油滴顆粒直徑，波動範圍為0. 758士0. 079
1.598 士0. 206 μ m,根據球體積公式計算每個油滴體積，波動範圍為0. 066 士0. 011 μ m3
2.866 士 0. 868 μ m3·2)扁藻生長曲線取對數生長期的扁藻接種於上述(3. 1)培養基中，初始接種濃度為 2. 375士0. 916(X104cell/ml)。隨著培養時間，扁藻細胞經過短暫的延遲期至第4天進入對數期，細胞濃度迅速增加，至22天達到最大值之後進入平臺期。在各時間點，取培養藻液 lml，血球計數板計數，計算各時間點細胞密度並繪製生長曲線如表1和圖2所示。表1扁藻細胞濃度
權利要求
1.一種檢測微藻含油量的方法，其特徵在於1)取進行微藻培養的藻液，計算藻液中微藻細胞的數量濃度C(個cell/ml)；2)微藻油脂觀察採用BODIPY505/515染色螢光記錄法；染料使用液濃度為1 2mM， 染色1 aiiin後，使用激發波長488nm激發光，在螢光顯微鏡下觀察並拍照記錄單細胞油脂積累變化情況；根據照片記錄單細胞油滴顆粒數目(η)，並測定油滴直徑(d)，按照球體積公式計算每個油滴體積，每個細胞油脂含量為所有油滴體積的加和；根據微藻數量濃度C和單個細胞油脂含量計算單位體積藻液油脂含量Vt = CN, C為扁藻細胞濃度，V為單細胞油脂體積，Vt單位體積油脂含量。
2.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於使用有機溶劑二甲亞碸溶解BODIPY 505/515染料並配製成10 20mM的母液。
3.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於細胞計數法計算微藻細胞的數量；採用魯哥氏液固定微藻的方法；在光學顯微鏡下利用血球計數儀記錄各個時期微藻的細胞數目進而計算藻液濃度。
4.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於藻細胞染色後在488nm激發波長下，使用雷射掃描共聚焦顯微鏡每隔0. 01-0. 5 μ m對藻細胞斷層掃描並拍照記錄，後經3D圖像合成軟體重建油滴3D圖片，表明油滴近似正球體；採用顯微鏡照相軟體測定油滴顆粒直徑。
5.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於1)以藻液中微藻細胞的培養時間為橫坐標，以藻液中微藻細胞的數量濃度C為縱坐標，建立微藻生長動力學曲線；2)根據微藻生長曲線和不同時期單細胞油脂體積，按權利要求1所述方法計算各個培養時期單位體積藻液油脂含量Vt的變化。
全文摘要
本發明涉及產脂微藻，具體地說是一種檢測微藻含油量的方法，1)取進行微藻培養的藻液，計算微藻細胞的數量濃度C；2)微藻油脂觀察採用BODIPY 505/515染色螢光記錄法；染料使用液濃度為1～2mM，染色1～2min後，使用激發波長488nm激發光，在螢光顯微鏡下觀察並拍照記錄單細胞油脂積累變化情況；根據照片記錄單細胞油滴顆粒數目(n)，並測定油滴直徑(d)，按照球體積公式計算每個油滴體積，每個細胞油脂含量為所有油滴體積的加和；根據微藻數量濃度C和單個細胞油脂含量計算單位體積藻液油脂含量Vt＝CV，C為扁藻細胞濃度，V為單細胞油脂體積，Vt單位體積油脂含量。
文檔編號G01N15/10GK102565012SQ201010620678
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月24日 優先權日2010年12月24日
發明者葉乃好, 張曉雯, 徐東 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所