一種安培型生物傳感器電極及其製備方法

2023-09-21 18:47:55

專利名稱：：一種安培型生物傳感器電極及其製備方法
技術領域：
：本發明涉及一種安培型生物傳感器電極及其製備方法，尤其涉及一種靜電紡絲製備複合電子媒介體的活化層的方法。
背景技術：
：電化學生物傳感器中，生物敏感膜是關鍵部分，決定了傳感器的質量與功能。基於氧化還原蛋白質和酶(以下統稱為酶)的電化學傳感器一直是生物傳感器研究的主流。根據酶與電極的電子轉移機理，大致可將電化學酶傳感器劃分為三代。以葡萄糖氧化酶電極為例，第一代電化學傳感器以溶解氧作為酶與電極之間的電子通道；第二代以人工合成的電子媒介體作為代替溶解氧作為電子通道；第三代則既不需要氧分子，也不需要電子媒介體，而是利用酶自身與電極間的直接電子轉移來完成信號轉換。第一代傳感器中相應信號與氧分壓或溶解氧關係較大，響應時間較長，靈敏度不高，且易受到抗壞血酸、尿酸、乙醯氨基酚等電活性物質的幹擾。人工媒介體的採用降低了傳感器對氧分壓或溶解氧的依賴以及電活性物質的幹擾，使傳感器的工作壽命延長。電子媒介體可以被溶解在試樣的溶液中或固定於生物敏感膜內。前者須向試樣中不斷加入媒介體，不利於電極的反覆使用。後者在測量時無須加入其它試劑，被稱為無試劑傳感器，提高了傳感器的響應穩定性。第三代傳感器則已完全排除了外界的幹擾，但由於理論的不成熟性，目前尚處於研究探索中。有多種方式可將電子媒介體固定於生物敏感膜內。Carolan等將二茂鐵與過氧化物酶偶聯以實現酶活性中心與電極的電子傳遞(N.Carolan，R.J.Forster,C.O'Fagain."Covalentattachmentofferrocenetosoybeanperoxidaseglycans:Electrontransfermediationtoredoxenzymes",BioconjugateChem.，2007,18:524-529)。Garcia等將二茂鐵偶聯於殼聚糖側基，而後將這種修飾過的殼聚糖與酶共沉積到電極表面(A.Garcia,C.Peniche國Covas,B.Chico,B.K.Simpson,R.Villalonga."Ferrocenebranchedchitosanfortheconstructionofareagentlessamperometrichydrogenperoxidebiosensor",Macromol.Biosci.2007,7，435-439)。US6720164和US552551將電子媒介體包裹於電極材料中，確保了酶電極的反覆使用性。靜電紡絲纖維膜是目前受關注的一種酶固定化載體，靜電紡絲也是製備複合材料的一種常見方法。
發明內容本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種安培型生物傳感器電極及其製備方法。安培型生物傳感器電極包括基底電極和活化層，在基底電極上設有活化層，特徵是1)活化層由丙烯腈共聚物和電子媒介體複合納米纖維膜和固定的氧化還原酶構成。2)活化層的納米纖維膜由靜電紡絲法製備。■3)丙烯腈共聚物中，共聚單體為丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來酸酐、衣康酸或甲基丙烯酸縮水甘油酯，共聚單體佔丙烯腈共聚物摩爾百分數為520%，丙烯腈共聚物的粘均分子量為3萬10萬，電子媒介體佔丙烯腈共聚物的質量分數為5%80%。4)電子媒介體為二茂鐵、卟啉、鐵卟啉或鋅臥啉。所述的氧化還原酶為過氧化氫酶、過氧化物酶、細胞色素、葡萄糖氧化酶、膽固醇氧化酶、乙醇脫氫酶或漆酶。安培型生物傳感器電極的製備方法包括如下步驟1)將含有丙烯酸、甲基丙烯酸或衣康酸的丙烯腈共聚物與電子媒介體共溶解於二甲基甲醯胺中，其中丙烯腈共聚物質量分數為2%15%，電子媒介體的質量佔丙烯腈共聚物的5%80%。以鉑電極、金電極或玻碳電極為接收板，當電壓為1020千伏、擠出速率為0.53.0毫升/小時、接收距離為1020釐米時收集纖維膜，紡絲時間持續210小時，得到沉積有丙烯腈共聚物和電子媒介體複合納米纖維膜的電極。2)將沉積有丙烯腈共聚物和電子媒介體複合納米纖維膜的電極表面浸入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀醯亞胺的緩衝溶液中，其中l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的濃度為520毫克/毫升，N-羥基琥珀醯亞胺的濃度為312毫克/毫升，在4°C25°C下振蕩活化210小時，然後用緩衝溶液洗滌35次；將活化的電極表面浸入含有l10毫克/毫升氧化還原酶的緩衝溶液，在4°C25°C下振蕩反應324小時後，得到含有丙烯酸、甲基丙烯酸或衣康酸的纖維表面固定酶的電極，4。C下保存待用。安培型生物傳感器電極的製備方法包括如如下步驟l)將含有馬來酸酐或甲基丙烯酸縮水甘油酯的丙烯腈共聚物與電子媒介體共溶解於二甲基甲醯胺中，其中丙烯腈共聚物質量分數為2%15%，電子媒介體的質量佔丙烯腈共聚物的5%80%。以鉑電極、金電極或玻碳電極為接收板，當電壓為1020千伏、擠出速率為0.53.0毫升/小時、接收距離為1020釐米時收集纖維膜，紡絲時間持續210小時，得到沉積有丙烯腈共聚物和電子媒介體複合納米纖維膜的電極。2)將沉積有丙烯腈共聚物和電子媒介體複合納米纖維膜的電極表面浸入含有110毫克/毫升的氧化還原酶的緩衝溶液，在425°C下振蕩反應324小時後得到含有馬來酸酐或甲基丙烯酸縮水甘油酯的纖維表面固定酶的電極，放於4°C下保存待用。所述的氧化還原酶為過氧化氫酶、過氧化物酶、細胞色素、葡萄糖氧化酶、膽固醇氧化酶、乙醇脫氫酶或漆酶。所述的電子媒介體為二茂鐵、卟啉、鐵卟啉或鋅卟啉。本發明與現有相比具有的有益效果1)酶電極製備方法簡單；電極表面的纖維層含有反應性基團，便於酶固定化;2)纖維複合層極高的比表面積和高的孔隙率使得電極的載酶效率高，底物擴散阻力小；而且電子媒介體的引入明顯降低了電極的檢測限，加快了響應速度，提高了電極響應，加寬了可檢測分析物的線性響應範圍，增加了電極的抗幹擾能力；3)酶和電子媒介體的固定化極大的提高了電極的響應穩定性，且由於電子媒介體的疏水特性使得電極可被反覆使用並且可被儲存很長時間，從而降低了電極的製作成本並提高了電極使用的普遍性；4)電子媒介體的固定化方法簡便易行，而且不消耗支撐層的反應性基團。具體實施例方式以下實施實例對本發明做更詳細的描述，但所述實施例不構成對本發明的限制。實施例11)將含有丙烯酸的丙烯腈共聚物(粘均分子量10萬，共聚單體摩爾百分數為5%)與二茂鐵共溶解於二甲基甲醯胺中，其中丙烯腈共聚物質量分數為2%,二茂鐵的質量佔丙烯腈共聚物的5%。以鉑電極為接收板，當電壓為IO千伏、擠出速率為0.5毫升/小時、接收距離為IO釐米時收集纖維膜，紡絲時間持續2小時，得到沉積有丙烯腈共聚物和二茂鐵複合納米纖維膜的電極。2)將沉積有丙烯腈共聚物和二茂鐵複合納米纖維膜的電極表面浸入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀醯亞胺的緩衝溶液中，其中l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的濃度為5毫克/毫升，N-羥基琥珀醯亞胺的濃度為3毫克/毫升，在25。C下振蕩活化2小時，然後用緩衝溶液洗滌3次；將活化的電極表面浸入含有l毫克/毫升過氧化氫酶的緩衝溶液，在25。C下振蕩反應3小時後，得到含有丙烯酸的纖維表面固定酶的電極，4°C下保存待用。實施例21)將含有甲基丙烯酸的丙烯腈共聚物(粘均分子量3萬，共聚單體摩爾百分數為20%)與卟啉共溶解於二甲基甲醯胺中，其中丙烯腈共聚物質量分數為15%，電子媒介體的質量佔丙烯腈共聚物的80%。以金電極為接收板，當電壓為20千伏、擠出速率為3.0毫升/小時、接收距離為20釐米時收集纖維膜，紡絲時間持續IO小時，得到沉積有丙烯腈共聚物和電子媒介體複合納米纖維膜的電極。2)將沉積有丙烯腈共聚物和卟啉複合納米纖維膜的電極表面浸入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀醯亞胺的緩衝溶液中，其中l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的濃度為20毫克/毫升，N-羥基琥珀醯亞胺的濃度為12毫克/毫升，在4°C下振蕩活化10小時，然後用緩衝溶液洗滌5次；將活化的電極表面浸入含有10毫克/毫升葡萄糖氧化酶的緩衝溶液，在4。C下振蕩反應24小時後，得到含有甲基丙烯酸的纖維表面固定酶的電極，4。C下保存待用。實施例31)將含有衣康酸的丙烯腈共聚物(粘均分子量3萬，共聚單體摩爾百分數為20%)與鐵卟啉共溶解於二甲基甲醯胺中，其中丙烯腈共聚物質量分數為15%，鐵卟啉的質量佔丙烯腈共聚物的80%。以玻碳電極為接收板，當電壓為20千伏、擠出速率為3.0毫升/小時、接收距離為20釐米時收集纖維膜，紡絲時間持續IO小時，得到沉積有丙烯腈共聚物和鐵卟啉複合納米纖維膜的電極。2)將沉積有丙烯腈共聚物和鐵卟啉複合納米纖維膜的電極表面浸入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀醯亞胺的緩衝溶液中，其中l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的濃度為20毫克/毫升，N-羥基琥珀醯亞胺的濃度為12毫克/毫升，在4°C下振蕩活化10小時，然後用緩衝溶液洗滌5次；將活化的電極表面浸入含有10毫克/毫升葡萄糖氧化酶的緩衝溶液，在4。C下振蕩反應24小時後，得到含有甲基丙烯酸的纖維表面固定酶的電極，4°C下保存待用。實施例4l)將含有衣康酸的丙烯腈共聚物(粘均分子量3萬，共聚單體摩爾百分數為20%)與鋅卟啉共溶解於二甲基甲醯胺中，其中丙烯腈共聚物質量分數為15%，鋅卟啉的質量佔丙烯腈共聚物的80%。以玻碳電極為接收板，當電壓為20千伏、擠出速率為3.0毫升/小時、接收距離為20釐米時收集纖維膜，紡絲時間持續10小時，得到沉積有丙烯腈共聚物和鋅卟啉複合納米纖維膜的電極。2)將沉積有丙烯腈共聚物和鋅卟啉複合納米纖維膜的電極表面浸入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀醯亞胺的緩衝溶液中，其中l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的濃度為20毫克/毫升，N-羥基琥珀醯亞胺的濃度為12毫克/毫升，在4°C下振蕩活化10小時，然後用緩衝溶液洗滌5次；將活化的電極表面浸入含有10毫克/毫升葡萄糖氧化酶的緩衝溶液，在4。C下振蕩反應24小時後，得到含有甲基丙烯酸的纖維表面固定酶的電極，4°C下保存待用。實施例5以過氧化物酶代替葡萄糖氧化酶，其餘與實施例4相同。實施例6以細胞色素代替葡萄糖氧化酶，其餘與實施例4相同。實施例7以膽固醇氧化酶代替葡萄糖氧化酶，其餘與實施例4相同。實施例8以乙醇脫氫酶代替葡萄糖氧化酶，其餘與實施例4相同。實施例9以漆酶代替葡萄糖氧化酶，其餘與實施例4相同。實施例101)將含有馬來酸酐的丙烯腈共聚物(粘均分子量10萬，共聚單體摩爾百分數為5%)與二茂鐵共溶解於二甲基甲醯胺中，其中丙烯腈共聚物質量分數為2%，二茂鐵的質量佔丙烯腈共聚物的5%。以鉑電極為接收板，當電壓為IO千伏、擠出速率為0.5毫升/小時、接收距離為10釐米時收集纖維膜，紡絲時間持續2小時，得到沉積有丙烯腈共聚物和二茂鐵複合納米纖維膜的電極。2)將沉積有丙烯腈共聚物和二茂鐵複合納米纖維膜的電極表面浸入含有1毫克/毫升的過氧化氫酶的緩衝溶液，在25°C下振蕩反應3小時後得到含有馬來酸酐的纖維表面固定酶的電極，放於4T下保存待用。實施例11將含有甲基丙烯酸縮水甘油酯的丙烯腈共聚物(粘均分子量3萬，共聚單體摩爾百分數為20%)與卟啉共溶解於二甲基甲醯胺中，其中丙烯腈共聚物質量分數為15%，電子媒介體的質量佔丙烯腈共聚物的80%。以金電極為接收板，當電壓為20千伏、擠出速率為3.0毫升/小時、接收距離為20釐米時收集纖維膜，紡絲時間持續10小時，得到沉積有丙烯腈共聚物和卟啉複合納米纖維膜的電極。2)將沉積有丙烯腈共聚物和卟啉複合納米纖維膜的電極表面浸入含有10毫克/毫升的葡萄糖氧化酶的緩衝溶液，在4下振蕩反應24小時後得到含有甲基丙烯酸縮水甘油酯的纖維表面固定酶的電極，放於4QC下保存待用。實施例121)將含有甲基丙烯酸縮水甘油酯的丙烯腈共聚物(粘均分子量3萬，共聚單體摩爾百分數為20%)與鐵卟啉共溶解於二甲基甲醯胺中，其中丙烯腈共聚物質量分數為15%，鐵卟啉的質量佔丙烯腈共聚物的80%。以玻碳電極為接收板，當電壓為20千伏、擠出速率為3.0毫升/小時、接收距離為20釐米時收集纖維膜，紡絲時間持續10小時，得到沉積有丙烯腈共聚物和鐵B卜啉複合納米纖維膜的電極。2)將沉積有丙烯腈共聚物和鐵卟啉複合納米纖維膜的電極表面浸入含有10毫克/毫升的葡萄糖氧化酶的緩衝溶液，在4下振蕩反應24小時後得到含有甲基丙烯酸縮水甘油酯的纖維表面固定酶的電極，放於4°C下保存待用。實施例131)將含有甲基丙烯酸縮水甘油酯的丙烯腈共聚物(粘均分子量3萬，共聚單體摩爾百分數為20%)與鋅卟啉共溶解於二甲基甲醯胺中，其中丙烯腈共聚物質量分數為15%，鐵卟啉的質量佔丙烯腈共聚物的80%。以鉑電極為接收板，當電壓為20千伏、擠出速率為3.0毫升/小時、接收距離為20釐米時收集纖維膜，紡絲時間持續IO小時，得到沉積有丙烯腈共聚物和鋅卟啉複合納米纖維膜的電極。2)將沉積有丙烯腈共聚物和鋅卟啉複合納米纖維膜的電極表面浸入含有10毫克/毫升的葡萄糖氧化酶的緩衝溶液，在4下振蕩反應24小時後得到含有甲基丙烯酸縮水甘油酯的纖維表面固定酶的電極，放於4°C下保存待用。實施例14以過氧化物酶代替葡萄糖氧化酶，其餘與實施例13相同。實施例15以細胞色素代替葡萄糖氧化酶，其餘與實施例13相同。實施例16以膽固醇氧化酶代替葡萄糖氧化酶，其餘與實施例13相同。實施例17以乙醇脫氫酶代替葡萄糖氧化酶，其餘與實施例13相同。實施例18以漆酶代替葡萄糖氧化酶，其餘與實施例13相同。表1製備的安培型葡萄糖生物傳感器電極參數例號tableseeoriginaldocumentpage10權利要求1.一種安培型生物傳感器電極，包括基底電極和活化層，在基底電極上設有活化層，其特徵是1)活化層由丙烯腈共聚物和電子媒介體複合納米纖維膜和固定的氧化還原酶構成。2)活化層的納米纖維膜由靜電紡絲法製備。3)丙烯腈共聚物中，共聚單體為丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來酸酐、衣康酸或甲基丙烯酸縮水甘油酯，共聚單體佔丙烯腈共聚物摩爾百分數為5～20％，丙烯腈共聚物的粘均分子量為3萬～10萬，電子媒介體佔丙烯腈共聚物的質量分數為5％～80％。4)電子媒介體為二茂鐵、卟啉、鐵卟啉或鋅卟啉。2.如權利要求1所述的一種安培型生物傳感器電極，其特徵在於所述的氧化還原酶為過氧化氫酶、過氧化物酶、細胞色素、葡萄糖氧化酶、膽固醇氧化酶、乙醇脫氫酶或漆酶。3.—種如權利要求1所述的安培型生物傳感器電極的製備方法，其特徵在於包括如下步驟1)將含有丙烯酸、甲基丙烯酸或衣康酸的丙烯腈共聚物與電子媒介體共溶解於二甲基甲醯胺中，其中丙烯腈共聚物質量分數為2%15%，電子媒介體的質量佔丙烯腈共聚物的5%80%。以鉑電極、金電極或玻碳電極為接收板，當電壓為1020千伏、擠出速率為0.53.0毫升/小時、接收距離為1020釐米時收集纖維膜，紡絲時間持續210小時，得到沉積有丙烯腈共聚物和電子媒介體複合納米纖維膜的電極。2)將沉積有丙烯腈共聚物和電子媒介體複合納米纖維膜的電極表面浸入l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀醯亞胺的緩衝溶液中，其中l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的濃度為520毫克/毫升，N-羥基琥珀醯亞胺的濃度為312毫克/毫升，在4。C25。C下振蕩活化210小時，然後用緩衝溶液洗滌35次；將活化的電極表面浸入含有l10毫克/毫升氧化還原酶的緩衝溶液，在4°C25°C下振蕩反應324小時後，得到含有丙烯酸、甲基丙烯酸或衣康酸的纖維表面固定酶的電極，4。C下保存待用。4.一種如權利要求1所述的安培型生物傳感器電極的製備方法，其特徵在於包括如如下步驟l)將含有馬來酸酐或甲基丙烯酸縮水甘油酯的丙烯腈共聚物與電子媒介體共溶解於二甲基甲醯胺中，其中丙烯腈共聚物質量分數為2%15%，電子媒介體的質量佔丙烯腈共聚物的5%80%。以鉑電極、金電極或玻碳電極為接收板，當電壓為1020千伏、擠出速率為0.53.0毫升/小時、接收距離為1020釐米時收集纖維膜，紡絲時間持續210小時，得到沉積有丙烯腈共聚物和電子媒介體複合納米纖維膜的電極。2)將沉積有丙烯腈共聚物和電子媒介體複合納米纖維膜的電極表面浸入含有110毫克/毫升的氧化還原酶的緩衝溶液，在425°C下振蕩反應324小時後得到含有馬來酸酐或甲基丙烯酸縮水甘油酯的纖維表面固定酶的電極，放於4。C下保存待用。5.如權利要求3或4所述的一種安培型生物傳感器電極的製備方法，其特徵在於所述的氧化還原酶為過氧化氫酶、過氧化物酶、細胞色素、葡萄糖氧化酶、膽固醇氧化酶、乙醇脫氫酶或漆酶。6.如權利要求3或4所述的一種安培型生物傳感器電極的製備方法，其特徵在於所述的電子媒介體為二茂鐵、卟啉、鐵卟啉或鋅卟啉。全文摘要本發明公開了一種安培型生物傳感器電極及其製備方法。以二甲基甲醯胺為溶劑，丙烯腈共聚物和電子媒介體為原料，電化學電極為接受電極，通過靜電紡絲在電極表面製備了丙烯腈共聚物和電子媒介體的複合纖維膜，然後用共價法將氧化還原酶固定於纖維表面，形成電極表面的纖維活化層。纖維的活化層具有極大的比表面積、高孔隙率和通孔結構，同時由於含有電子媒介體，因此電極具有較高的響應強度、線性檢測範圍和穩定性均較高。該介體電化學酶電極具有製備過程簡單，可以反覆使用，有效酶膜表面積大，抗幹擾能力強等特點，適合批量化生產。文檔編號G01N27/327GK101285791SQ20081006162公開日2008年10月15日申請日期2008年5月23日優先權日2008年5月23日發明者徐志康,王振剛,黃小軍申請人:浙江大學