高溫脂肪酶,其突變體的製備及其用途的製作方法

2023-09-21 15:10:55 2

專利名稱：高溫脂肪酶,其突變體的製備及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程和酶工程領域，具體的說，涉及一種突變的棲熱胞菌屬的細 菌Thermotoga petrophila來源的分離脂肪酶，其編碼基因，及含有該編碼基因的重組質粒 和用於表達目標脂肪酶蛋白的重組菌株；本發明還涉及所表達的熱穩定脂肪酶的用途。
背景技術：
脂肪酶(lipase，EC3. 1. 1. 3，甘油酯水解酶)是分解脂肪的酶，在動植物組織及多 種微生物中普遍存在，其天然底物是生物產生的天然油脂，是最早被研究的酶類之一。自 1834年兔胰脂肪酶的活性報導至今，有關脂肪酶的研究已有上百年的歷史。20世紀初國外 科研人員首次發現了微生物脂肪酶。微生物脂肪酶種類多，比動植物酶的作用PH、作用溫度 以及對底物的專一性類型更廣，便於進行工業化生產和獲得高純度酶製劑，這些因素促進 了微生物脂肪酶的研究，也極大地帶動了脂肪酶在各領域中的基礎和實際應用等方面的研 究。目前脂肪酶已經成為重要的工業用酶之一。當前，工業用脂肪酶主要由微生物生產獲得。自然界中有許多微生物可以合成脂 肪酶。產脂肪酶的菌類主要有黑麴黴菌、螢光假單胞菌、白地黴無根根黴菌、毛黴圓柱假絲 酵母菌、巢子須黴德氏根黴菌、多球菌綿毛狀腐質黴菌、圓弧青黴黏質色桿菌。據統計，產脂 肪酶的微生物有65個屬，其中細菌觀個屬，放線菌4個屬，酵母菌10個屬，其它放線菌4 個屬、酵母菌10個屬，其它真菌23個屬。脂肪酶在常溫常壓下反應，反應條件溫和、轉化率高和特異性強，不易產生副產 物，避免因化學催化法而帶來的有害物質，因而脂肪酶應用領域廣泛，它可以作為消化酶和 臨床診斷用酶製劑，應用在醫藥行業；也可作為食品添加劑用於食物的風味改良；在洗滌 行業中，鹼性脂肪酶被廣泛應用以提高洗滌劑的潔淨能力；在造紙工業中可用來除去紙漿 中的「洽脂」；在皮革加工過程中，可用來脫除與皮革或皮毛緊密相連的殘餘脂肪和蛋白 質；此外，隨著脂肪酶研究的不斷深入，脂肪酶已被應用在塑料的生物降解研究中，這一研 究已呈現廣闊的應用前景。更為重要的是脂肪酶還具有酯化、轉酯化及同分異構體拆分等 功能，也已受到日益關注。脂肪酶最適作用溫度、最適pH等都隨酶的來源和底物不同而異，因此最適溫度或 PH只有在一定條件下才有意義。脂肪酶抑制劑因作用機理不同可分為可逆和不可逆抑制 劑，而金屬離子可作為不同脂肪酶激活劑或抑制劑。脂肪酶α-螺旋蓋結構對三聯體活性 中心起到保護作用，油水界面活化現象使α-螺旋再定向，使脂肪酶催化易於進行。此外， 脂肪酶活性中心結構差異使它們對不同底物特異性也不同。脂肪酶來源不同，導致結構和 性質的多樣性、不穩定性、底物水不溶性等問題，使脂肪酶研究進展與蛋白酶、澱粉酶相比 要慢得多。脂肪酶結構研究、動力學研究、分子生物學研究是今後應重點加強基礎理論研 究，同時還要加強應用研究。目前，工業生產用脂肪酶高產菌株主要通過誘變獲得。除對已知微生物進行高產 脂肪酶誘變篩選外，極端微生物也引起了研究者的重視。極端環境下微生物脂肪酶能抗惡劣環境，如耐低溫，耐酸鹼，耐高壓等，在工業生產中有重要的應用價值。中國極地研究中心 已從南極土壤、阿拉斯加凍土及深層地下水等分離到低溫產脂肪酶菌株，並研究了其基因 和酶學特性。國外已開始從海洋微生物中篩選產脂肪酶菌株。近年來，基因技術簡化了下遊加工，使微生物脂肪酶的產量增加了許多倍。而且引 入變性劑和誘導劑使我們有可能取得具有優勢三維結構的脂肪酶，因為使用誘導劑和脂肪 酶生產出的產品具有專一性定向性和特殊的應用。隨著研究的深入，脂肪酶的工業應用將 不斷增加。因此，目前對於採用新方法獲得新型有工業價值的脂肪酶有潛在的需要。

發明內容
因此，本發明的目的是提供一種新的脂肪酶，以使其滿足工業上的需要。在本發明的一個方面，提供了一種分離的脂肪酶，其含有如SEQ ID NO :4所示的氨 基酸序列。在該方面的一個優選例中，所述脂肪酶的胺基酸序列與SEQ IDNO :4具有至少有 至少50 %，優選至少60 %，更優選至少70 %，再優選至少80 %，更優選至少90 %，最優選至 少95%的相同性。在該方面的另一個優選例中，該脂肪酶還包括其功能性片段。在該方面 的一個最優選例中，該脂肪酶的胺基酸序列是SEQ ID NO :4。在本發明的另一個方面，提供了一種編碼上述脂肪酶的核酸分子。在一個優選例 中，它具有如SEQ ID NO :2所示的核酸序列。在該方面的一個優選例中，所述核酸分子與 SEQ ID NO: 2具有至少有至少50%，優選至少60%，更優選至少70%，再優選至少80%，更 優選至少90%，最優選至少95%的相同性。在該方面的一個最優選例中，該核酸分子的核 苷酸序列是SEQ ID NO :2ο在本發明的第三個方面，提供了 一種載體，其包含上述多核苷酸。在本發明的第四個方面，提供了一種細胞，其包含上述載體，或其基因組中整合有 上述多核苷酸。在本發明的第五個方面，提供了上述脂肪酶的用途，用於催化酯合成、手性拆分或 將植物油轉化為生物柴油。在本發明的第六個方面，提供了一種組合物，該組合物中含有上述脂肪酶和載體。 在該方面的一個優選例中，載體選自食品上、工業上、藥用上的載體。在本發明的第七個方面，提供了一種生產上述脂肪酶的方法，包括培養上述宿主 細胞，從培養物中分離出表達產物。在本發明的第八個方面，提供了一種將植物油轉化為生物柴油的方法，包括用上 述脂肪酶處理植物油。在本發明的第九個方面，提供了一種催化酯合成的方法，包括在無水或少量水體 系中用上述脂肪酶催化酯化反應。在本發明的第十個方面，提供了一種手性拆分的方法，包括用上述脂肪酶催化手 性拆分。


圖Ia 來自Thermotoga petrophila的編碼脂肪酶的核酸序列(SEQ ID NO :1)及 其編碼的胺基酸序列(SEQ ID NO :3)。
圖Ib 本發明的突變的脂肪酶TP-Esterase的胺基酸序列(SEQ ID NO 4)及其編 碼基因(SEQ ID NO :2)。圖2 突變體脂肪酶(SEQ ID NO :4)，來自 Thermotoga petrophila 的脂肪酶 (SEQID NO 3)以及來自 Marinitoga piezophila KA-3 的脂肪酶胺基酸序列(SEQ ID NO: 5)的比較。圖3 =Thermotoga petrophila來源的脂肪酶與突變體脂肪酶在質粒pET28a(+)上 的重組子結構圖。圖4 大腸桿菌表達Thermotoga petrophila來源的脂肪酶與突變體脂肪酶的最 適反應PH，以pH對相對酶活力(％)作圖。圖5 大腸桿菌表達Thermotoga petrophila來源的脂肪酶與突變體脂肪酶的最 適反應溫度，以溫度對相對酶活力(％)作圖。圖6 大腸桿菌表達Thermotoga petrophila來源的脂肪酶與突變體脂肪酶的pH 穩定性，以PH對殘餘酶活力(％ )作圖。圖7a 大腸桿菌表達Thermotoga petrophila來源脂肪酶的熱穩定性，以溫度對 殘餘酶活力(％)作圖。圖7b 大腸桿菌表達突變體脂肪酶的熱穩定性，以溫度對殘餘酶活力(％ )作圖。圖大腸桿菌表達Thermotoga petrophila來源的脂肪酶對胃蛋白酶和胰蛋白 酶的抗性隨時間變化的圖。圖8b 大腸桿菌表達突變體脂肪酶對胃蛋白酶和胰蛋白酶的抗性隨時間變化的 圖。圖9 大腸桿菌表達Thermotoga petrophila來源的脂肪酶與突變體脂肪酶發酵 過程中樣品的SDS-PAGE0其中M =SDS-PAGE蛋白質標樣；1 =Thermotoga petrophila脂肪 酶誘導2hr ；2 =Thermotoga petrophila脂肪酶誘導4hr ；3 突變體脂肪酶誘導2hr ；4 突變 體脂肪酶誘導4hr。圖10 大腸桿菌表達Thermotoga petrophila來源的脂肪酶與突變體脂肪酶的 PAGE。其中M:PAGE蛋白質標樣；1 =Thermotoga petrophila脂肪酶(考馬斯亮藍染色)； 2 突變體脂肪酶(考馬斯亮藍染色)；3 =Thermotoga petrophila脂肪酶(活性染色)；4 突變體脂肪酶(活性染色)。圖11 純化後大腸桿菌表達Thermotoga petrophila來源的脂肪酶與突變體脂肪 酶的 SDS-PAGE。M =SDS-PAGE 蛋白質標樣；1 =Thermotoga petrophila 脂肪酶；2 突變體脂肪酶。圖12 脂肪酶催化酯合成的標準色譜圖。圖13 脂肪酶催化手性拆分的標準色譜圖。圖14 脂肪酶催化產生生物柴油的標準色譜圖。
具體實施例方式通過對Thermotoga petrophila的篩選，發明人發現了一種新型脂肪酶，其熱穩定 性好，具有高度的應用性能。在此基礎上完成本發明。如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和蛋白是沒有分離純化 的，但同樣的多聚核苷酸或蛋白如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化 的。如本文所用，「分離的脂肪酶」是指該脂肪酶基本上不含天然與其相關的其它蛋 白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化脂肪酶。基 本上純的蛋白在非還原聚丙烯醯胺凝膠上能產生單一的主帶。脂肪酶的純度能用胺基酸序 列分析。本發明的脂肪酶可以是重組蛋白(多肽)、天然蛋白、合成蛋白，優選重組蛋白。本 發明的脂肪酶可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真 核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所 用的宿主，本發明的脂肪酶可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的脂肪酶還可包 括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發明還包括脂肪酶的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」、「衍生 物」和「類似物」是指基本上保持本發明的天然脂肪酶相同的生物學功能或活性的蛋白。本 發明的脂肪酶片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基 (優選保守性胺基酸殘基)被取代的蛋白，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是 由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的蛋白，或(iii)成 熟蛋白與另一個化合物(比如延長蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋 白，或(iv)附加的胺基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前導序列或分泌序列或 用來純化此蛋白的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據本文的 教導，這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。在本發明中，術語「脂肪酶」指野生型Thermotoga petrophila脂肪酶，或具有脂 肪酶活性的SEQ ID NO :4的胺基酸序列的蛋白。該術語還包括具有與脂肪酶相同功能的、 SEQ ID NO :4序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)一個或多個(通常為 1-30個，較佳地1-20個，更佳地1-10個，最佳地1-5個)胺基酸的缺失、插入和/或取代， 以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳 地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常 不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不 會改變蛋白質的功能。該術語還包括脂肪酶的活性片段和活性衍生物。該脂肪酶的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘 導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與脂肪酶的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用 抗脂肪酶的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他蛋白，如包含脂肪酶或其片段 的融合蛋白。除了幾乎全長的蛋白外，本發明還包括了脂肪酶的可溶性片段。通常，該片段 具有脂肪酶序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50 個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。發明還提供脂肪酶的類似物。這些類似物與天然脂肪酶的差別可以是胺基酸序列 上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些蛋白包括天然或 誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產 生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基 酸(如β、Y-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的脂肪酶並不限於上述例舉的代表性的 蛋白。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的蛋白的化學衍生形式如乙 醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或進一步加工步驟中進 行糖基化修飾而產生的蛋白。這種修飾可以通過將蛋白暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動 物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪 氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優 化了溶解性能的蛋白。在本發明中，「脂肪酶保守性變異蛋白(多肽)」指與SEQ ID NO :4的胺基酸序列 相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似 或相近的胺基酸所替換而形成蛋白。這些保守性變異蛋白最好根據表1進行胺基酸替換而 產生。表 權利要求
1.一種分離的脂肪酶，其特徵在於，其胺基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
2.—種核酸分子，其特徵在於，編碼權利要求1所述的脂肪酶。
3.如權利要求2所述的核酸分子，其特徵在於，其核酸序列如SEQID N0:2所示。
4.一種載體，其特徵在於，所述的載體包含權利要求2所述的多核苷酸。
5.一種細胞，其特徵在於，其包含權利要求4所述的載體，或其基因組中整合有權利要 求2所述的多核苷酸。
6.如權利要求1所述的脂肪酶的用途，其特徵在於，用於催化酯合成、手性拆分或將植 物油轉化為生物柴油。
7.一種組合物，其特徵在於，所述組合物中含有權利要求1所述的脂肪酶和載體。
8.—種生產權利要求1所述的脂肪酶的方法，其特徵在於，包括培養權利要求5所述 的細胞，從培養物中分離出表達產物。
9.一種將植物油轉化為生物柴油的方法，其特徵在於，包括用權利要求1所述的脂肪 酶處理植物油。
10.一種催化酯合成的方法，其特徵在於，在無水或少量水體系中用權利要求1所述的 脂肪酶催化酯化反應。
11.一種手性拆分的方法，其特徵在於，用權利要求1所述的脂肪酶催化手性拆分。
全文摘要
公開了高溫脂肪酶，其突變體的製備及其用途。具體說，公開了一種具有胺基酸序列SEQ ID NO4的分離的脂肪酶，其編碼序列，含有其的載體、細胞和組合物，其製備方法，以及其用於催化酯合成、手性拆分或將植物油轉化為生物柴油的用途。
文檔編號C12P7/64GK102102093SQ200910201209
公開日2011年6月22日 申請日期2009年12月16日 優先權日2009年12月16日
發明者葉秀雲, 張洋, 羅鋆琳, 陳萍, 靳偉剛 申請人:福建福大百特科技發展有限公司