用於臨床局限性前列腺癌患者的基於基因的psa復發預測的製作方法

2023-09-21 06:33:05

專利名稱：用於臨床局限性前列腺癌患者的基於基因的psa復發預測的製作方法
用於臨床局限性前列腺癌患者的基於基因的PSA復發預測
背景技術：
在進行根治性前列腺切除術或用於前列腺癌的其他侵入性治療前，儘可能地準確了解該程序是否可能是治癒性是有用的。一般地，通過拒絕作出特定預測，或提供總體平均值，或提供主觀評價或基於模型將患者指定至確定危險組(例如高危或低危組)，醫生可以對患者關於預後信息的請求提供回應。提供最準確的評價幾乎始終是適當的回應。因為癌症的病理學分期與手術或治療後的復發概率相關，所以為了提供最佳可能評價，已付出許多努力來預測前列腺癌患者中的最終病理學分期或結果。為此，已採用許多列線圖、算法和標記，其中Kattan列線圖是最成功的。優選地，一致性指數用於從考慮的模型/列線圖/算法等中選擇特定策略。Kattan列線圖在US5993388和US6409664中描述，所述兩個專利以引用方式併入本文。用於治療臨床局限性前列腺癌的侵入性療法是根治性前列腺切除術。不幸的是，用根治性前列腺切除術治療的許多男性後來經歷其疾病的進展。從指示復發的血清PSA中的增加開始，該癌症在許多男性中在手術後數月或數年重現。在可檢測的PSA前，可能最後經歷復發的男性的早期鑑定在考慮另外治療同時保存生活質量中將是有用的。進一步地，復發可能性的準確估計在臨床試驗中也將是有用的，以鑑定用於對照組或用於目的研究治療的候選者。如果治療將更好地適合這個患者亞組，那麼需要在新近診斷的臨床局限性前列腺癌的分類中增加的準確度。與在其他癌症中一樣，近期已開發了許多表型和預後分子標記和基因標誌用於前列腺癌。這些已提供不同種類的侵入性前列腺癌和許多潛在的候選基因標記存在的某些重要了解。單獨或與其他工具例如Kattan術後列線圖結合的，摻入少量基因標記的表達值的臨床可行測試是有用的，以評價PSA復發的危險是期望的。

發明內容
在一個方面，基於基因表達的測定用於提供前列腺癌復發的預後。基於基因表達的測定優選基於少量基因。三種基因概況是優選的。在一個優選的實施方案中，三種基因MYHlKSSBPl和DPT的表達水平提供有關前列腺癌復發的可能性的預後信息。在一個備選實施方案中，可以使用基因例如細絲蛋白C，y, RAS樣家族12和細絲蛋白A的表達水平。其他可能的標記組合包括(i)生長停滯特異性l、Smoothelin、Leiomodin I和組蛋白lH3d,和(ii)含Sorbin和SH3結構域I、PDZ和UM結構域7、LIM和衰老細胞抗原樣結構域2。基於表達水平的標記的另外有用組合可以容易地選自表2。在另一個方面，基於基因表達水平的測定與臨床工具結合使用，所述臨床工具是例如基於前列腺癌預後的多重臨床指示物的列線圖。在一個優選實施方案中，測定三種基因和三種對照基因的表達的測量。優選地，基因測量相對於三種對照基因的平均值進行測量。將這些基因測量連同來自Kattan列線圖的預測概率一起摻入統計模型內，以生成反映復發概率或復發危險的評分。這種信息還可以用於測定在根治性前列腺切除術後的PSA水平上升的可能性。這種復發概率可以幫助患者作出關於其在治療方面的選擇的個人化決定。更具體地講，本發明公開了用於區分在前列腺癌的高復發危險類別中的受試者和在前列腺癌的低復發危險類別中的受試者的分類器。優選的分類器包括分類程序，所述分類程序包括測量選自表2的至少兩種診斷標記的表達水平，其中每種表達水平相對於兩種或更多種對照標記的表達水平的平均值進行測量。隨後將至少兩種診斷標記的表達水平與基於Kattan列線圖的預測概率組合，以生成同樣可以是列線圖形式的分類器。此處，Kattan列線圖是例如在美國專利6，409, 664和5，993，388中描述的複合測量。Kattan列線圖一般基於下組中的兩個或更多個成員術前(和激素療法前，如果接受的話)PSA值、前列腺切除術時的PSA、手術時的主要格裡森(primary Gleason)、手術時的次要格裡森、前列腺切除術格裡森總和、前列腺切除術年份、無疾病月數、手術切緣是否是陽性的、癌症是否在精囊中發現、是否存在囊外延伸、癌症是否在淋巴結中發現(如果有的話，則切除)、放射治療前PSA、輻射劑量(如果適用)、手術切緣是陽性還是陰性的(如 果適用)、是否存在精囊牽涉(如果適用)、是否存在淋巴結牽涉(如果適用)、是否存在囊外牽涉(如果適用)、是否開出新輔助激素處方、是否開出新輔助放射處方。Kattan列線圖還可以是基於下組中的兩個或更或多個成員的複合測量治療前PSA水平、組合的格裡森級別、樣品格裡森總和、臨床分期、手術切緣狀態、在活組織檢查核心中癌症的核心總長度中的前列腺囊侵襲最大限度癌症長度、核心陽性水平百分比、前列腺外延伸、前列腺外延伸水平、細胞凋亡指數、一個或多個核心中的癌症百分比、一個或多個核心中的高級別癌症百分比、總腫瘤體積、癌症的定位區、精囊侵襲的存在、精囊侵襲的類型、p53、Ki-67、p27、DNA倍性狀態、淋巴結狀態和淋巴管侵襲。用於區分在前列腺癌的高復發危險類別中的受試者和在前列腺癌的低復發危險類別中的受試者的優選分類器要求測量診斷標記MYH11、SSBPl和DPT的表達水平。 優選的對照標記是TUBA、ALASl和ACTGl。備選的優選對照標記因如通過RT-PCR檢測的相對穩定的表達水平而選擇。用於區分在前列腺癌的高復發危險類別中的受試者和在前列腺癌的低復發危險類別中的受試者的另一優選分類器要求測量選自表2的至少一種診斷標記加上MYH11、SSBPl和DPT的表達水平在另一優選實施方案中，兩種或更多種診斷標記選自表2中呈現的標記集合。診斷標記的更多具體集合包括本發明還公開了預測前列腺癌復發的方法。該方法包括步驟(i)測定DPT相對於標準的表達水平；(ii)測定來自表2的至少一種另外標記的表達水平；和(iii)將DPT的表達水平和來自表2的至少一種另外標記的表達水平轉化成對應於前列腺癌的復發概率的評分。作為轉化DPT的表達水平和來自表2的至少一種另外標記的表達水平的步驟的替代，該方法可以具有將DPT的表達水平和來自表2的至少一種另外標記的表達水平與前列腺癌復發的至少一種另外指示物組合的步驟，以測定複合評分。此類複合評分反映前列腺癌復發的可能性。優選地，在從前列腺切除術、激素療法、單試劑化學療法、雙試劑化學療法和用法尼基轉移酶抑制劑的治療中選擇至少一種治療前，測定DPT的表達水平和來自表2的至少一種另外標記的表達水平。
非限制性地，本公開內容還涵蓋用於檢測至少DPT的表達水平的試劑盒，該試劑盒包括試劑以及包括特異性識別DPT的第一探針和特異性識別選自表2的第二種標記的第二探針的第一探針組。該試劑盒可以包括用於將DPT的表達水平和來自表2的至少一種另外標記的表達水平轉換成前列腺癌復發的可能性指示物的裝置。該裝置可以是列線圖的形式。更具體地講，優選的試劑盒作為下組中的一個或多個成員實現機械裝置、圖解表示和軟體指令，以實現用於提供前列腺癌復發的可能性指示物表示的用戶界面。在本發明的再進一步方面，提供含有用於進行來自前列腺腫瘤的三種基因和三種對照基因測量的試劑的試劑盒。提供使得基因測量能夠針對三種對照基因的平均值進行標準化的指令(任選作為計算機代碼)。將這些測量連同來自列線圖的預測概率一起摻入生成復發概率的統計模型內。


圖IA顯示了使用基於來自157個患者的獨立測試系列的結果的C-指數，本文公開的分類器與列線圖的比較。分類器的C-指數明顯高於列線圖的C-指數(O. 77與O. 67比較)。·圖IB顯示了在關於測試集的5年預測估計值和實際復發概率之間的對應。與理想預測器相比較，該分類器證實跨越關於測試集的預測譜的良好校準，而5年列線圖顯示在檢測更侵入性病例中的較少準確度。圖2A顯示了關於無PSA復發概率的Kaplan-Meier分析，以示出關於預測的低危和高危組中的時間與PSA復發中的差異(HR 6. 85,95% Cl = 3. 77至12. 43，P < . 001，)。在5年時，在兩個組之間的PSA復發中的絕對差是58% (75%與17%比較)。圖2B顯示了在圖2A中使用的分類器應用於具有格裡森評分6或7的患者。圖2C顯示了在圖2A中使用的分類器應用於顯示病理學分期pT2或pT3a的患者。圖2D顯示了在圖2A中使用的分類器應用於具有術前PSA濃度彡10ng/mL或10< PSA彡20ng/mL的患者。圖2E顯示了在圖2A中使用的分類器應用於具有陽性或陰性手術切緣的患者。圖3顯示了當應用這些測試集時，基於每個模型的最高準確度的截止值應用。
具體實施例方式列線圖廣泛用於預測前列腺癌復發。最廣泛使用的列線圖是在美國專利6，409, 664和5，993，388中描述的Kattan列線圖，所述兩個專利整體併入本說明書。對於未接受用於其前列腺癌的手術治療的那些人，這些列線圖摻入下述信息最近的PSA(前列腺特異性抗原)值、主要和次要格裡森級別、醫生的臨床分期評價(使用1992年或1997年國際抗癌聯盟(UICC)系統)、推薦的放射療法(如果適用)、在活組織檢查過程中發現的陽性核心數目、在活組織檢查過程中發現的陰性核心數目、是否已開出新輔助激素處方、和是否已開出新輔助放射處方。對於執行手術的那些人，因素包括術前(和激素療法前，如果接受的話)PSA值、前列腺切除術時的PSA、手術時的主要格裡森、手術時的次要格裡森、前列腺切除術格裡森總和、前列腺切除術年份、無疾病月數、手術切緣是否是陽性的、癌症是否在精囊中發現、是否存在囊外延伸、癌症是否在淋巴結中發現(如果有的話，則切除)、放射治療前PSA、輻射劑量(如果適用)、手術切緣是陽性還是陰性的(如果適用)、是否存在精囊牽涉(如果適用)、是否存在淋巴結牽涉(如果適用)、是否存在囊外牽涉(如果適用)、是否開出新輔助激素處方、是否開出新輔助放射處方。這種信息在電子表格中組合，例如，並且簡單統計處理提供用於測定預後的分析。
本發明的方法和試劑盒最優選與這些列線圖和它們提供的信息結合使用。本發明的方法和試劑盒還涉及一組基因的檢測。優選地，這個組中的基因之一的表達水平相對於對照標記中的至少一種進行測量。更優選地，測量三種基因和三種對照的表達水平。最優選的基因是MYHlI、SSBPl和DPT。最優選的對照是ALASl、TUBA和ACTGl。如實施例中所述，基因MYHll或DPT的更高表達指示比此類過表達不可見的情況更強的剩餘無前列腺癌復發的可能性。更高的SSBPl表達水平指示更強的復發可能性。對應於測量其表達水平的基因的核酸序列以及用於測量此類表達水平的序列在本說明書中稱為標記。其他目的序列包括用作測定對照的基因，例如ALASUTUBA和ACTG1。標記由用於檢測基因表達的任何方法進行檢測；優選地，這些是基於擴增的方法例如PCR、其變化和替代方法。最優選地，使用RTPCR。對於特定標記特異性的核酸探針或報導分子優選用於檢測腫瘤組織中的標記基因的表達。可以使用其他生物學液體或組織，包括前列腺組織、尿、尿道洗滌物、血液和血液組分例如血清、射精和由其可以預期前列腺蛋白質的其他樣品。可以使用含有可檢測量的有關多核苷酸的任何樣品。一種公開的方法包括使含有標記的靶細胞與結合核酸的試劑接觸。靶細胞組分是核酸例如RNA。該試劑優選包括擴增且檢測靶序列的此類探針和引物。例如，該試劑可以包括與其自身報導區段組合或鍵合的引發序列，例如稱為Scorpion試劑或Scorpion報導基因且在授予Whitcombe等人的美國專利6，326，145和6，270, 967 (以引用方式整體併入本文)中描述的那些。儘管它們並不相同，但術語「引物」和「引發序列」在本說明書中可用於指引發核酸序列擴增的分子或分子的部分。優選引物能夠開始引物延伸產物的合成，該引物延伸產物與多態性位點鏈基本上互補。引物和/或探針可以使用任何合適的方法包括自動化方法進行製備。有利於合成的環境條件包括存在三磷酸核苷和用於聚合反應的試劑(例如DNA聚合酶)以及適當的溫度與pH。引物或引發序列的引發區段優選為單鏈，以使擴增效率最大化，但也可以為雙鏈。如果為雙鏈，則在用於製備延伸產物之前首先應處理引物，以分離兩條鏈。引物必須足夠長，以在存在聚合反應誘發劑的情況下引發延伸產物的合成。優選的引物最優選是八個或更多個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。引物的確切長度取決於諸如溫度、緩衝液和核苷酸組成之類的因素。寡核苷酸引物最優選含有約12-20個核苷酸，但它們也可以含有更多或更少核苷酸。當互補的核酸鏈被分離時，不論核酸原來是雙鏈或是單鏈，分離後的鏈都適合用作合成另外的核酸鏈的模板。這種合成在允許引物與模板的雜交發生的條件下進行。通常，合成是在緩衝的水溶液中進行，該緩衝的水溶液優選的PH值為7-9，最優選的pH值為約8。優選將摩爾過量(對於基因組核酸，通常為約108 1，引物模板)的兩種寡核苷酸引物加入含有分離的模板鏈的緩衝液中。當本發明的方法用於診斷應用時，互補鏈的量可能是未知的，因此無法始終確切知道引物的量相對於互補鏈的量。然而在實踐中，當複雜核酸長鏈的混合物中含有待擴增序列時，所添加的引物的摩爾量通常超出互補鏈(模板)的摩爾量。優選採用較大的摩爾過量，以提高該方法的效率。聚合反應試劑可以為會實現引物延伸產物合成的任何化合物或系統，優選為酶。用於這個目的的合適酶包括例如大腸桿菌(E. coli)DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4 DNA聚合酶、其他可用的DNA聚合酶、聚合酶突變體、逆轉錄酶及其他酶，包括熱穩定的酶(例如在實施足以引起變性的高溫後執行引物延伸的那些酶)優選試劑為Taq聚合酶。合適的酶將有利於核苷酸以正確的方式組合，從而形成與每個基因座核酸鏈互補的引物延伸產物。通常，合成將在每個引物的3'端開始，並沿著模板鏈的5'方向繼續進行，直到合成結束，產生不同長度的分子。然而，也可能存在在5'端開始合成並在其他方向繼續的聚合反應試劑，其方法與上述相同。在本發明的另一個方面，採用表達比率。確定在獲得的擴增標記量和擴增的參考標記或擴增的對照標記區量之間的比率可以實現這點。這可以使用定量實時PCR來完成。比率可以插入統計模型內，以測定前列腺癌復發的可能性。本發明的試劑盒可優選這樣由多種組分構成，從而使得這些組分都含有至少一種引物或探針或檢測分子(如Scorpion報告基因)。在一個實施方案中，該試劑盒包括用於擴增且檢測標記區段的試劑。任選地，試劑盒包括樣品製備試劑和/或製品(如管)，以從樣品中提取核酸。在優選試劑盒中，包括了 RTPCR所需的試劑，例如，對應的PCR引物組、熱穩定的聚合酶(如Taq聚合酶)和合適的檢測試劑(如水解探針或分子信標)。在任選的優選試劑盒中，檢測試劑為Scorpion報告基因或試劑。也可以使用單染料引物或雙鏈DNA特異性螢光染料(例如溴化乙錠)。試劑盒中的額外材料可以包括合適的反應管或小瓶、屏蔽組合物，通常是蠟珠，任選包括鎂；必要的緩衝液和試劑，例如dNTP ;對照核酸和/或任何額外的緩衝液、化合物、輔因子、離子組成成分、蛋白質和酶、聚合物等。任選地，試劑盒包括核酸提取試劑和材料。在本發明的優選試劑盒中，提供對具有前列腺樣品的患者進行測定的說明書。最優選提供由計算機指令編碼的製品用於製備來自Cox比例風險分析或其他統計比較器的預測。將該指令裝載到計算機例如通用計算機內，從而使得當基因分析的值和任選的Kattan參數輸入程序內時，該計算機提供復發可能性(高與低比較或者數字指示物)作為輸出。在本發明的優選試劑盒中，還可以提供列線圖的機械實現。此類實現可以使用基於紙的組分或移動機械部分，以允許考慮由列線圖使用的個別變量。
具體實施例方式實施例I目的需要復發危險的準確估計值用於具有臨床局限性前列腺癌的患者的最佳管理。將列線圖和新型分子預測物組合到前列腺特異性抗原(PSA)復發的新預後模型內。這個研究設計為鑑定與具有臨床局限性前列腺癌的患者中的PSA復發相關的基因，目的是開發準確的預測分類器，所述預測分類器可容易地應用於目前常規臨床實踐中，以管理具有局限於器官的疾病的患者。此處，我們報導了臨床可行測試的開發，所述臨床可行測試摻入可通過RTPCR測量的三種新型基因標記的表達值，和在前列腺癌的臨床管理中廣泛使用的工具Kattan術後列線圖(11)，以評價PSA復發的危險。最後，我們顯示與Kattan列線圖相比較，這種新分類器提供對於預測在這個低危患者群體中的生物化學復發的改善的準確度。材料和方法分析來自福馬林固定的、石蠟包埋(FFPE)的局限性前列腺癌患者組織的基因表達概況，以鑑定與PSA復髮結合的基因。通過逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RTPCR)再現所鑑定標記的概況。來自這些基因中的三種的RTPCR概況連同來自Kattan術後列線圖的輸出一起用於產生PSA復發的預測模 型。結果在變量選擇後，建立將三種基因的表達值和術後列線圖組合的PSA復發模型。與關於列線圖O. 67的C-指數相比較，3基因加上列線圖模型在驗證集中以O. 77的一致性指數(c-指數)預測5年PSA復發。這個模型鑑定通過列線圖未鑑定的處於復發的高危中的患者亞組。結論當針對5年列線圖相比較時，這種新的基於基因的分類器具有優良的預測力，以評價具有局限於器官的前列腺癌的患者中的PSA復發危險。這種分類器應提供患者進入高危和低危組內的更準確分層，用於治療決定和輔助臨床試驗。材料和方法患者和腫瘤樣品患者信息得自聖文森校園前列腺癌組(St. Vincent』 s Campus Prostate CancerGroup) (SVCPCG)資料庫(人類研究倫理委員會批准(Human Research Ethics CommitteeApproval)H00/088)。從1990年I月到2001年12月，960個患者在雪梨的聖文森醫院(StVincent’s Hospital, Sydney)用根治性前列腺切除術(RP)治療前列腺癌，沒有術前治療。在目前研究在評價的具有臨床局限性疾病的316個連續患者亞組是其病理學分期範圍從PT2A到pT3A的960的那些患者；對於審查患者的最低限度隨訪是五年；RP是初步治療；並且來自RP樣品的組織塊可以就在基因表達概況分析實驗中的使用進行評價。PSA復發的日期定義為在RP後在血清PSA ^ 0. 2ng/mL中的第一次增加的日期。將這些患者隨機分成訓練集和測試集。測試集單獨用於驗證目的。取決於變量是連續的、時間至事件的還是類別的，通過t檢驗、時序和卡方檢驗來估計在訓練集和測試集之間的臨床變量分布中的差異。所有統計檢驗都是雙側的，並且顯著性定義為P 30 %的惡性上皮用於使用高純度RNA石臘試劑盒(HighPure RNA Paraffin kit)(印第安納州的印第安納波利斯市的羅氏診斷公司(RocheDiagnostics, Indianapolis, IN))的總 RNA 提取。用1200基因定製設計的DNA介導的退火、選擇、連接和延伸微陣列(DASL)(加利福尼亞州的聖地牙哥市的宜曼達公司(Illumina, San Diego,CA)),對訓練系列中的所有總RNA樣品執行基因表達概況分析實驗(22)。DASL陣列的基因表達概況和設計可以在GEO資料庫(登記懸而未決的)中進行評價。基於在前列腺癌中的早期研究，選擇三種對照基因ALASl、TUBA 和 ACTGl 用於微陣列和 RTPCR 分析(12，23)。使用存活模式的微陣列顯著性分析(SAM)分析用於測量在陣列上的每種基因的預後顯著性(24-26)。探針通過檢驗統計量的絕對值進行排序。通過數據排列計算假髮現率。RTPCR測定設計用於頂部排序的預後標記候選物(η = 30)，包括對於增加和降低的探針在最低報導的發現率下的所有基因。在訓練樣品中在陣列和RTPCR數據之間具有弱皮爾森係數(< O. 4)的基因排除進一步分析。預後模型的構建使用紀念斯隆凱特琳癌症中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Centre)在線計算器(http://www. mskcc. org/mskcc/html/10088. cfm),使用術後歷史模型對於每個個體計算五年列線圖復發評分。為了選擇用於多變量模型的變量，使用訓練樣品通過LI正則化路徑算法處理來自RTPCR的候選基因的SCT值以及來自列線圖的預測概率(25)。通過使用路徑算法交叉驗證訓練系列以對過度擬合Cox模型的潛力設置不同極限，選擇具有 最小誤差的標誌。通過使用Cox比例風險模型將這些所選變量與訓練集擬合，建立用於採納的最終預測模型。在假陽性和假陰性的代價相等的假定下，選擇用於模型的高危和低危分層的截止值，以及用於列線圖的截止值。在這個假定下，選擇給出最高訓練集準確度的截止值(由正確分類的患者的總數目限定)。預後模型的驗證為了估計預測性預後模型就測試集中的實際無復發而言的準確度，由通過Cox比例風險回歸估計的預測5年無復發概率和在5年時的實際無復發概率的Kaplan-Meier估計量生成校準曲線(24，27)。通過基於來自訓練集的預選截止值將測試集患者分成低危和高危組，通過Kaplan-Meier曲線和風險比率評價最終預後模型在測試集中的表現。所有統計分析在R，版本2. 5. O (www. r-project. org)中進行。患者特徵從316個前列腺切除術FFPE組織中分離總RNA，並且由於RNA降解排除20個樣品。在訓練集和測試集中包括的患者的臨床和病理學特徵概括於表I中。隨訪中值是72個月，並且從根治性前列腺切除術到生物化學復發的中值時間在復發的那些人中是34個月。296個患者中的九十八個發展復發，包括在手術5年內發展復發的74個患者。訓練系列由138個患者組成，而剩餘158個留出用於測試集。在這兩個患者集合之間在臨床病理學特徵中不存在統計學顯著差異(表I)。基因表汰和單變量分析通過DASL陣列分析來自138個患者的訓練集的RNA樣品。SAM算法的排列揭示對於在DASL陣列上的20種基因0%的假髮現率。如通過來自SAM分析的評分值排序的前30種基因具有6. 8%的假髮現率。這30種基因隨後通過RTPCR分析使用相同訓練集進行評價。30所選基因中的六種顯示在DASL和RTPCR之間小於O. 4的關聯，並且因此從進一步分析中去除。通過Cox回歸測量每種基因對無復發概率的作用。風險比率定量對於I個標準化CT的每個增量PSA復發的相對危險。對於訓練集和測試集記錄風險比率和P值(表2)。24種標記中的二十三種(除了標記HIST1H3D外)繼續與測試集中的復發具有顯著關聯。在相同分析中，5年術後列線圖也是訓練集和測試集中的PSA復發的顯著預測物(P值分別為.OOl和.005)。實施例2 對實施例I的RTPCR訓練集執行進一步的變量選擇，以建立多變量預後分類器。通過LI正則化算法選擇四個變量3種基因(DPT、SSBP1和MYH11)和5年列線圖。這4個變量隨後使用Cox回歸分析對訓練集建模。分類器驗證和存活分析當對157個患者的獨立測試系列測試該預後模型時，分類器的C-指數明顯高於列線圖的C-指數(O. 77與O. 67比較)(圖1A)。當對來自相同研究機構的由960個患者組成的連續前列腺癌患者同類者(cohort)測試時，所述患者並不限於局限於器官的疾病，列線圖表現與公布的研究(O. 72的C-指數)一致(圖1A)。我們隨後使用校準曲線，以測量關於測試集的5年預測估計量與實際復發概率有多接近。與理想預測器相比較，該分類器證 實跨越關於測試集的預測譜的良好校準，而5年列線圖顯示在檢測更侵入性病例中的較少準確度(圖1B)。來自測試集的截止值用於將測試集患者置於高危或低危組內。通過基於來自訓練集的截止值(所述截止值對訓練樣品產生最高準確度)將患者分成低危和高危組，對於測試集樣品生成Kaplan-Meier曲線。由測試集的預測的5年無疾病存活以及基於以O. 3、O. 5,0. 7和O. 9的預測概率中的切割(cuts)在5年時的Kaplan-Meier估計量，生成校準曲線。關於無PSA復發概率的Kaplan-Meier分析顯示關於預測的低危和高危組中的時間與PSA復發中的高度顯著差異(HR 6. 85,95% Cl = 3. 77至12. 43，P < · 001，圖2A)。在5年時，在兩個組之間的PSA復發中的絕對差是58% (75%與17%比較)。此外，該分類器還代表關於下述患者亞組中的PSA復發的強預後因素格裡森評分6或7(圖2B)，病理學分期 pT2 或 pT3a(圖 2C)，術前 PSA 濃度彡 10ng/mL 或 10 < PSA ( 20ng/mL(圖 2D)，和陽性或陰性手術切緣(圖2E)。在訓練集和測試集中包括的患者的臨床和病理學特徵概括於表I中。隨訪中值是72個月。從根治性前列腺切除術到生物化學復發的平均時間和中值時間分別為40個月和34個月。296個患者中的九十八個(33%)發展復發，包括在手術5年內發展復發的74(25% )個患者。
_8] 改良的預後模型的應用為了估計該模型對患者管理的潛在影響，我們比較了使用該分類器與5年術後列線圖相比較對測試同類者的預後分層的準確度。我們使用基於每個模型的最高準確度的截止值，且隨後將這些應用於測試集(圖3)。在157個測試集患者中，由列線圖預測為低危的136個具有23. 5%的復發率(32/136)。相比之下，當應用於這個組時，該分類器將14個患者鑑定為具有復發的「高危險」，包括具有已記錄的復發的12個患者(86% )。在該分類器對於其賦予「低危」狀態的122個患者中，20個患者(16.4%)經歷PSA復發。相反地，由列線圖預測為「高危」但由分類器預測為「低危」的11個患者無一具有已記錄的復發。因而，該分類器對這個系列的前列腺癌患者賦予除由術後列線圖提供的那種外的另外預後信息。實施例3 RTPCR測定設計用於候選標記和三種(3)對照基因。多重PCR引物和探針設計用於標記。CT值針對3種對照基因的平均值進行標準化。
每種標準化的基因針對DASL信號值進行標繪。將總RNA逆轉錄15，並且用基因特異性引物預擴增。隨後使用ABI PRISMu 7900序列檢測系統(美國應用生物系統公司(APPLIED BIOSYSTEMS))定量預擴增的 cDNA。DPT-1232 3096 正向引物GGGTTGGAAGGATTTCCTGAA(SEQ ID NO I)反向引物CCCTGCACTCATTTTCCTTACTG(SEQ ID NO 2)探針5' Fam-3' MGB 標記的探針 TAGAAGACAAACGTTAGCATAC (SEQ ID NO 3)MYHl 1-5893 460 正向引物GCACTCAAGAGCAAGCTCAGAG(SEQ ID NO 4) 反向引物TCGTTTCCTCGCCTGGTG(SEQ ID NO 5)探針5' Fam-3' MGB 標記的探針 AGGAAACTTCGCAGTGAT (SEQ ID NO 6)SSBP1-291 2990 正向引物AGTTTACCAACTGGGTGATGTCAG(SEQ ID NO 7)反向引物5' Fam-3' MGB TTGATATGCCACGTCTCTGAGG(SEQ ID NO 8)標記的探針ATGGCACAGAATATCAG(SEQ ID NO 9)實施例4 還鑑定了另外的實驗對象組，雖然它與優選實驗對象組相比較是亞最佳的，但憑自身的實力也是有用的。備選實驗對象組各自可用作標準的單獨實驗對象組或與Kattan列線圖組合使用，所述Kattan列線圖的表現通過備選實驗對象組各自得到改善。箭頭符號指示對應於模型的C-指數。Altl FLNC+RASL12+MYLK+FLNA+N0M_H5- > O. 71FLNC+RASL12+MYLK+FLNA- > O. 67Alt2 GASI+SMTN+LMODI+HIST1H3D+N0M_H5- > 0. 74GASI+SMTN+LMODI+HISTIH3D- > 0. 71Alt3 S0RBS1+PDLIM7+LIMS2+MT1X+N0M_H5- > 0. 73S0RBS1+PDLIM7+LIMS2+MT1X- > 0. 69實施例5 還鑑定的是用於剩餘標記的探針和引物對。它們呈現於表3中。實施例6 還開發了用於MYHl 1、DPT和SSBPl以及ALAS、ACTG和TUBA的備選引物和探針組。與實施例3的引物和探針組相比較，結果至少一致或更佳。他們備選引物和探針是DPT558F TGCAGTGGAAAGGGATCGC(SEQ ID NO 10)DPT640R CCCAGATTTGGTATGTGGCA(SEQ ID NO 11)DPT588P_FAM CATAATGTGCCGGATGACTGAATA (SEQ ID NO 12)MYH 5895F GCACTCAAGAGCAAGCTCAGA(SEQ ID NO 13)MYH 5964R TAGAAGGAACGAAAGAGGTCTC(SEQ ID NO 14)
MYH 5925P_0range CCACAGGAAACTTCGCAGTGAT(SEQ ID NO 15)SSBPl ；281F GGGATAGTGAAGTTTACCAAC(SEQ ID NO 16)SSBPl ；359R TTGATATGCCACGTCTCTGA(SEQ ID NO 17)SSBPl ；312P (ORANGE)CAGTCAAAAGACAACATGGCACAG(SEQ ID NO 18)TUBA 586F TTCGCAAGCTGGCTGA(SEQ ID NO 19)TUBA 666R CATGAGCAGGGAGGTGAA(SEQ ID NO 20)TUBA 639P_Cy5(Quasar)AGCTTTGGTGGGGGAACTGGTTCT(SEQ ID NO 21)ALAS918F CAAGTGTCAGTCTGGTGCA (SEQ ID NO 22) ALAS984R GTTGTTTCAAAGTGTCCATAAC(SEQ ID NO 23)ALAS948P_FAM CTAGGAATGAGTCGCCACCCAC(SEQ ID NO 24)ACTG 862F AGCCTTCCTTCCTGGGTAT(SEQ ID NO 25)ACTG 903R TGATGGAGTTGAAGGTGGT(SEQ ID NO 26)ACTG 882P_Cy5(Quasar)GAATCTTGCGGCATCCACGA(SEQ ID NO 27)討論:就與診斷批准平臺一起測量FFPE組織中的小基因集合表達的能力而言，所公開分類器的相對低水平的複雜性也是重要的。這些顯著進展解決了影響在臨床診斷設置中成功實現這種預測工具的可能性的某些關鍵因素。需要極小濃度的衍生自FFPE組織的RNA也促進其對常規病理學樣品包括術前經直腸活組織檢查的潛在長期適用性。前列腺癌相關基因表達的這種系統評價與PSA復發關聯，以便開發具有潛在廣泛臨床效用的在臨床局限性前列腺癌中的復發的基於基因的分類器。使用定製的DASL陣列(允許高流通量基因表達概況分析衍生自FFPE組織的RNA的微陣列平臺)鑑定新型基因預測器(22)。這個研究的關鍵組分是定製的DASL陣列基因集合的設計，所述DASL陣列基因集合基於通過公布數據集的再分析鑑定的基因標記(12，13)、內部基因表達數據(未公布的)、和先前牽涉前列腺癌進展的標記(14，16，17)。這提供了關於在這個研究中最顯著的那30種基因的獨立驗證程度。通過RTPCR進一步驗證在基因表達陣列分析中與PSA復發關聯的24種基因標記，以產生優選的3-基因標誌(DPT、MYH11和SSBP1)，當與建立的列線圖組合時，所述優選的3-基因標誌導致PSA復發的新分類器。隨後在獨立的患者組中驗證這種分類器。DPT和MYHll是新型前列腺癌預後標記，而SSBPl先前已與侵入性前列腺癌相關(17)ο這種新分類器的價值超過用於前列腺癌復發的廣泛使用的列線圖的評價顯示該新分類器鑑定具有復發的低危險和高危險的患者，具有比單獨的術後列線圖大得多的準確度(9)。此處呈現的分類器也能夠將基於常規臨床病理學參數的臨床相關亞組內的患者分層為高危和低危復發組。值得注意的是，分層具有格裡森6和7癌症的患者的能力代表超過目前方法的在預測準確度中的顯著進展。PSA復發作為前列腺癌的顯著終點的用途存在爭議，因為僅一小部分經歷復發的患者進展至臨床顯著疾病。這些關係將得到更明確地確定，因為這個同類者隨著關於轉移和死於PrCa的數據而趨於完善(matures)。然而，明確的是當大多數醫生和患者考慮進一步的治療選項時，上升的前列腺切除術後PSA的檢測是主要決定點(5)。在這個背景下，使用5年列線圖估計這種分類器的潛在影響是有效的，因為大多數前列腺切除術後的生物化學復發在5年內出現。
重要的是當針對前列腺癌中的分子表型和預後的其他公布標誌和基因標記加以考慮時，這種新分類器作為決定工具的影響(12-20)。這個研究是獨特的，特別開發用於幫助預測在具有臨床局限性疾病的前列腺癌患者中的復發危險，因為這些患者代表在美國>80%的新近診斷的 前列腺癌病例。雖然公布的標誌和基因標記已從代表病理學分期譜的患者同類者中鑑定，但這個研究中的訓練和測試同類者限於局限於器官的前列腺癌。在預測工具的開發中使用的患者組與預期靶組之間具有一致性的重要性通過與先前報導相比較的5年列線圖在臨床局限性患者的這個同類者中的相對低表現得到強化。根據進一步分析，這可能是由於在這個研究中僅評價局限於器官的病例的局限性。當對來自相同研究機構的連續前列腺癌患者同類者測試時，所述患者並不限於局限於器官的疾病，列線圖表現與先前研究一致(9，11)。該分類器的相對低水平的複雜性也是重要的。伴隨測量FFPE組織中的小基因集合表達的能力和批准用於在存檔樣品中的診斷測試的平臺的使用，它是顯著的進展，因為它解決了影響在臨床診斷設置中成功實現這種預測工具的可能性的某些關鍵因素。要求低濃度的衍生自FFPE組織的RNA也促進其對常規病理學樣品包括術前經直腸活組織檢查的潛在長期適用性。現在需要在手術和術前活組織檢查的外部同類者中的進一步驗證，包括在活組織檢查中重複基因選擇，以證實這種分類器在術前設置中的更廣泛適用性。用於局限性前列腺癌的準確預測分類器的實現具有對於早期前列腺癌的患者管理的重要牽涉。具有局限性疾病和高危特徵的患者很可能獲益於輔助療法，包括激素、輻射和全身治療，並且該利益應在治療試驗中加以估計(7，28，29)。採用此類試劑的早期臨床試驗在激素抗拒性設置中正在進行，但最終可以在局限性前列腺癌中作為輔助療法進行測試
(30)。這些研究的本質是準確鑑定高危患者，以確保同類的患者組8。相反地，具有復發低危險的患者的改善鑑定將減少這樣的患者的數目，由於通過PSA篩選鑑定的增加數目的無痛癌症，所述患者暴露於治療的發病率。最後，用於局限性前列腺癌的改良預後模型的開發具有利於更佳治療決定的潛力，或者放棄無痛疾病的治療，或者為具有復發高危險的男性提供輔助化學療法。本公開內容中的所有參考文獻由於其所有相關教導在此以引用方式併入本文。參考文獻:I. Ries LAG, Melbert D, Krapcho M等人SEER Cancer Statistics Review (SEER癌症統計評述)，1975-2005。馬裡蘭州的貝塞斯達國家癌症研究所(Bethesda，MD :National Cancer Institute)，張貼至 SEER 網站，20082. Jemal A, Siegel R, Ward E 等人Cancer statistics (癌症統計)，2008。CACancer J Clin (臨床醫師癌症雜誌)2008 ;58 :71。3. Cooperberg MR, Moul Jff 和 Carrol PR The changing face of prostatecancer (前列腺癌的改頭換面)。J Clin Oncol (臨床腫瘤學雜誌)2005 ;23 :8146。4. Wilt TJ SPCG-4 a needed START to PIVOTal data to promote and ProtecTevidence-based prostate cancer care (需要 START 至 PIVOTal 數據以促進且保護基於證據的前列腺癌護理)。J Natl Cancer Inst (國立癌症研究所雜誌)2008 ;100 :1123。5. Scardino PT Localized prostate cancer is rarely a fatal disease (局限性前列腺癌很少是不治之症)。Nat Clin Pract Urol (自然臨床診療泌尿學)2008 ;5 :1。
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訓練同類者測試同類者
特徵(患者數目=J38 )(患者數目=) P值 年齡，歲數
<605856 .50f
>6080102 格裡森評分<65775 .17*
76472
8-101710
未知OI臨床分期
Tl5667 75*
權利要求
1.一種用於區分在前列腺癌的高復發危險類別中的受試者和在前列腺癌的低復發危險類別中的受試者的分類器，所述分類器包括 至少兩種診斷標記的各自表達水平，每種表達水平相對於兩種或更多種對照標記的平均水平進行測量；和 基於Kattan列線圖的預測概率，其與所述至少兩種診斷標記的表達水平組合，以將受試者指定至前列腺癌的高復發危險類別和前列腺癌的低復發危險類別之一。
2.根據權利要求I所述的分類器，其中所述Kattan列線圖是基於下組中的兩個或更多個成員的複合測量術前(和激素療法前，如果接受過該療法的話)PSA值、前列腺切除術時的PSA、手術時的主要格裡森、手術時的次要格裡森、前列腺切除術格裡森總和、前列腺切除術年份、無疾病月數、手術切緣是否是陽性的、癌症是否在精囊中發現、是否存在包膜外延伸、癌症是否在淋巴結中發現(若有被取出)、放射治療前PSA、福射劑量(如果適用)、手術切緣是陽性還是陰性的(如果適用)、是否存在精囊牽涉(如果適用)、是否存在淋巴結牽涉(如果適用)、是否存在包膜外牽涉(如果適用)、是否開出新輔助激素處方、是否開出新輔助放射處方。
3.根據權利要求I所述的分類器，其中所述Kattan列線圖是基於下組中的兩個或更多個成員的複合測量治療前PSA水平、組合的格裡森級別、樣品格裡森總和、臨床分期、手術切緣狀態、在活組織檢查核心中癌症的核心總長度中的前列腺包膜侵襲最大癌症長度、核心陽性水平百分比、前列腺外延伸、前列腺外延伸水平、細胞凋亡指數、一個或多個核心中的癌症百分比、一個或多個核心中的高級別癌症百分比、總腫瘤體積、癌症的定位區、精囊侵襲的存在情況、精囊侵襲的類型、p53、Ki-67、p27、DNA倍性狀態、淋巴結狀態和淋巴管侵襲。
4.根據權利要求I所述的分類器，其包括診斷標記MYHlI、SSBPl和DPT。
5.根據權利要求2所述的分類器，其除MYH11、SSBP1和DPT外還包括選自表2的除組蛋白I H3d外的診斷標記。
6.根據權利要求I所述的分類器，其中所述對照標記是TUBA、ALASl和ACTG1。
7.根據權利要求I所述的分類器，其中所述診斷標記選自表2中呈現的除組蛋白IH3d外的標記集合。
8.根據權利要求I所述的分類器，其中對照標記針對如通過RT-PCR檢測的相對穩定的表達水平而選擇。
9.一種預測前列腺癌復發的方法，其包括測定相對於標準的DPT表達水平；測定來自表2的至少一種另外標記的表達水平；和將所述DPT的表達水平和來自表2的除組蛋白I H3d外的至少一種另外標記的表達水平轉化成對應於前列腺癌的復發概率的評分。
10.根據權利要求9所述的方法，作為轉化步驟的備選，其進一步包括將所述DPT的表達水平和來自表2的除組蛋白I H3d外的至少一種另外標記的表達水平與前列腺癌復發的至少一種另外指示物組合的步驟，以測定複合評分。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述複合評分反映前列腺癌復發的可能性。
12.根據權利要求9所述的方法，其中在選自前列腺切除術、激素療法、單試劑化學療法、雙試劑化學療法和用法尼基轉移酶抑制劑的治療中的至少一種治療前，測定所述DPT的表達水平和來自表2的除組蛋白I H3d外的至少一種另外標記的表達水平。
13.一種用於檢測至少DPT的表達水平的試劑盒，所述試劑盒包括試劑以及第一探針組，其包括特異性識別DPT的第一探針和特異性識別選自表2的除組蛋白I H3d外的第二標記的第二探針。
14.根據權利要求13所述的試劑盒，其還包括裝置，所述裝置用於將所述DPT的表達水平和來自表2的除組蛋白I H3d外的至少一種另外標記的表達水平轉換成前列腺癌復發可能性的指示物。
15.根據權利要求13所述的試劑盒，其中所述裝置是列線圖。
16.根據權利要求15所述的試劑盒，其中所述列線圖作為下組中的一個或多個成員實現機械裝置、圖示和軟體指令，以實現用於提供前列腺癌復發可能性指示物的表示的用戶界面。
全文摘要
本發明公開了使用優選的三基因分類器的表達水平用於測定前列腺癌復發的可能性的方法、裝置和試劑盒。所述方法、裝置和試劑盒可以不依賴於目前在使用中的許多列線圖而使用，或用於改善此類列線圖的總體表現。
文檔編號G01N33/48GK102939534SQ201180017903
公開日2013年2月20日 申請日期2011年3月31日 優先權日2010年4月2日
發明者D.塔蘭託夫, T.傑特克, Y.張, Y.王, J.F.帕爾馬 申請人:維裡德克斯有限責任公司