γ‑聚穀氨酸的發酵工藝的製作方法
2023-07-11 03:38:21 1
本發明涉及微生物發酵
技術領域：
，更具體地說，本發明涉及一種γ-聚穀氨酸的發酵工藝。
背景技術：
：γ-聚穀氨酸在醫藥、食品、農業等領域均有廣泛的應用，其經濟價值不言而喻。在現有技術中，生產γ-聚穀氨酸的主流方法是微生物發酵法。γ-聚穀氨酸產生菌主要有四種：枯草(納豆)芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、耐高溫芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌。儘管對微生物發酵法生產γ-聚穀氨酸進行了大量研究，但γ-聚穀氨酸的產率仍然不樂觀。產率低導致γ-聚穀氨酸的生產成本高，限制了γ-聚穀氨酸的生產與應用。由於γ-聚穀氨酸生物合成的機理至今尚不明確，代謝途徑複雜，目前提高γ-聚穀氨酸產率主要依靠選育優良菌種和優化發酵工藝。因此，提高γ-聚穀氨酸的產率是大規模生產與應用亟待解決的重要課題。技術實現要素：本發明的一個目的是解決至少上述問題，並提供至少後面將說明的優點。本發明還有一個目的是提供一種節省成本、產率高的γ-聚穀氨酸的發酵工藝。為了實現根據本發明的這些目的和其它優點，提供了一種γ-聚穀氨酸的發酵工藝，包括：s1：製備枯草芽孢桿菌種子液；s2：將枯草芽孢桿菌種子液接種於液態發酵培養基中，於37℃、120r/min搖瓶培養12-16h後，得發酵液；採用頻率為10-20khz且功率為5w/ml的超聲波處理髮酵液3-5min後，其中，所述超聲波處理的具體步驟為：每超聲30s後，間隔30s再次超聲；將超聲波處理得到的發酵液低溫保存並加入肽聚糖冷凍膠囊，補料，再繼續37℃、120r/min搖瓶培養96h；s3：對發酵液進行提取、純化，得到γ-聚穀氨酸；其中，製備肽聚糖冷凍膠囊的具體的步驟為：s4：按質量比3:1將肽聚糖和魔芋粉混合，向其中投入質量為肽聚糖2倍的磁化水攪拌，以冷卻速度3℃/min降至4℃，於磁場強度為0.45t的磁場環境保溫保持靜置24h，得肽聚糖混合液；s5：然後將肽聚糖混合液分裝到多個澱粉膠囊殼內，其中每個澱粉膠囊殼盛裝3g步驟s4得到的肽聚糖混合液；s6：再以冷卻速度5℃/min將盛裝肽聚糖混合液的澱粉膠囊殼冷卻至-12℃，保溫6h，得肽聚糖冷凍膠囊。優選地，所述液態發酵培養基的碳源濃度為10-15g/l。優選地，所述的γ-聚穀氨酸的發酵工藝還包括補料工藝，所述補料工藝的具體步驟為：在s2中將發酵液低溫保存後，添加補料維持發酵液中碳源濃度為40-60g/l。優選地，所述補料為甘油和麥芽糖的混合物。優選地，所述補料工藝的補料次數為兩次；第一次補料時間為：在s2中將發酵液低溫保存後；第二次補料與第一次補料的間隔時間為36-40h。優選地，發酵液低溫保存並加入肽聚糖冷凍膠囊的具體步驟為：步驟一:製備預冷至-12℃的肽聚糖冷凍膠囊；步驟二:將發酵液在4℃靜置20分鐘後，在超淨臺中按1顆/15min向發酵液中逐步加入步驟一得到肽聚糖冷凍膠囊4顆，邊加入邊輕輕搖動；步驟三：將發酵液放置入20℃的培養箱靜置20分鐘；步驟四:將發酵液30°培養箱中靜置20分鐘。優選地，超聲30s的具體步驟為：s7：採用頻率為10khz且功率為5w/ml的超聲波發酵液2s；s8：採用頻率為15khz且功率為5w/ml的超聲波發酵液3s；s9：採用頻率為20khz且功率為5w/ml的超聲波發酵液15s；s10：採用頻率為15khz且功率為5w/ml的超聲波發酵液5s；s11：採用頻率為10khz且功率為5w/ml的超聲波發酵液5s。優選地，製備甘油和麥芽糖的混合物的過程為：s12：將質量份數為10的水預熱至60℃，將質量份數為1的麥芽糖緩慢加入到水中，邊加邊攪拌至麥芽糖完全溶解後冷卻到室溫後抽濾，得到第一混合溶液；s13：將s12中得到的第一混合溶液與質量分數為1的甘油完全混合得到第二混合溶液，將第二混合溶液放置在37°培養箱備用。本發明至少包括以下有益效果：一、與現有技術相比較，本發明的γ-聚穀氨酸的產率高，且使用的設備及試劑均是實驗室常用的，故發明是一種節省成本的γ-聚穀氨酸的發酵工藝。二、與現有技術相比較，本發明的γ-聚穀氨酸的產率高達45g/l，故發明是一種節省成本的γ-聚穀氨酸的發酵工藝。本發明的其它優點、目標和特徵將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本發明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。具體實施方式下面結合實施例對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。需要說明的是，下述實施方案中所述實驗工藝，如無特殊說明，均為常規工藝，所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。本發明提供一種γ-聚穀氨酸的發酵工藝，包括：s1：製備枯草芽孢桿菌種子液；s2：將枯草芽孢桿菌種子液接種於液態發酵培養基中，於37℃、120r/min搖瓶培養12-16h後，得發酵液；採用頻率為10-20khz且功率為5w/ml的超聲波處理髮酵液3-5min後，其中，所述超聲波處理的具體步驟為：每超聲30s後，間隔30s再次超聲；將超聲波處理得到的發酵液低溫保存並加入肽聚糖冷凍膠囊，補料，再繼續37℃、120r/min搖瓶培養96h；s3：對發酵液進行提取、純化，得到γ-聚穀氨酸；其中，製備肽聚糖冷凍膠囊的具體的步驟為：s4：按質量比3:1將肽聚糖和魔芋粉混合，向其中投入質量為肽聚糖2倍的磁化水攪拌，以冷卻速度3℃/min降至4℃，於磁場強度為0.45t的磁場環境保溫保持靜置24h，得肽聚糖混合液；s5：然後將肽聚糖混合液分裝到多個澱粉膠囊殼內，其中每個澱粉膠囊殼盛裝3g步驟s4得到的肽聚糖混合液；s6：再以冷卻速度5℃/min將盛裝肽聚糖混合液的澱粉膠囊殼冷卻至-12℃，保溫6h，得肽聚糖冷凍膠囊。本發明在發酵過程中，用超聲波處理髮酵液，可以延長枯草芽孢桿菌處於對數期及穩定期的時間；並且在超聲波處理髮酵液後，用低溫保存的方法，延緩枯草芽孢桿菌的增殖速率及代謝速率，讓其短暫處於修養狀態，並且在低溫保存過程中加入肽聚糖刺激細胞膜的修復，並且在低溫處理後加入補料，補充發酵液的碳源，以免發酵時間延長引起碳源不足，導致細胞提前進入衰亡期。本發明將肽聚糖製備成肽聚糖冷凍膠囊，並且讓其保存在-12℃低溫狀態，而且在製備肽聚糖冷凍膠囊的過程中混合了魔芋粉，都是為了讓肽聚糖在加入到發酵液後，能緩慢釋放，以免複雜的發酵液成分對肽聚糖的破壞。同時，降溫的過程是一個階段性降溫過程，先降溫至4℃，是為了防止一次性降溫溫差大導致肽聚糖的析出。在將溫度從常溫降到4℃採用的是3℃/min的快速冷卻是為了加快試驗進度，從4℃降溫至-12℃採用的是5℃/min的快速冷卻，一方面是為了加快試驗進度，另一方面是為了快速通過最大冰晶區，防止冰晶破壞肽聚糖和魔芋粉形成的凝膠狀態。在肽聚糖和魔芋粉形成凝膠狀態後，將其置於磁場強度為0.45t的磁場環境保溫保持靜置24h，是為了在凝膠的結構不會損壞的情況下，讓肽聚糖和魔芋粉結合力更大。製備肽聚糖冷凍膠囊使用的試劑均為無菌，且製備環境也為無菌，製備出的肽聚糖冷凍膠囊也是無菌。所述液態發酵培養基的碳源濃度為10-15g/l。在發酵前期，枯草芽孢桿菌處於遲緩期，代謝不旺盛，需要的碳源較少，故處於成本的考慮，將液態發酵培養基的碳源濃度設定在10-15g/l。所述的γ-聚穀氨酸的發酵工藝還包括補料工藝，所述補料工藝的具體步驟為：在s2中將發酵液低溫保存後，添加補料維持發酵液中碳源濃度為40-60g/l。液態發酵培養基的碳源濃度設定在10-15g/l，而經過遲緩期碳源基本被耗盡，在細胞進入對數期後，碳源的濃度需要在40-60g/l，才能維持其穩定增長。加入的補料影響發酵的產率，加入補料的體積越小越好。所述補料為甘油和麥芽糖的混合物。碳源選擇甘油和麥芽糖是本發明的一個優選方案，但不僅僅限於此，凡是可以達到補充碳源目的的碳源均在本發明的保護範圍內。所述補料工藝的補料次數為兩次；第一次補料時間為：在s2中將發酵液低溫保存後；第二次補料與第一次補料的間隔時間為36-40h。在發酵液低溫保存後，枯草芽孢桿菌逐步進入對數生長期，為了維持其生長，需要在此時補料。而枯草芽孢桿菌在經過對數生長期後，對碳源的耗費也較大，如果不及時補充碳源會導致其快速進入衰亡期，因此在第一次補料後，間隔36-40h進行第二次補料，第二次補料也維持發酵液中的碳源濃度為40-60g/l。發酵液低溫保存並加入肽聚糖冷凍膠囊的具體步驟為：步驟一:製備預冷至-12℃的肽聚糖冷凍膠囊；步驟二:將發酵液在4℃靜置20分鐘後，在超淨臺中按1顆/15min向發酵液中逐步加入步驟一得到肽聚糖冷凍膠囊4顆，邊加入邊輕輕搖動；步驟三：將發酵液放置入20℃的培養箱靜置20分鐘；步驟四:將發酵液30°培養箱中靜置20分鐘。在加入肽聚糖冷凍膠囊前將發酵液冷卻至4℃，延緩枯草芽孢桿菌的增殖速率及代謝速率，讓其短暫處於修養狀態，同時，便於其適應肽聚糖冷凍膠囊的溫度，加入肽聚糖冷凍膠囊讓其逐步升溫，讓其逐步適應發酵溫度。超聲30s的具體步驟為：s7：採用頻率為10khz且功率為5w/ml的超聲波發酵液2s；s8：採用頻率為15khz且功率為5w/ml的超聲波發酵液3s；s9：採用頻率為20khz且功率為5w/ml的超聲波發酵液15s；s10：採用頻率為15khz且功率為5w/ml的超聲波發酵液5s；s11：採用頻率為10khz且功率為5w/ml的超聲波發酵液5s。逐步提高超聲波頻率，讓枯草芽孢桿菌逐步適應超聲波的刺激，在超聲波達到最大頻率處理後，再逐漸降低超聲波頻率，讓其逐步適應無超聲波刺激的環境，這種梯度設置都是為了保護枯草芽孢桿菌。製備甘油和麥芽糖的混合物的過程為：s12：將質量份數為10的水預熱至60℃，將質量份數為1的麥芽糖緩慢加入到水中，邊加邊攪拌至麥芽糖完全溶解後冷卻到室溫後抽濾，得到第一混合溶液；s13：將s12中得到的第一混合溶液質量分數為1的甘油完全混合得到第二混合溶液，將第二混合溶液放置在37℃培養箱備用。將用於溶解麥芽糖的水預熱到60℃，加快麥芽糖溶解的速率，該種方式比將麥芽糖投入到水中再逐步加熱溶解的方法受熱均勻，避免了出現局部溫度過高破壞麥芽糖的情況。麥芽糖、水、甘油的質量份數比為1:10:1，僅僅是本發明的優選方案。將第二混合溶液放入37℃的環境中，避免補料的加入對發酵液溫度的影響。本發明實施例一：(1)種子液的製備生產γ-聚穀氨酸採用的枯草芽孢桿菌。種子培養基組成為：蛋白腖10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l，ph7.0，其餘為蒸餾水或自來水，裝液量50ml/250ml三角瓶，在121℃滅菌30min，冷卻後，取一環預先保存於斜面培養基的枯草芽孢桿菌接種於種子培養基中，在37℃、120r/min搖瓶培養24h，即成枯草芽孢桿菌種子液。(2)搖瓶發酵培養所述液態發酵培養基的成分：蛋白腖3g/l，檸檬酸1g/l，葡萄糖6g/l，穀氨酸15g/l，nh4cl7g/l，k2hpo40.5g/l,mgso4·7h2o0.5g/l，fecl3·6h2o0.04g/l，cacl2·2h2o0.15g/l，mnso4·h2o0.104g/l，初始ph值為7.0。枯草芽孢桿菌種子液按1％～6％接種量接種於液態發酵培養基，裝液量1l/3l塑料搖瓶，37℃、120r/min搖瓶培養12h，採用頻率為10-20khz且功率為5w/ml的超聲波處理髮酵液3min後，其中，所述超聲波處理的具體步驟為：每超聲30s後，間隔30s再次超聲；將超聲波處理得到的發酵液低溫保存並加入肽聚糖冷凍膠囊，補料，再繼續37℃、120r/min搖瓶培養36h後第二次補料，再繼續37℃、120r/min搖瓶培養60h終止。其中，所述補料為甘油和麥芽糖的混合物，在s2中將發酵液低溫保存及第二次補料後，添加補料維持發酵液中碳源濃度為40g/l。(3)γ-聚穀氨酸的提取將發酵液於3000r/min下離心30min，上清液用1mol/lhcl調ph到3.0，加入4倍體積的95％乙醇，放於4℃下冰箱內過夜。然後於3000r/min下離心30min，用乙醇洗滌沉澱物，收集粘性沉澱物，乾燥得γ-聚穀氨酸產品，所得γ-聚穀氨酸的產率為38g/l。本發明實施例二：(1)種子液的製備，同上。(2)搖瓶培養所述液態發酵培養基的成分：蛋白腖4g/l，檸檬酸1.5g/l，葡萄糖7g/l，穀氨酸15g/l，nh4cl7g/l，k2hpo40.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，fecl3·6h2o0.04g/l，cacl2·2h2o0.15g/l，mnso4·h2o0.104g/l，初始ph值為7.0。枯草芽孢桿菌種子液按1％～6％接種量接種於液態發酵培養基，裝液量1l/3l塑料搖瓶，37℃、120r/min搖瓶培養14h，採用頻率為10-20khz且功率為5w/ml的超聲波處理髮酵液4min後，其中，所述超聲波處理的具體步驟為：每超聲30s後，間隔30s再次超聲；將超聲波處理得到的發酵液低溫保存並加入肽聚糖冷凍膠囊，補料，再繼續37℃、120r/min搖瓶培養38h後第二次補料，再繼續37℃、120r/min搖瓶培養58h終止。其中，所述補料為甘油和麥芽糖的混合物，在s2中將發酵液低溫保存及第二次補料後，添加補料維持發酵液中碳源濃度為50g/l。(3)γ-聚穀氨酸的提取，同上，所得γ-聚穀氨酸的產率為41g/l。本發明實施例三：(1)種子液的製備，同上。(2)搖瓶培養所述液態發酵培養基的成分：蛋白腖5g/l，檸檬酸2g/l，葡萄糖8g/l，穀氨酸15g/l，nh4cl7g/l，k2hpo40.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，fecl3·6h2o0.04g/l，cacl2·2h2o0.15g/l，mnso4·h2o0.104g/l，初始ph值為7.0。枯草芽孢桿菌種子液按1％～6％接種量接種於液態發酵培養基，裝液量1l/3l塑料搖瓶，37℃、120r/min搖瓶培養16h，採用頻率為10-20khz且功率為5w/ml的超聲波處理髮酵液5min後，其中，所述超聲波處理的具體步驟為：每超聲30s後，間隔30s再次超聲；將超聲波處理得到的發酵液低溫保存並加入肽聚糖冷凍膠囊，補料，再繼續37℃、120r/min搖瓶培養40h後第二次補料，再繼續37℃、120r/min搖瓶培養56h終止。其中，所述補料為甘油和麥芽糖的混合物，在s2中將發酵液低溫保存及第二次補料後，添加補料維持發酵液中碳源濃度為60g/l。(3)γ-聚穀氨酸的提取，同上，所得γ-聚穀氨酸的產率為45g/l。對比例：現有γ-聚穀氨酸的發酵工藝中，γ-聚穀氨酸的平均產率為33g/l。γ-聚穀氨酸的產率(g/l)實施例一38實施例二41實施例三45對比例33由表格可知，本發明的三個實施例的產率均比對比例高。儘管本發明的實施方案已公開如上，但其並不僅僅限於說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用於各種適合本發明的領域，對於熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同範圍所限定的一般概念下，本發明並不限於特定的細節和這裡示出與描述的實施例。當前第1頁12