包括胎盤提取物的細胞保護劑的製作方法

2023-09-10 07:23:35 3

專利名稱：包括胎盤提取物的細胞保護劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及包括胎盤提取物的細胞保護劑，更具體地，涉及用於儲存和保護動物細胞的細胞保護劑，所述細胞保護劑包括胺基酸、礦物質、維生素、生長因子和胎盤提取物。
背景技術：
通常，細胞是在_196°C的極低溫度下冷凍保藏，並在需要活細胞時迅速解凍獲得。儘管凍融細胞(frozen-and-then-thawed cells)的存活率根據細胞類型或操作員的熟練程度而不同，但是正常且有用的細胞，非癌症細胞，的存活率非常低。另外，在只需要運輸或儲存幾小時或幾天，而並非長期運輸或儲存的情況下，深低溫保藏(cryopreservation)法是不實際的。
近來，正在開發使用從動物組織分離的成熟細胞或幹細胞來治療各種疾病的細胞治療技木。因此，強烈需要開發出能長時間維持從組織獲得的成熟細胞和幹細胞的存活性(viability)並提供更佳保藏的保護劑。目前，暫時將用於培養動物細胞的培養基用作細胞保護劑，而關於專用於保藏細胞的有用保護劑的研究很少。針對人類幹細胞培養，使用包括動物血清(胎牛血清)的培養基。由於使用胎牛血清培養的細胞即使在用無血清溶液洗滌細胞後，仍舊與感染狂牛症或其他疾病的風險相關，因此美國禁止將使用胎牛血清培養的細胞移植給人類。從人骨髓以及從脂肪組織中分離間充質幹細胞(mesenchymal stem cell)的技術分別公開於Pittenger et al. [Science284 143-147，1997]和 Van et al. [J. Clin. Invest. 58 699-704，1976]，其中使用a-MEM或DMEM和10_20%胎牛血清來培養細胞。然而，動物血清(胎牛血清)的使用在涉及向人體移植的安全性方面具有爭議。
為了克服這ー問題，嘗試使用人血清代替胎牛血清[Kuznetsov SA, et al.,Transplantation. 2000Dec 27; 70 (12) : 1780-7]。然而，當細胞培養基中使用人血清而不進行任何處理時，幹細胞容易喪失它們的特性，例如増殖和分化能力降低、易於分化成骨細胞等等。另外，移植後，幹細胞的存活性極低並且不會完全發揮它們的能力。為了優化成體幹細胞的組織再生，需要對提高移植的幹細胞的存活性以及優化並提高移植效果的技術進行研究。

發明內容
技術問題因此，本發明的目的是提供一種細胞保護劑，所述細胞保護劑相比於現有的動物細胞培養基能夠提高在低溫下儲存的細胞的存活性，井能夠提高幹細胞的増殖和能力(capability)。技術方案本發明的發明者們致カ於解決前述現有技術的問題。結果，他們開發了ー種包括胺基酸、礦物質、維生素、生長因子和胎盤提取物的細胞保護劑，並證實該細胞保護劑能夠不使用動物血清而提高動物細胞的存活性且能夠增強幹細胞的能力。有益效果本發明的細胞保護劑可用於安全地儲存細胞，不僅是幹細胞而且還有各種其他的動物細胞。當用於細胞治療的細胞在低溫儲存和運輸時，該細胞保護劑可用於保護所述細胞。當在培養前用本發明的細胞保護劑處理動物細胞時，可獲得提高的細胞増殖率和幹細胞能力。因此，本發明的細胞保護劑作為保藏細胞以及提高幹細胞能力的保護劑是非常有用的。


通過下面結合附圖對給出的優選實施方式的描述，本發明的上述以及其他目的、特徵和優點將顯而易見，在附圖中圖I比較了在對照培養基或在本發明的CeLLGUARD溶液中低溫(4°C )儲存了 72小 時的從脂肪組織中分離的脂肪細胞在沒有培養時的細胞存活率；圖2a比較了用對照培養基或CeLLGUARD處理的源自脂肪組織的間充質幹細胞的幹細胞能力；圖2b比較了用對照培養基或CeLLGUARD處理的源自脂肪組織的間充質幹細胞的細胞増殖率；圖3a比較了用對照培養基或CeLLGUARD處理的源自脂肪組織的間充質幹細胞在7天、10天和14天的細胞增殖率；圖3b示出了用對照培養基或者CeLLGUARD處理源自脂肪組織的間充質幹細胞後，鑑定表面表達標記的結果；圖4a和圖4b比較了用對照培養基或CeLLGUARD處理的間充質幹細胞癒合傷ロ的效果;圖5示出了在用對照培養基或CeLLGUARD處理從皮膚組織分離的角質形成細胞(keratinocyte)並培養後,鑑定表面表達標記的結果；以及圖6比較了從皮膚組織分離的角質形成細胞在用對照培養基或CeLLGUARD處理後，培養後的幹細胞能力。最佳實施方式下文中，將參考附圖詳細描述本發明的實施方式。一方面，本發明提供ー種包括胺基酸、礦物質、維生素、生長因子和胎盤提取物的細胞保護劑。在本發明中，細胞保護劑指ー種培養基組成，所述組成用於在低溫或者室溫下儲存動物細胞幾小時至幾天，直至所述動物細胞被用於實驗、操作或處理。細胞保護劑與為了生長和増殖特定細胞所優化的普通動物細胞培養基在組成、含量和使用上不同。儘管本發明的細胞保護劑可作為培養細胞的添加劑而添加，但是它自身不足以用作培養基。也即，對於特定細胞的培養和生長來說，推薦使用針對它們優化的培養基，而並不推薦使用本發明的細胞保護劑自身作為培養基。所述細胞保護劑可用於保藏細胞，添加到培養基中以提高細胞的存活性或生長，或者在細胞在充分培養基中生長之前處理細胞。本發明的細胞保護劑可用於動物細胞，優選幹細胞，更優選成體幹細胞。通常，動物細胞需要胺基酸、礦物質、維生素等以便存活。通常使用的動物細胞培養基包括這些成分。儘管本發明的細胞保護劑也包括諸如胺基酸、礦物質、維生素等的那些成分，但是細胞保護劑中的這些成分的組成和含量與動物細胞培養基不同，因為細胞保護劑的目的是保藏各種動物細胞而不是培養或增殖細胞(參見表1-4)。在本發明實施例I中，對脂肪細胞執行細胞存活性測試。當細胞在低溫下儲存72小時，獲得了至少70%的存活性(參見表I)。此外，角質形成細胞和脂肪源性幹細胞的細胞増殖率和幹細胞能力的測試結果也顯著優於現有動物細胞培養基的測試結果(參見圖2和圖6)。現有動物細胞培養基包括動物血清作為營養成分。儘管這有助於細胞穩定生長，但是當細胞保護劑中包括動物血清並且室溫或低溫(非超低溫)下長期放置時，會導致細胞存活性降低。然而，由於本發明的細胞保護劑並非用於培養或増殖細胞，而是用於提高細胞存活性直至該細胞被用於實驗或操作，因此本發明的細胞保護劑是無血清的並且含有為更大量存活所需的成分。 尤其是，本發明的細胞保護劑可有用地用於保藏幹細胞。對於近來研究很多的細胞治療，本發明的細胞保護劑可用作能儲存並運輸幹細胞的保護劑。此外，通過用本發明的細胞保護劑處理幹細胞，可提高幹細胞的能力。當處理幹細胞時，本發明的細胞保護劑降低了細胞死亡並活化了細胞。因此，本發明的細胞保護劑對於穩定幹細胞是非常有用的。優選地，在本發明的細胞保護劑中，除了組成蛋白質的20種基本胺基酸以外，胺基酸還包括L-胱氨酸和L-輕脯氨酸(L-Hydroproline)。L-羥脯氨酸用於抵禦還原的DNA的氧化攻擊，修復受損DNA並產生膠原蛋白。它
作為向膠原蛋白生物合成和維持的必需胺基酸-輕脯氨酸(hydroxyproline)和輕賴氨
酸提供羥基的供體，是膠原蛋白生物合成中的必要輔因子。因此，預計L-羥脯氨酸起到抗氧化劑的作用來除去反應性氧物種並防止細胞死亡。L-胱氨酸含有硫並且是毛髮或角(horn)的組分。尤其是，L-胱氨酸以約10%的量存在於角蛋白中，並且易於還原成L-半胱氨酸。L-胱氨酸在決定多肽的三級結構以及酶或激素的活性中起到重要作用。因此，L-胱氨酸對於細胞活性有重要作用。優選地，在本發明的細胞保護劑中，除了細胞生長所需的諸如鈣、鈉、鉀、銅、鉄、鎂和鋅之類的一般元素以外，礦物質還包括痕量元素鋯、鍺和釩。本發明的細胞保護劑中包括的礦物質可以以無機鹽的形式存在，例如ZrOCl2 8H20, GeO2和NaV03。優選地，在本發明的細胞保護劑中，維生素包括能夠抑制反應性氧物種的泛酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、肌醇和抗壞血酸。礦物質和維生素用於除去細胞(例如抗氧化作用)產生的毒性物質並促進細胞代謝，由此提高細胞存活性。這些功能被認為是通過本發明的細胞保護劑中包括的成分間的相互作用而獲得的。優選地，在本發明的細胞保護劑中，生長因子包括鹼性成纖維生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)和血小板源性生長因子(PDGF)。這些生長因子是細胞存活所必需的並且也影響細胞的活化。除了生長因子以外，本發明的細胞保護劑可進ー步包括血清替代物，例如白蛋白。優選地，細胞保護劑的前述成分以下面的含量存在基於整個保護劑計，胺基酸0.5 M 20g/L,維生素0. 01至I. Og/L，礦物質I. 0至100g/L以及生長因子0. 001至0. Img/し在本發明的細胞保護劑中，包括有胎盤提取物，以在存儲期間保持細胞存活，並且如果需要還能在儲存後的培養期間提高細胞活性。可以是胎盤提取物或者胎盤水解產物。基於保護劑的總重量計，胎盤提取物或者胎盤水解產物可以以l_20wt%，優選5_20wt%的量包括在細胞保護劑中。胎盤提取物可通過用鹽酸水解來自對こ型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)以及人免疫缺陷病毒(HIV)呈陰性的健康人的胎盤而製備。具體地，為了使病毒或類似物失活，用鹽酸在超過101°C處理胎盤至少I小時，然後通過約121°C的高壓蒸汽處理60分鐘進行滅菌。胎盤水解產物可通過用丙酮處理胎盤以除去脂肪並用胃蛋白酶和鹽酸進行充分水解來製備。在本發明的實施例中，使用從Hwa Sung Bio Pharm市售購得的胎盤提取物和胎盤水解產物。
在本發明優選的實施方式中，細胞保護劑包括表1-4中列出的成分。本發明的發明者們開發的細胞保護劑，被稱作「CeLLGUARD」，的組分和含量列於表1_4中。本發明的細胞保護劑可用於提高在0-37°C下，優選在0-10°C的低溫下，更優選在
0-4°C的低溫下，最優選在4°C的低溫下，儲存的細胞的存活性。不同於用於細胞増殖和分化的現有幹細胞培養基，本發明的細胞保護劑提高了幹細胞的能力以及幹細胞的細胞増殖率，而不改變細胞特性。當用本發明的細胞保護劑處理幹細胞然後培養時，幹細胞増殖良好並且具有提高的幹細胞能力。在本發明的實施例2和3中，測量了脂肪源性間充質幹細胞的幹細胞能力和細胞増殖率。結果掲示，相比於現有幹細胞培養基，本發明的細胞保護劑具有顯著的效果。本發明的細胞保護劑可用於儲存和運輸細胞治療劑，以增強細胞治療劑的療效。術語「細胞治療劑」指ー種用於治療、診斷或預防疾病目的的新概念藥物，所述藥物通過體外増殖或篩選自體的、同種異體的或者異種的活細胞，或者以其他方式改變細胞的生物特性，以恢復或提高所述細胞和組織的功能。具體地，患者自身或者其他動物的體細胞可增殖，或者幹細胞可分化成想要的細胞，以治療燒傷或諸如癌症、痴呆(dementia)等的各種不愈症。在這方面，美國正在進行成百種臨床實驗，而韓國也在積極進行研究。在用於細胞治療的細胞應用前,安全地儲存和運輸它們非常重要。大部分的動物細胞，特別是幹細胞，在從它們的組織中分離後就死亡或者失活。在本發明的實施例I中，使用現有的脂肪細胞培養基或本發明的細胞保護劑，將從脂肪組織分離的脂肪細胞在4°C的低溫下儲存72小吋，然後測量細胞存活性。使用本發明的細胞保護劑儲存的細胞顯示出70%或更高的細胞存活率，而使用現有的脂肪細胞培養基儲存的細胞顯示出50%或更低的細胞存活率。因此，本發明的細胞保護劑對於細胞在用於細胞治療前保持細胞存活非常有用。發明實施方式現在將描述實施例和實驗。下面的實施例和實驗僅僅是用於說明的目的，而不旨在限制本公開內容的範圍。製備例I :細胞保護劑的製備通過將表I列出的胺基酸、表2列出的礦物質、表3列出的維生素和表4列出的其他組分混合，製備本發明的細胞保護劑，並命名為「CeLLGUARD」。作為對照，對脂肪源性間充
質幹細胞使用Invitrogen的進ー步含有10%胎牛血清的DMEM/F12 (I: I)培養基，而對角質
形成細胞使用Lonza的KGM培養基。[表I]胺基酸
權利要求
1.一種細胞保護劑，包括胺基酸、礦物質、維生素、生長因子和胎盤提取物。
2.根據權利要求I的細胞保護劑，其中所述胺基酸除了組成蛋白質的基礎胺基酸以夕卜,還包括L-胱氨酸和L-羥脯氨酸。
3.根據權利要求I的細胞保護劑，其中所述礦物質除了細胞生長所需的一般元素以外，還包括痕量元素錯、鍺和鑰；。
4.根據權利要求I的細胞保護劑，其中所述維生素包括能夠抑制反應性氧物種的泛酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、肌醇和抗壞血酸。
5.根據權利要求I的細胞保護劑，其中所述生長因子包括鹼性成纖維生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)和血小板源性生長因子(PDGF)。
6.根據權利要求I的細胞保護劑，其中所述胎盤提取物是胎盤的提取物或者胎盤的水解產物。
7.根據權利要求I的細胞保護劑，所述細胞保護劑包括表1-4中列出的成分。
8.根據權利要求I的細胞保護劑，所述細胞保護劑提高在0-37°C下儲存的細胞的存活性。
9.根據權利要求I的細胞保護劑，所述細胞保護劑提高幹細胞的能力和細胞增殖率但不改變細胞特性。
10.根據權利要求I的細胞保護劑，所述細胞保護劑用於儲存和運輸細胞治療劑以增強所述細胞治療劑的療效。
全文摘要
本發明公開了一種包括胎盤提取物的細胞保護劑，更具體地，一種用於儲存和保護動物細胞的細胞保護劑，包括胺基酸、礦物質、維生素、生長因子和胎盤提取物。
文檔編號A61K31/195GK102791278SQ201080064653
公開日2012年11月21日 申請日期2010年4月20日 優先權日2010年2月26日
發明者李定宣, 李彩軟, 柳洋桓, 蔡炳哲 申請人:現代細胞與組織技術公司