具有改良的生長特性的植物以及製備所述植物的方法

2023-09-09 21:39:35

專利名稱：具有改良的生長特性的植物以及製備所述植物的方法
技術領域：
本發明一般地涉及分子生物學領域，並且涉及一種改良植物生長特性的方法。更具體地說，本發明涉及通過在植物中引入和表達編碼小亞基核糖體蛋白(S3a)的核酸而改良植物生長特性尤其是產率的方法。本發明還涉及其中引入了S3a編碼核酸的植物，該植物相對於對應的野生型植物具有改良的生長特性。
不斷增長的世界人口和可用於農業的可耕地的不斷減少的供給，激起農業研究向提高農業的效率發展。農作物和園藝改良的傳統手段利用選育技術來鑑定具有期望特性的植物。然而，這樣的選育技術具有若干缺點，即這些技術一般是勞動密集型的，而且產生通常含有異質遺傳組分的植物，這並非總是產生自親本植物傳遞過來的期望性狀。分子生物學的發展已經允許人類修飾動物和植物的種質。植物的遺傳工程需要分離和操作遺傳物質(一般是DNA或RNA的形式)，隨後需要把該遺傳物質導入到植物中。這種技術能夠提供具有多種改良的經濟學、農藝學或園藝性狀的作物或植物。一種具有特殊經濟利益的性狀是產率。產率通常定義為作物產生的可衡量經濟價值。這可以從數量和/或質量方面定義。產率直接取決於幾個因素，例如，器官的數量和大小，植物結構(例如，分枝的數量)，種子產量等等。根的發育、營養吸收和應激耐受性也是確定產率的重要因素。可以通過優化上述因素之一來提高作物產率。
20世紀70年代早期，蔗糖梯度分析浮現了核糖體裝配途徑的輪廓。這些研究鑑定了3種主要的前核糖體顆粒。早期的90S顆粒(『S』是沉積速率)隨後被加工成66S和43S的前核糖體，它們分別為成熟的60S和40S亞基的前體。60S亞基經加工後由25S、5.8S和5S的核糖體RNA組成。在成熟過程中，許多蛋白質將相互作用而產生最終的結構。40S亞基由18S核糖體RNA組成，而且在成熟複合物形成之前，同樣有許多蛋白質相互作用。這兩種亞基裝配成大的複合物，其中40S小亞基結合mRNA和tRNAs，而大亞基催化肽鍵形成。核糖體質量的大約2/3由RNA組成，而1/3由蛋白質組成。蛋白質依其所屬的核糖體亞基命名小亞基(S1至S31)和大亞基(L1至L44)。多數蛋白質與通常來自不同結構域的多個RNA元件相互作用，以構成並穩定rRNA三級結構。儘管解碼和肽移位的關鍵活性是基於RNA的過程，但蛋白質在可能已經進化為蛋白質合成過程流水線的功能方面起著積極的作用。除了它們典型的核糖體作用，許多核糖體蛋白還具有非核糖體作用，如DNA修復。
S3a(cyc07)在1991年首次克隆。它編碼40S的核糖體蛋白(小亞基)，與v-fos轉化效應因子(由人和大鼠的fte-1基因編碼)、TNF-α誘導的小鼠TU-11基因同源，且類似於酵母PLC1和PLC2。哺乳動物fte-1、植物cyc-07和酵母PLC2都已表明是細胞周期調控的，而且在核糖體水平上參與蛋白質的合成。
改良植物的各種生長特性的能力，將在諸如作物增強、植物育種、觀賞植物的生產、樹木栽培學、園藝學、林學、用於生物反應器的藻類的生產(用於物質如藥物、抗體或疫苗的生物工藝學生產，或是有機廢物的生物轉化)等領域及其它這樣的領域中具有許多應用。
現已發現，在植物中引入和表達編碼小亞基核糖體蛋白(S3a)的核酸，產生了相對於對應的野生型植物而言具有改良的生長特性的植物。因此，根據本發明的一個實施方案，提供了一種用於改良植物的生長特性的方法，包括在植物中引入和表達編碼S3a的核酸。
最好地，通過實施本發明的方法，產生具有多種改良的生長特性的植物，尤其是增加的產率，特別是種子產率。
如文中所定義的術語「增加的產率」分別用來指相對於對應的野生型植物，在如下的一個或多個方面的增加(i)植物一個或多個部分增加的生物量(重量)，特別是地上(可收穫)部分，增加的根生物量或增加的任何其它的可收穫部分的生物量，(ii)增加的種子產率，其可能源於增加的種子生物量(種子重量)，可能是每株植物種子重量的增加或個別種子基礎上的增加，並且所述種子重量的增加可能是因改變的種子大小所致，如種子長度和/或種子寬度和/或種子面積；(iii)增加的(飽滿)種子數量；(iv)增加的種子大小，這可能也影響種子的組成；(v)增加的種子體積，這也可能影響種子的組成；(vi)增加的收穫指數，其可以表達為可收穫部分如種子的產率佔總生物量的比率；和(vii)增加的千籽粒重(TKW)，是從計數的飽滿種子的數量和它們的總重量推斷的。增加的TKW可能源於增加的種子大小和/或種子重量。
根據本發明的一個優選實施方案，產率的增加涵蓋如上文(ii)至(vii)中任何一項或多項所定義的種子水平上的產率增加。
以穀物為例，產率增加可表現為下列一個或多個方面每公頃或每英畝植株數的增加，每株植物穗的增加，行數、每行種仁數、粒重、千籽粒重、穗長度/直徑的增加，等等。以稻為例，產率增加可表現為下列一個或多個方面的增加每公頃或每英畝植株數，每株植物的花序數，每個花序上的小穗數，每個花序上的花數，種子飽滿率的增加、千籽粒重的增加，等等。產率的增加可能還導致改變的結構，或可能作為改變的結構的結果發生。
根據本發明的一個優選的特點，實施本發明的方法產生了具有增加的產率的植物，其分別表現為相對於對照植物的如下至少一個方面增加的TKW，增加的(飽滿)種子數，增加種子重量和增加的收穫指數。因此，根據本發明，提供了一種用於增加植物產率的方法，該方法包括在植物中引入和表達編碼S3a多肽的核酸。
因為根據本發明的轉基因植物具有增加的產率，相對於處於其生活周期的相應階段的對應野生型植物的生長速率而言，這些植物很可能顯示出增加的生長速率(在它們至少部分的生活周期期間)。增加的生長速率可能是植物的一個或多個部分(包括種子)特異性的，或可能是基本上整個植株的。具有增加的生長速率的植物甚至可能顯示出早期開花。生長速率的增加可能發生在植物生活周期的一個或多個階段，或基本上在整個植物生活周期期間。植物生活周期早期增加的生長速率可能反映增強的生長力。生長速率的增加可能改變植物的收穫周期，使得植物能夠比可能的情形更晚播種和/或更早收穫。如果生長速率充分增加，可能允許播種相同植物物種的更多種子(例如播種和收穫稻類植物，接著播種和收穫更多的稻類植物，所有這些都在一個傳統的生長期內)。類似地，如果生長速率充分增加，可能允許播種不同植物物種的更多種子(例如播種和收穫稻類植物，接著，例如，播種和任選地收穫大豆、馬鈴薯或任何其它合適的植物)。就有些植物來說，從同一根莖收穫增加的次數也是可能的。改變植物的收穫周期可能導致每英畝年生物量產量的增加(由於(比方說在一年裡)任何特定植物生長和收穫的次數增加)。生長速率的增加還可能允許在比它們的野生型對應物更廣的地理區栽培轉基因植物，因為種植作物的地區限制常常由種植時(早季)或收穫時(晚季)不利的環境條件所決定的。如果縮短收穫周期，可以避免這些不利條件。生長速率可通過從生長曲線繪圖生長實驗獲得各種參數來確定，這些參數可以是T-Mid(植株達到其最大大小的50％所需的時間)和T-90(植物達到其最大大小的90％所需的時間)，等等。
實施本發明的方法產生具有增加的生長速率的植物。因此，根據本發明，提供了一種用於增加植物的生長速率的方法，該方法包括在植物中引入和表達編碼S3a多肽的核酸。生長速率的增加這裡例示為分別相對於對照植物/對應的野生型植物而言，TKW增加、(飽滿)種子數增加的種子重量增加以及收穫指數增加。
與對照植物相比，在植物處於非應激狀態下或植物接觸多種應激時發生產率和/或生長速率的增加。植物一般通過更為緩慢地生長來應答所接觸的應激。在嚴重的應激下，植物甚至可能完全停止生長。另一方面，中度應激在文中定義為植物接觸的任何不會導致植物完全停止生長的應激。由於耕作方法(灌溉、施肥、殺蟲劑處理)的進步，栽培的作物植物常常不會遭遇到嚴重的應激。因此，中度應激誘導的受損生長常常是農業不期望的特點。中度應激是植物可能接觸的典型應激。這些應激可能是植物接觸的日常生物的和/或非生物(環境)應激。典型的非生物或環境應激包括由反常的熱或冷/冷凍溫度引起的溫度應激；鹽脅迫；水脅迫(乾旱或過量水分)。非生物應激也可能是化學品引起的。生物應激一般是由病原體如細菌、病毒、真菌和昆蟲引起的那些應激。
最好可在任何植物中改變上述的生長特性。
如文中所用的術語「植物」包含整個植物，植物的祖先和後代，以及植物的部分，包括種子，枝條，莖，葉，根(包括塊莖)，以及組織和器官，其中上述的每一種都包含目的基因。術語「植物」還包含胚，分生組織區域，配子體，孢子體，花粉與小孢子，同樣其中上述的每一種也都含有目的基因。
尤其可用於本發明方法的植物包括屬於植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，特別是單子葉和雙子葉植物，包括飼料或飼料豆科植物，觀賞植物，糧食作物，選自如下物種的喬木或灌木金合歡屬物種(Acaciaspp.)、槭樹屬物種(Acer spp.)、獼猴桃屬物種(Actinidia spp.)、七葉樹屬物種(Aesculus spp.)、紐西蘭貝殼杉(Agathis australis)、Albiziaamara、Alsophila tricolor、須芒草屬物種(Andropogon spp.)、落花生屬物種(Arachis spp.)、檳榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、Astragaluscicer、Baikiaea plurijuga、樺木屬(Betula spp.)、芸苔屬(Brassica spp.)、木欖(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkea africana、紫鉚(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱纓花屬物種(Calliandra spp.)、大葉茶(Camelliasinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒屬物種(Capsicum spp.)、決明屬物種(Cassia spp.)、距豌豆(Centroema pubescens)、木瓜屬物種(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffeaarabica)、Colophospermum mopane、Coronillia varia、Cotoneaster serotina、山楂屬物種(Crataegus spp.)、香瓜屬物種(Cucumis spp.)、柏木屬物種(Cupressus spp.)、Cyathea dealbata、榲桲(Cydonia oblonga)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅屬物種(Cymbopogon spp.)、Cyntheadealbata、榲桲(Cydonia oblonga)、Dalbergia monetaria、大葉骨碎補(Davallia divaricata)、山馬蟥屬物種(Desmodium spp.)、粗糙蚌貝蕨(Dicksonia squarosa)、Diheteropogon amplectens、Dioclea spp、鐮扁豆屬物種(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、Echinochloa pyramidalis、Ehrartia spp.、穇子(Eleusine coracana)、畫眉草屬物種(Eragrestis spp.)、刺桐屬物種(Erythrina spp.)、桉屬物種(Eucalyptus spp.)、Eucleaschimperi、Eulalia villosa、蕎麥屬物種(Fagopyrum spp.)、費約果(Feijoasellowiana)、草莓屬物種(Fragaria spp.)、千斤拔屬物種(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geranium thunbergii、銀杏(Ginkgo biloba)、Glycinejavanica、Gliricidia spp、陸地棉(Gossypium hirsutum)、銀樺屬物種(Grevillea spp.)、Guibourtia coleosperma、巖黃芪屬物種(Hedysarumspp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、扭黃茅(Heteropogon contortus)、大麥(Hordeum vulgare)、Hyparrhenia rufa、小連翹(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、白花庭藍(Indigo incarnata)、鳶尾屬物種(Iris spp.)、Leptarrhena pyrolifolia、胡枝子屬物種(Lespediza spp.)、Lettuca spp.、Leucaena leucocephala、Loudetia simplex、羅頓豆(Lotonus bainesii)、百脈根屬物種(Lotus spp.)、Macrotyloma axillare、蘋果屬物種(Malusspp.)、Manihot esculenta、紫苜蓿(Medicago sativa)、水杉(Metasequoiaglyptostroboides)、粉芭蕉(Musa sapientum)、菸草屬物種(Nicotianumspp.)、驢食豆屬物種(Onobrychis spp.)、Ornithopus spp.、稻屬物種(Oryzaspp.)、Peltophorum africanum、狼尾草屬物種(Pennisetum spp.)、Perseagratissima、碧冬茄屬物種(Petunia spp.)、菜豆屬物種(Phaseolus spp.)、檳榔竹(Phoenix canariensis)、Phormium cookianum、石楠屬物種(Photiniaspp.)、白雲杉(Picea glauca)、松屬物種(Pinus spp.)、豌豆(Pisumsativum)、紐西蘭羅漢松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、楊屬物種(Populus spp.)、牧豆樹(Prosopiscineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、西洋梨(Pyrus communis)、櫟屬物種(Quercus spp.)、Rhaphiolepsisumbellata、美味棒花棕(Rhopalostylis sapida)、Rhus natalensis、歐洲醋慄(Ribes grossularia)、茶藨子屬物種(Ribes spp.)、洋槐(Robiniapseudoacacia)、薔薇屬物種(Rosa spp.)、懸鉤子屬物種(Rubus spp.)、柳屬物種(Salix spp.)、Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitysverticillata)、北美紅杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendrongiganteum)、兩色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜屬物種(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburus alopecuroides、Stylosanthos humilis、葫蘆茶屬物種(Tadehagi spp.)、落羽松(Taxodium distichum)、阿拉伯黃背草(Themeda triandra)、車軸草屬物種(Trifolium spp.)、小麥屬物種(Triticum spp.)、異葉鐵杉(Tsuga heterophylla)、越桔屬物種(Vacciniumspp.)、野豌豆屬物種(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、錐穗沃森花(Watsonia pyramidata)、馬蹄蓮(Zantedeschia aethiopica)、玉米(Zeamays)、莧屬植物、朝鮮薊、蘆筍、椰菜、孢子甘藍、捲心菜、canola、胡蘿蔔、花椰菜、芹菜、羽衣甘藍綠葉植物、亞麻、無頭甘藍、小扁豆、油菜、秋葵、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、茶葉和藻類，等等。根據本發明的一個優選實施方案，植物是作物如大豆，向日葵，芸苔，紫花苜蓿，油菜籽，棉花，番茄，馬鈴薯或菸草。更進一步優選地，植物是單子葉植物，如甘蔗。更優選地，植物是穀類，如稻，玉米，小麥，大麥，粟，黑麥，高粱或燕麥。
術語S3a是本領域熟知的。下表1中給出的S3a的可選擇名稱來自Naora和Naora(Immunology and Cell Biology(1999)77，197-205)。
表1S3a的同系物和命名
通過將查詢序列(優選蛋白質序列)與已知的S3a蛋白序列進行比對，可以很容易地鑑定S3a(例如參見圖1和2所示的序列比對)。例如，可使用VNTI AlignX序列多重比對程序(InforMax，Bethesda，MD)，採用空位開放罰分為10、空位延伸罰分為0.05的預設設置，對查詢序列(與已知的S3a序列)進行比對。因為S3a序列是高度保守的，通過把查詢序列的任何保守區域與已知S3a序列的那些區域進行比較，本領域普通技術人員能很容易地鑑定其它的S3a序列。這些高度保守的區域在圖2中以3個框區圖解說明。因此，具有相應的保守區域的查詢序列將鑑定為S3a。還已表明S3a與真核起始因子eIF-2和eIF-3結合(Westermann等(FEBSLetters Vol.97，No.1(1979年1月))。
如文中所用的術語「S3a」用於指蛋白質，當其用於序列比對時[例如圖1或2所示的比對]，是與已知的S3a蛋白序列比對且包含與圖2序列比對中所示的框區相應的保守區域。文中提及的S3a編碼核酸是指編碼這樣的蛋白質的核酸，當其用於序列比對時[例如圖1或2所示的比對]，是與已知的S3a蛋白序列比對且包含與圖2序列比對中所示的框區相應的保守區域。如上定義的S3a和S3a編碼核酸在本發明的方法中是有用的。
待導入到植物中的核酸可以是如上定義的任何S3a編碼序列。核酸優選如SEQ ID NO1所示。待導入到植物中的核酸優選與組成型啟動子有效連接以在植物中過表達。組成型啟動子優選是GOS2啟動子，更優選來自稻的GOS2啟動子。顯然，本發明的應用不局限於SEQ ID NO1所示的S3a，當由GOS2啟動子驅動時，本發明的應用也不局限於S3a基因/核酸的表達。
根據本發明的一個優選方面，考慮增強的或增加的S3a核酸的表達。本領域已經充分報導了獲得增強的或增加的基因或基因產物表達的方法，例如，其包括由強啟動子驅動的過表達，轉錄增強子或翻譯增強子的使用。
編碼S3a的核酸可以來源於任何來源。編碼S3a的核酸/基因可以分離自微生物來源，如細菌、酵母或真菌，或分離自植物、藻類或動物(包括人)來源。可通過深思熟慮的人為操作，對處於組合物和/或基因組環境中的核酸的天然形式進行修飾。核酸優選是同源核酸，即獲自植物的核酸可以是來自其將被導入其中的相同的植物物種，也可以是來自不同的植物物種。核酸可以分離自雙子葉種類，優選來自十字花科，還優選分離自擬南芥(Arabidopsis thaliana)。更優選地，分離自擬南芥的S3a如SEQ ID NO1所示，其胺基酸序列如SEQ ID NO2所示。
SEQ ID NO1所示的序列描述了來自擬南芥的S3a，SEQ ID NO2是相應的胺基酸序列。最好地，本發明的應用不局限於使用如SEQ ID NO1所示的來自擬南芥的S3a。也可使用如上文定義的任何S3a或S3a編碼序列來實施本發明的方法。
用於實施本發明方法的S3a或S3a編碼核酸可以是(i)S3a編碼核酸的部分，優選如SEQ ID NO1所示的S3a編碼核酸的部分；(ii)能與S3a編碼核酸雜交的序列，優選能與如SEQ ID NO1所示的S3a編碼核酸雜交的序列；(iii)S3a編碼核酸的可選擇剪接變體，優選如SEQ ID NO1所示的S3a編碼核酸的可選擇剪接變體；(iv)S3a編碼核酸的等位變體，優選如SEQ ID NO1所示的S3a編碼核酸的等位變體；和(v)S3a蛋白/胺基酸的同系物和衍生物，優選如SEQ ID NO2所示的S3a蛋白的同系物和衍生物。
上述的部分、雜交序列、剪接變體和等位變體、同系物和衍生物是落入如上文所定義的S3a或S3a編碼核酸的定義範圍內的那些，即，在蛋白質的情況下，與已知S3a蛋白序列比對且包含與圖2序列比對中所示的框區相應的保守區域；而在核酸的情況下，編碼與已知的S3a蛋白序列比對且包含與圖2序列比對中所示的框區相應的保守區域。
對本領域普通技術人員來說顯而易見的是，使用全長的S3a DNA序列，對於實施本發明的方法並非是必要的。本發明的方法最好使用例如SEQ ID NO1所示的編碼S3a的DNA/核酸的部分。部分指來源於原始的(較大)DNA分子或由其製備的一段DNA。例如，可使用本領域熟知的技術，通過對SEQ ID NO1的核酸序列進行一個或多個缺失來製備所述部分。適合用於實施本發明方法的部分是編碼S3a蛋白的那些部分，該S3a蛋白與已知的S3a蛋白序列比對且包含與圖2序列比對中所示的框區相應的保守區域。
因此根據本發明，提供了一種用於改良植物的生長特性的方法，包括在植物中引入和表達S3a編碼核酸的部分，優選如SEQ ID NO1所示的核酸的部分。
還可用於實施發明方法的是能與S3a編碼核酸雜交的核酸，優選能與如SEQ ID NO1所示的S3a編碼核酸序列雜交的核酸。這樣的雜交序列是編碼S3a蛋白的那些序列，該S3a蛋白序列與已知的S3a蛋白序列比對且包含與圖2序列比對中所示的框區相應的保守區域。
如本文所定義的術語「雜交」是其中基本上同源的互補核苷酸序列彼此退火的過程。雜交過程可完全發生在溶液中，即兩互補的核酸都處於溶液中。依賴這種方法的分子生物學工具包括聚合酶鏈式反應(PCR；以及基於此的所有方法)、扣除雜交、隨機引物延伸、S1核酸酶作圖、引物延伸、反轉錄、cDNA合成、RNA差異顯示和DNA測序。雜交過程還可以如此進行，即其中互補核酸之一固定於基質如磁珠、瓊脂糖凝膠珠子或任何其它樹脂上。依賴這種方法的分子生物學工具包括poly(A+)mRNA的分離。此外雜交過程可還可以如此進行，即其中互補核酸之一固定於固相支持物如硝化纖維素膜或尼龍膜上，或通過例如照相平版印刷術固定到例如矽酸玻璃支持物上(後者稱之為核酸陣列或微陣列，或稱之為核酸晶片)。依賴這種方法的分子生物學工具包括RNA和DNA凝膠印跡分析、集落雜交、噬菌斑雜交、原位雜交和微陣列雜交。為了使得雜交發生，通常使核酸分子熱變性或化學變性，以使雙鏈解鏈成兩條單鏈和/或從單鏈核酸中除去髮夾或其它二級結構。雜交的嚴謹性受諸如溫度、鹽濃度和雜交緩衝液組成等條件的影響。雜交優選在嚴謹條件下進行。嚴謹條件為(1)採用低離子強度和高溫度進行洗滌，例如，0.5M磷酸鈉緩衝液pH 7.2，溶於7％SDS的1mM EDTA pH 8.0，溫度為65℃或55℃，或者(2)在雜交期間使用變性劑如甲醯胺，例如，50％(體積/體積)甲醯胺加0.1％牛血清蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.05M磷酸鈉緩衝液pH 6.5加0.75MNaCl，0.075M檸檬酸鈉，溫度為42℃。具體的實例包括使用50％甲醯胺，5×SSC(0.75 NaCl，0.075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH 6.8)，0.1％焦磷酸鈉，5×Denhard’s液，超聲處理的鮭精DNA(50nm/ml)，0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸酯，溫度為55℃，並於55℃在0.2×SSC和0.1％SDS中洗滌。本領域的技術人員能夠很容易地確定並適當地改變嚴謹條件，以獲得清楚和可檢測的雜交信號。
因此根據本發明，提供了一種用於改良植物的生長特性的方法，包括在植物中引入和表達優選在嚴謹條件下能與S3a編碼核酸序列[優選與如SEQ ID NO1所示的S3a編碼核酸]雜交的序列。
S3a編碼核酸的可選擇剪接變體，優選如SEQ ID NO1所示的S3a編碼核酸的可選擇變體，也可用於實施本發明的方法。適合用於實施本發明方法的剪接變體是編碼S3a蛋白的那些剪接變體，該S3a蛋白與已知的S3a蛋白序列比對且包含與圖2序列比對中所示的框區相應的保守區域。如本文所用的術語「可選擇的剪接變體」涵蓋這樣的核酸序列變體，即其中選定的內含子和/或外顯子已經切除、置換或添加。這樣的變體是其中蛋白質的生物學活性保持未受影響的那些變體，其可以通過選擇性地保留蛋白質的功能片段來獲得。這樣的剪接變體可以是天然發現的或可以是人造的。用於製備這樣的剪接變體的方法是本領域熟知的。
因此，本發明還提供了一種用於改良植物的生長特性的方法，包括在植物中引入和表達S3a編碼核酸的可選擇剪接變體，優選如SEQ ID NO1所示的S3a編碼核酸的可選擇剪接變體。
S3a編碼核酸的等位變體，優選如SEQ ID NO1所示的S3a編碼核酸的等位變體，也可用於實施本發明的方法。適合用於實施本發明方法的等位變體是編碼S3a蛋白的那些等位變體，該S3a蛋白與已知的S3a蛋白序列比對且包含與圖2序列比對中所示的框區相應的保守區域。
等位變體天然存在，且囊括在本發明的方法之內的是這些天然等位基因的用途。等位變體包含單核苷酸多態性(SNP)，以及小的插入/缺失多態性(INDEL)。INDEL的大小通常小於100bp。在大多數生物體的天然存在的多態菌株中，SNP和INDEL構成了最大的一類序列變體。
因此，本發明還提供了一種用於改良植物的生長特性的方法，包括在植物中引入和表達S3a編碼核酸的等位變體，優選如SEQ ID NO1所示的S3a編碼核酸的等位變體。
此外，本發明的方法最好也可以使用S3a如SEQ ID NO2所示的S3a的同系物、衍生物或活性片段。使用本領域技術人員熟知的常規技術，可以很容易地確定編碼S3a的同系物或衍生物的核酸。
蛋白質的「同系物」涵蓋相對於所討論的未修飾蛋白質具有胺基酸取代、缺失和/或插入、且與其所衍生自的未修飾蛋白質具有相似的生物學活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質和酶。為了產生這樣的同系物，蛋白質的胺基酸可以被具有相似性能(如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或打斷α-螺旋結構或β-片層結構的趨勢)的其它胺基酸所取代。保守置換表是本領域熟知的(例如參見Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company)。
可用於本發明方法的同系物與SEQ ID NO2所示的胺基酸序列具有優選度依次遞增的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性。而且，適合用於實施本發明方法的同系物是與已知的S3a蛋白序列比對且包含與圖2序列比對中所示的框區相應的保守區域的那些同系物。
術語「同系物」還涵蓋兩種特殊形式的同源性，其包括直向同源(orthologous)序列和共生同源(paralogous)序列，它們涵蓋了用於描述基因遺傳關係的進化概念。術語「共生同源」涉及某物種基因組內的基因複製，產生共生同源基因。術語「直向同源」涉及不同生物體中因遺傳關系所致的同源基因。
例如，單子葉植物物種中的直向同源物可以通過實施所謂的交互blast搜索很容易地找到。這可以通過第一次blast完成，包括在任何序列資料庫如可在http//www.ncbi.nlm.nih.gov中找到的公眾可用的NCBI資料庫中，對所討論的序列(例如，SEQ ID NO1或SEQ ID NO2)進行blast。如果尋找的是稻的直向同源物，所討論的序列將與例如來自NCBI上可用的Oryza sativa Nipponbare稻的28,469的全長cDNA克隆進行blast。當從核苷酸開始時可使用BLASTn，或當從蛋白質開始時可使用TBLASTX，並使用標準預設值(期望值10，比對值50)。blast的結果可以進行過濾。然後再將過濾結果或未過濾結果的全長序列與所討論的序列(SEQ IDNO1或2)進行反向blast(第二次blast)。然後對第一次和第二次blast的結果進行比較。在大家族的情況下，使用ClustalW，接著使用相鄰連接樹以幫助觀察聚類(clustering)。
同系物可以是蛋白質「取代變體」的形式，即，其中胺基酸序列中的至少一個殘基已經被除去，而將一個不同的殘基插入到它的位置上。胺基酸取代一般是單殘基的，但是取決於對多肽構成的功能限制可以是成串的；插入通常是大約1到10個胺基酸殘基，缺失為大約1到20個殘基。優選地，胺基酸取代包括保守胺基酸取代。
同系物還可以是蛋白質的「插入變體」，即，其中一個或多個胺基酸殘基被引入到蛋白質中的預定位點。插入可包括氨基末端和/或羧基末端融合，以及單個或多個胺基酸的序列內插入。通常，胺基酸序列內的插入將小於氨基或羧基末端融合，約為1到10個殘基的數量級。氨基或羧基末端融合蛋白質或肽的實例包括如用於酵母雙雜合系統的轉錄激活因子的結合結構域或激活結構域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)6-標籤、穀胱甘肽S-轉移酶-標籤、A蛋白、麥芽糖結合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag·100表位、c-myc表位、FLAG表位、lacZ、CMP(鈣調蛋白結合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。
蛋白質「缺失變體」形式的同系物的特徵在於從蛋白質除去一個或多個胺基酸。
使用本領域熟知的肽合成技術，如固相肽合成等等，或通過重組DNA操作，可以很容易地製備蛋白質的胺基酸變體。對DNA序列進行操作以產生蛋白質的取代、插入或缺失變體的方法是本領域熟知的。例如，在DNA的預定位點產生取代突變的技術是本領域技術人員熟知的，包括M13誘變、T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland，OH)、快速變換的定點誘變(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介導的定點誘變或其它定點誘變方案。
「衍生物」包括肽、寡肽、多肽、蛋白質和酶，與S3a蛋白天然存在形式的胺基酸序列相比，例如，如SEQ ID NO2所示，其可以包括天然和非天然存在胺基酸殘基的取代、缺失或添加。蛋白質的「衍生物」包括肽、寡肽、多肽、蛋白質和酶，與多肽天然存在形式的胺基酸序列相比，其可以包括改變的、糖基化的、醯化的天然存在的胺基酸殘基或非天然存在的胺基酸殘基。與其衍生自的胺基酸序列相比，衍生物還可包括一個或多個非胺基酸取代基，例如與胺基酸序列共價或非共價結合的報告分子或其它配體，如結合以便於其檢測的報導分子，以及相對於天然存在蛋白質的胺基酸序列而言的非天然存在的胺基酸殘基。
搜索和鑑定S3a同系物的方法是本領域技術人員熟知的。對用於比較的序列進行比對的方法是本領域熟知的，這類方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48443-453，1970)的算法來實現兩個全序列的比對，其最大化匹配的數目，並最小化空位數目。BLAST算法計算序列同一性百分比，並對兩個序列之間相似性進行統計學分析。執行BLAST分析的軟體通過國家生物技術信息中心(the National Centre for Biotechnology Information)可公眾獲得。可以通過取全長蛋白質序列，使用VNTI AlignX序列多重對比程序對它們進行序列比對(InforMax，Bethesda，MD)，並使用空位開放罰分為10和空位延伸為0.05的設置默認值，來鑑定適合用於本發明方法的同系物，即，與SEQ ID NO2所示的胺基酸序列具有至少55％序列同一性的那些同系物。例如參見圖1。
因此，本發明還提供了一種用於改良植物的生長特性的方法，包括在植物中引入和表達編碼如SEQ ID NO2所示的S3a的同系物或衍生物的核酸，該同系物、衍生物或活性片段與SEQ ID NO2所示的胺基酸序列具有優選度依次遞增的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性，而且把該同系物或衍生物與已知的S3a蛋白序列比對且包含與圖2序列比對中所示的框區相應的保守區域。
本發明還提供了遺傳構建體和載體，以便於引入和/或表達可用於本發明方法的核苷酸序列。
因此，本發明提供了一種基因構建體，其包含
(i)S3a編碼核酸，優選如SEQ ID NO1所示；(ii)能驅動(i)中核酸序列表達的一個或多個控制序列；和任選地(iii)轉錄終止序列。
可用於本發明方法的構建體可以使用本領域技術人員熟知的重組DNA技術構建。基因構建體可插入到載體中，該載體可以是商購的，適於轉化到植物中，並適於在轉化的細胞中表達目的基因。
植物用包含目的序列(即如上文所定義的S3a編碼核酸)的基因構建體轉化。目的序列與一個或多個控制序列(至少與一個啟動子)有效地連接。術語「調控元件」、「控制序列」和「啟動子」在文中都可以互換使用，且應當取其廣義，是指能對與它們連接的序列的表達起作用的調控核酸序列。上述術語涵蓋來源於經典真核生物基因組基因(包括精確轉錄起始所需的TATA盒，帶或不帶CCAAT盒序列)以及根據發育和/或外界刺激，或以組織特異性方式改變基因表達的另外的調控元件(即，上遊激活序列、增強子和沉默子)的轉錄調控序列。該術語還包括經典原核生物基因的轉錄調控序列，在這種情況下，它可能包括-35盒序列和/或-10盒轉錄調控序列。術語「調控元件」也涵蓋合成的融合分子或衍生物，其使得核酸分子能夠、在細胞、組織或器官中表達，激活或增強這種表達。如本文所用的術語「有效連接」指啟動子序列與目的基因之間的功能性連接，以便啟動子序列能啟動目的基因的轉錄。
最好地，任何類型的啟動子都可用於驅動S3a編碼核酸的表達。
優選地，編碼S3a的核酸有效地與組成型啟動子連接。如文中所定義的術語「組成型」指該啟動子在不止一種組織或器官中優勢表達，而且在植物生活周期的任何階段都優勢表達。優選地，組成型啟動子在整株植物中優勢表達。優選地，組成型啟動子是來自稻的GOS2啟動子。
適合用於本發明方法的其它組成型啟動子的例子列於下表A。
表A用於實施本發明的組成型啟動子的實例
任選地，一個或多個終止子序列也可用於被引入到植物中的構建體中。術語「終止子」涵蓋控制序列，其是位於轉錄單元末端的DNA序列，傳遞3』加工和初級轉錄物聚腺苷酸化以及轉錄終止的信號。另外的調控元件也可以包括轉錄增強子以及翻譯增強子。本領域技術人員知曉適合用於實施本發明的終止子與增強子。這樣的序列是已知的，或本領域技術人員可以很容易地獲得。
本發明的遺傳構建體還可以包括在特定細胞類型中維持和/或複製所需的複製原點序列。一個實例是需要遺傳構建體在細菌細胞中作為染色體外遺傳元件(例如，質粒或粘粒分子)維持的情況。優選的複製原點包括但不局限於f1-ori和colE1。
遺傳構建體任選地可包含選擇標記基因。如本文所用，術語「選擇標記基因」包括賦予表達該基因的細胞表型以便於鑑定和/或選擇用本發明的核酸構建體轉染或轉化的細胞的任何基因。合適的標記可選自賦予抗生素或除草劑抗性的標記，其引入新的新陳代謝性狀或允許視覺選擇。選擇標記基因的實例包括能賦予抗生素抗性(如使新黴素和卡那黴素磷酸化的nptII，或使潮黴素磷酸化的hpt)、除草劑抗性(例如提供對Basta的抗性的bar；提供對草甘膦的抗性的aroA或gox)的基因，或提供新陳代謝性狀的基因(如允許植物利用甘露糖作為唯一碳源的manA)。視覺標記基因導致形成顏色(例如β-葡糖苷酸酶，GUS)、發光(如螢光素酶)或螢光(綠色螢光蛋白GFP及其衍生物)。
本發明還涵蓋可通過本發明的方法獲得的植物。本發明因此提供了可通過本發明的方法獲得的植物，該植物中引入和表達了如上文所定義的編碼S3a蛋白的核酸。
本發明還提供了一種生產具有改良的生長特性的轉基因植物的方法，包括在植物中引入和表達S3a編碼核酸，優選如SEQ ID NO1所示的核酸。
更具體地說，本發明提供了一種生產具有改良的生長特性的轉基因植物的方法，該方法包括(i)向植物或植物細胞中引入S3a編碼核酸，優選如SEQ ID NO1所示的核酸；(ii)在促進再生和使植物生長成熟的條件下培養植物細胞。
核酸可以直接引入到植物細胞或植物本身(包括引入到植物的組織、器官或任何其它部分)之中。根據本發明的一個優選的特徵，核酸優選通過轉化被引入到植物中。
如本文所提及的術語「轉化」涵蓋把外源多核苷酸向宿主細胞中的轉移，而不管轉移的方法如何。能夠隨後無性繁殖的植物組織，無論是通過器官發生還是胚胎發生，都可以用本發明的遺傳構建體進行轉化，並從其再生完整植物。選擇的特定組織將視可用於且最適於轉化的特定物種的無性繁殖體系而改變。例示性的靶組織包括葉圓盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、大配子體、愈傷組織、已存在的分生組織(例如，頂端分生組織，腋生的芽和根分生組織)以及誘導的分生組織(例如，子葉分生組織和下胚軸分生組織)。多核苷酸可以瞬時或穩定地被引入到宿主細胞中，並可保持非整合狀態，例如，作為質粒。可選擇地，它可以整合到宿主基因組中。所得的轉化植物細胞然後可用於以本領域技術人員所知的方法再生為轉化植物。
植物物種的轉化目前是一種相當常規的技術。有利地，任何轉化方法都可用於引入目的基因到合適的祖代細胞中。轉化方法包括使用脂質體、電穿孔、能增加游離DNA攝入的化學品、直接注射DNA到植物中、基因槍顆粒轟擊、使用病毒或花粉進行轉化以及顯微注射。方法可選自用於原生質體的鈣/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等，1882，Nature 296，72-74；Negrutiu I.等，June 1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生質體的電穿孔法(Shillito R.D.等，1985 Bio/Technol 3，1099-1102)；顯微注射到植物材料中(Crossway A.等，1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)；DNA或RNA塗層顆粒轟擊(Klein T.M.等，1987，Nature 327，70)；用(非整合型)病毒感染等等。表達S3a的轉基因稻植物優選使用任何用於稻轉化的熟知方法，通過土壤農桿菌(Agrobacterium)介導的轉化產生，例如在任何以下文獻中描述的方法公開的歐洲專利申請EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等(Plant J.6(2)271-282，1994)，其公開的內容如同其陳述的全部內容那樣併入文中作為參考。至於穀物轉化，優選的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.1996 Jun；14(6)745-50)或Frame等(Plant Physiol.2002 May；129(1)13-22)中所述，其公開的內容如同其陳述的全部內容那樣併入文中作為參考。
通常在轉化以後，選擇植物細胞或細胞群中與目的基因共轉移的植物可表達基因所編碼的一個或多個標記，接著將轉化的材料再生成完整植株。
DNA轉移和再生之後，可評價推斷轉化植物中目的基因的存在、拷貝數和/或基因組結構，例如使用Southern分析。可選擇地或另外地，新引入DNA的表達水平可使用Northern和/或Western分析進行監控，兩種技術都是本領域普通技術人員所熟知的。
產生的轉化植物可通過各種方法進行繁殖，如通過無性繁殖或經典育種技術。例如，第一代(或T1)轉化植物可以自花授精以產生純合的第二代(或T2)轉化株，而T2植物可進一步通過經典的育種技術進行繁殖。
產生的轉化生物體可以是各種形式的。例如，它們可以是轉化細胞與非轉化細胞的嵌合體；克隆轉化體(例如，所有的細胞都被轉化以含有表達盒)；轉化與未轉化組織的嫁接體(例如，在植物中，轉化的根莖被嫁接到未轉化的接穗中)。
本發明顯然延及由文中描述的任何方法產生的任何植物細胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖體。本發明還延及囊括由任何上述的方法產生的原代轉化或轉染細胞、組織、器官或完整植物的後代，唯一的要求是該後代顯示與由本發明的方法在親代中產生的基因型和/或表型特徵相同的基因型和/或表型特徵。本發明還包括含有分離的S3a編碼核酸的宿主細胞。根據本發明優選的宿主細胞是植物細胞。本發明還延及植物的可收穫部分，如但不局限於種子、葉、果實、花、莖培養物、根莖、塊莖和鱗莖。
也可實施本發明的方法而不需向植物中引入編碼S3a的核酸。這可通過引入遺傳修飾來實現(優選在S3a編碼基因的基因座中)。如文中所定義的基因的基因座是指基因組區域，其包括目的基因以及10KB編碼區的上遊或下遊。
例如，遺傳修飾可以通過以下的任何一種(或多種)方法引入TDNA激活、TILLING、定點誘變、同源重組、直接進化，或如上文所述的，通過在植物(細胞)中引入和表達S3a編碼核酸。
T-DNA激活標籤(Hayashi等Science(1992)1350-1353)包括T-DNA的插入，其通常在目的基因的基因組區域或基因編碼區的上遊或下遊10KB處中含有如此構造的啟動子(也可能是翻譯增強子或內含子)，從而該啟動子能指導靶基因的表達。一般地，破壞靶基因天然啟動子對其的表達調控，而使該基因處於新引入的啟動子的控制之下。啟動子一般嵌入到T-DNA中。例如，T-DNA通過土壤農桿菌感染隨機插入到植物基因組中，並導致靠近該插入的T-DNA的基因過量表達。由於接近引入的啟動子的基因過量表達，所得的轉基因植物顯示出顯性表型。待引入的啟動子可以是能指導基因在所需的生物體[在本案為植物]中表達的任何啟動子。例如，組成型、組織偏好的、細胞類型偏好的以及誘導型啟動子都適合用於T-DNA激活。
也可以使用TILLING技術(靶向誘導基因組局部突變技術)，把遺傳修飾引入到編碼S3a的核酸/基因的基因座中。這是一種誘變技術，可用於產生和/或鑑定、並最終分離能顯示S3a生物學活性的S3a編碼核酸的誘變變體。TILLING還能夠選擇攜帶這類突變變體的植物。這些突變變體甚至可表現出比該基因的天然形式所表現的更高的S3a活性。TILLNG將高密度誘變與高通量篩選方法結合起來。TILLING一般遵循的步驟是(a)EMS誘變(Redei和Koncz，1992；Feldmann等，1994；Lightner和Caspar，1998)；(b)DNA製備和個體合併；(c)目的區域的PCR擴增；(d)變性和退火以允許形成異源雙鏈；(e)DHPLC，其中庫中異源雙鏈的存在檢測為色譜圖中額外的峰值；(f)鑑定突變個體；和(g)突變PCR產物的測序。TILLING的方法是本領域熟知的(McCallum Nat Biotechnol.2000 Apr；18(4)455-7，由Stemple 2004(TILLING-a high-throughput harvest for functionalgenomics.Nat Rev Genet.2004年2月；5(2)145-50.)綜述)。
可利用定點誘變產生S3a編碼核酸的變體或其部分。若干方法可用來實現定點誘變，最常見的是基於PCR的方法(current protocols inmolecular biology.Wiley編http//www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。
直接進化也可用於產生S3a編碼核酸的變體。這包括重複的DNA改組，接著進行合適的篩選和/或選擇以產生S3a編碼核酸的變體(Castle等，(2004)Science 304(5674)1151-4；美國專利5,811,238和6,395,547)。
T-DNA激活、TILLING、定點誘變和直接進化是能產生新的等位基因和SYT變體的技術的實例。
同源重組能夠在基因組的規定選擇位置處引入選定的核酸。同源重組是生物學中通常使用的標準技術，用於較低等的生物體如酵母或苔蘚physcomitrella。用於在植物中進行同源重組的方法不僅已在模式植物中描述(Offringa等Extrachromosomal homologous recombination and genetargeting in plant cells after Agrobacterium-mediated transformation.1990EMBO J.1990年10月；9(10)3077-84)，而且在禾穀類作物例如稻中描述(Terada R，Urawa H，Inagaki Y，Tsugane K，Iida S.Efficient gene targetingby homologous recombination in rice.Nat Biotechnol.2002.Iida和TeradaA tale of two integrations，transgene and T-DNAgene targeting byhomologous recombination in rice.Curr Opin Biotechnol.2004年4月；15(2)132-8)。例如，待靶向的核酸(其可以是如上文所定義的S3a編碼核酸)不需靶向到S3a編碼基因的基因座中，但是可以被引入到高表達的區域。待靶向的核酸可以是改良的等位基因，用於替換內源基因，或附加地引入到內源基因中。
本發明還包括編碼S3a的核酸的用途和S3a多肽的用途。
一種這樣的用途當然涉及如上文所定義的S3a在改良植物的生長特性，特別是用於提高產率，尤其是種子產率的用途。種子產率可包括下列一個或多個方面增加的(飽滿)種子數、增加的種子重量、增加的收穫指數和增加的TKW等等。S3a編碼核酸可以如SEQ ID NO1所示，S3a蛋白可以是如SEQ ID NO2所示的胺基酸。
如上文所定義的編碼S3a的核酸以及S3a多肽在育種方案中也大有用途。S3a編碼核酸可以如SEQ ID NO1所示，或S3a可以是如SEQ ID NO2所示的胺基酸。例如，S3a編碼核酸或其部分可以位於染色體(或其部分)上，優選與一種或多種相關的家族成員連接在一起。在這種育種方案的一個實例中，鑑定可能與能夠調節植物中編碼S3a蛋白的核酸表達的基因遺傳連鎖的DNA標記，該基因可以是編碼S3a蛋白本身的基因，或者是可直接或間接地影響編碼S3a蛋白的基因的表達和/或S3a蛋白本身的活性的任何其它基因。然後這種DNA標記可用於育種方案，以選擇具有改良的生長特性的植物。
S3a的等位變體也可用於常規的育種方案，如在標記輔助的育種中。這樣的育種方案有時需要通過植物的誘變處理，在植物中引入等位基因變異。一種合適的誘變方法是EMS誘變。然後通過例如PCR進行等位變體的鑑定。接著是篩選步驟，用於選擇所討論序列的優良等位變體，其在植物中產生改良的生長特性。一般通過監控含有所討論序列的不同等位變體(例如，SEQ ID NO1的不同等位變體)的植物的生長特性來進行篩選。監控生長特性可以在溫室或野外進行。此外任選的步驟包括使植物與另一種植物雜交，其中鑑定優良的等位變體。例如，這可用於產生組合的目的表型特徵。
S3a編碼核酸還可用作探針，以對基因進行遺傳和物理作圖，這些基因是與之連鎖的性狀的一部分和標誌。這些信息可用於植物育種，以開發具有所需表型的種系。S3a編碼核酸的這種應用，僅僅需要長度為至少15個核苷酸的核酸序列。S3a編碼核酸可用作限制性片段長度多態性(RFLP)標記。限制性消化的植物基因組DNA的Southern印跡(Maniatis)可使用S3a編碼核酸進行探測。然後可以使用電腦程式如MapMaker(Lander等(1987)Genomics 1174-181)對所得的帶型進行遺傳分析，以構建遺傳圖譜。此外，該核酸可用於探測Southern印跡，該Southern印跡含有代表親本和明確的遺傳雜交後代的一組個體的限制性核酸內切酶處理的基因組DNA。記錄到DNA多態性的分離，並用於計算S3a編碼核酸在前面使用該群體獲得的遺傳圖譜中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32314-331)。
植物基因來源的探針的製備和在遺傳作圖中的用途描述於Bematzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 437-41中。眾多出版物描述過使用上面所述的方法或其變通形式對特定的cDNA克隆進行遺傳作圖。例如，F2雜交群體、回交群體、隨機交配群體、近親同基因系及其它的個體組可用於作圖。這類方法是本領域技術人員熟知的。
核酸探針也可用於物理作圖(即，把序列置於物理圖上；參見Hoheisel等Non-mammalian Genomic AnalysisA Practical Guide，Academicpress 1996，第319-346頁，以及其中引用的參考文獻)。
在另一個實施方案中，核酸探針可用於直接螢光原位雜交(FISH)作圖(Trask(1991)Trends Genet.7149-154)。雖然目前的FISH作圖方法偏向於使用大的克隆(幾個到幾百KB；參見Laan等(1995)Genome Res.513-20)，但是靈敏度的提高允許使用較短的探針進行FISH作圖。
許多用於遺傳和物理作圖的各種基於核酸擴增的方法可以使用所述核酸實施。實例包括等位基因特異性擴增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med1195-96)、PCR擴增片段的多態性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics16325-332)、等位基因特異性連接(Landegren等(1988)Science 2411077-1080)、核苷酸延伸反應(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.183671)、放射雜交作圖(Walter等(1997)Nat.Genet.722-28)和Happy作圖(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.176795-6807)。為實施這些方法，使用核酸序列設計和製備引物對，以用於擴增反應或引物延伸反應。這類引物的設計是本領域技術人員所熟知的。在採用基於PCR遺傳作圖的方法中，可能有必要鑑定跨越相應於本發明核酸序列區域作圖的親代之間DNA序列的差異。然而，這對作圖方法通常不是必要的。
編碼S3a的核酸和S3a多肽也可用作生長調節劑。S3a編碼核酸可以是如SEQ ID NO1所示的核酸，而S3a蛋白/多肽可以是如SEQ ID NO2所示的胺基酸。由於這些S3a可用於改良植物的生長特性，S3a也是有用的生長調節劑，如除草劑或生長刺激物。本發明因此提供了一種組合物，其包含S3a或編碼S3a的核酸，連同合適的載體、稀釋劑或賦形劑，用作生長調節劑。
本發明的方法產生具有改良的生長特性的植物，如以上所述。這些改良的生長特性也可與其它經濟學上有利的性狀結合，如其它增產性狀、對各種應激的耐受性、修飾各種結構特徵和/或生化和/或生理學特徵的性狀。


本發明現在將參考以下附圖進行描述，其中圖1顯示了使用VNTI AlignX序列多重比對程序(InforMax，Bethesda，MD)進行的S3a蛋白序列的比對，其中使用空位開放罰分為10和空位延伸為0.05的預設設置。黑色背景上以白色表示的殘基是相同的；灰色背景上以白色表示的殘基是保守的或類似殘基區，如VNTI選項所定義的那樣。
圖2顯示了來自Lyamouri(Gene 294(2002)147-156)等的序列比對，其顯示了來自不同物種的S3a蛋白中的高度保守智人(H.sapiens)(Hs)，褐家鼠(M.musculus)(Mm)，紅鰭東方魨(T.rubripes)(Tr)，非洲爪蟾(X.laevis)(Xl)，黑腹果蠅(D.melanogaster)(Dm)，黑果蠅(D.virilis)(Dv)，秀麗隱杆線蟲(C.elegans)(Ce)，釀酒酵母(S.cerevisiae)(Sc)，擬南芥(A.thaliana)(At)，稻(O.sativa)(Os)和H.holobium(Hh)。黑色陰影表示相同的胺基酸，而淺灰表示保守的胺基酸置換。空位由破折號表示。最高度保守的區域是方框內的。
圖3顯示了二元載體，用於在稻中表達處於稻GOS2啟動子控制下(內參PRO0129)的擬南芥cyc07推定的S-期特異性40S S3a核糖體蛋白基因(內參CDS0730)。
圖4詳述了用於進行本發明方法的序列。
實施例本發明現在將參考以下實施例進行描述，其僅僅是為了例證說明。
DNA操作除非另有說明，重組DNA技術根據(Sambrook(2001)Molecular Cloninga laboratory manual，3rd Edition Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York)或Ausubel等第1卷和第2卷(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols中描述的標準方案進行。用於植物分子工作的標準材料和方法描述於R.D.D Croy的Plant Molecular Biology Labfase(1993)，由BIOS Scientific PublicationsLtd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。
實施例1基因克隆使用擬南芥幼苗cDNA文庫(Invitrogen，Paisley，UK)作為模板，PCR擴增擬南芥S3a(S-期特異性40S cyc07)。對從幼苗提取的RNA進行反轉錄以後，把cDNA克隆到pCMV Sport 6.0中。基因庫的平均插入大小為1.5kb，而且克隆的原始數為1.59×107cfu。原始滴度確定為9.6×105cfu/ml，而且在第一輪擴增以後變成6×1011cfu/ml。質粒提取以後，200ng的模板用於50μl PCR混合物。如下引物用於PCR擴增引物prm02255(正義，起始密碼子為黑體，AttB1位點為斜體5』GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGCTGTCGGGAAGAA 3』)和prm02256(反向，互補，終止密碼子為黑體，AttB2位點為斜體5』GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTAAGCTCCGATGATTTCT 3』)，其包括用於Gateway重組的AttB位點。使用Hifi Tag DNA聚合酶，在標準條件下進行PCR。擴增到789bp的PCR片段，而且同樣使用標準方法進行純化。然後進行Gateway方法的第一步，即BP反應，在此期間，PCR片段在體內與pDONR201質粒重組，根據Gateway術語，以產生「entry克隆」p2782。質粒pDONR201購自Invitrogen，作為Gatewaytechnology的一部分。
實施例2載體構建entry克隆p2782接著與p0640進行LR反應，p0640是用於稻轉化的目的載體。該載體包含位於T-DNA邊界內的以下部分作為功能性元件植物選擇標記；植物篩選標記；旨在與已克隆到entry克隆中的目的序列進行體內重組的LR的Gateway表達盒。用於組成型表達的稻GOS2啟動子(PRO0129)位於該Gateway表達盒的上遊。LR重組步驟之後，得到的如圖3所示的表達載體被轉化到土壤農桿菌中，其隨後被轉化到稻植株中。使轉化的稻植株生長，然後檢驗實施例3中所述的參數。
實施例3評估和結果產生了大約15到20個獨立的T0稻轉化株。一代轉化株從組織培養室轉移到溫室中生長，並收穫T1種子。6個事件得以保留，其中T1後代發生轉基因存在/缺乏的3∶1分離。對於這些事件中的每一個，通過監控視覺標記的表達，選擇了大約10個包含轉基因的T1幼苗(異型和同型接合子)，和大約10個缺乏轉基因的T1幼苗(無效接合子)。有些T1事件在T2代中使用與T1代相同的評價方法進行進一步予以評估。
統計學分析F-測驗兩因子的ANOVA(可變性分析)用作統計模型，用於植物表型特徵的綜合評價。對用本發明的基因轉化的所有事件的所有植株的所有測量參數進行F測驗。進行F測驗以檢查基因對所有轉化事件的作用，並檢驗基因的總效應，亦稱之為整體基因效應。真實整體基因效應的顯著性閾值設置為F測驗的5％概率水平。顯著的F測驗值顯示基因效應，意味著不僅僅是基因的存在或位置引起表型的差異。
3.1種子相關的參數測量收穫成熟的初級穗，裝袋，進行條型碼標記，然後在烘箱於37℃乾燥3天。然後對穗脫粒，收集所有的種子並計數。使用鼓氣裝置，把飽滿的穀殼從空穀殼中分離開。丟棄空穀殼，並對保留的部份再次計數。飽滿的穀殼在分析天平上稱重。該方法產生如下所述的種子相關參數組。
下面的結果表顯示了用於T1評估、T2評估的F測驗的p值，以及用於聯合的T1和T2評估的F測驗的p值。當對相同的事件已經進行了兩個實驗時，可以考慮聯合分析。這可用於檢查對兩個實驗的作用的一致性，並增加結論的可信度。所用的方法是混合模型法，其考慮數據的多級結構(也即實驗-事件-分離子)。P值通過比較似然比檢驗與卡方分布獲得。每一個表都提供了每代的轉基因與對應的無效接合子之間的％差異。
3.1.1飽滿的種子數通過計數分離步驟之後保留的飽滿穀殼的數目確定飽滿的種子數。如下表1所示，用於聯合的T1和T2評估的F測驗的p值是顯著的(p值為0.0071)，這表明植物中構建體的存在對轉基因植物的飽滿種子數具有顯著影響。
表1

3.1.2每個植株的種子總產率通過對從植株收穫的全部飽滿的穀殼進行稱重，來測定種子總產率。如下表2所示，用於聯合的T1和T2評價的F測驗的p值是顯著的(p值為0.0016)，這表明植物中構建體的存在對轉基因植物的種子總重量具有顯著影響。
表2

3.1.3植物的收穫指數本發明中的收穫指數定義為種子總產率與地上面積(mm2)之間的比率，再乘以係數106。如下表3所示，用於聯合的(以及分別的)T1和T2評價的F測驗的p值是顯著的(p值為0.0005)，這表明植物中構建體的存在對轉基因植物的收穫指數具有顯著影響。
表3

3.1.4千籽粒重(TKW)從計數的飽滿種子數以及它們的總重量來推斷該參數。如下表4所示，用於聯合的T1和T2評估的F測驗的p值是顯著的(p值為0.0405)，這表明植物中構建體的存在對轉基因植物的TKW具有顯著影響。
表4

序列表110克羅普迪塞恩股份有限公司120具有改良的生長特性的植物以及製備所述植物的方法130CD-112-PCT150EP 04101179.21512004-03-22150US 60/556,8471512004-03-281606170PatentIn version 3.32101211830212DNA213擬南芥(Arabidopsis thaliana)4001atggctgtcg ggaagaacaa gaggatttca aagggtagga aaggaggaaa gaagaaggct 60gttgatccct tctccaagaa ggattggtat gacgtgaagg ctcctggttc tttcacgaac120aggaatgttg ggaagactct tgtttccagg actcagggta ccaagattgc ctctgaggga180ctgaaacaca gggtgtttga ggtttctctt gctgatctac aaaatgatga ggataatgcc240tacaggaaga tccgtcttag agctgaagat gttcagggaa ggaatgtgtt gacccagttc300tggggtatgg atttcacaac cgacaagcta aggtcattgg tgaagaagtg gcagactttg360attgaagccc atgtcgatgt gaaaaccaca gacggctaca ccttgaggat gttctgcatc420gccttcacaa agagacgtgc taaccaagtg aagcgtacct gttacgctca atccagccaa480atccgtcaga tccgcagaaa gatgagtgag attatggtga aggaggcttc atcttgtgac540ctcaaggagc tagtggccaa gttcatccca gaggccattg gaagagagat tgagaaggca600acacagggca tctacccgtt gcagaatgtg ttcatccgta aagtgaagat cctaaaggct660cccaagtttg accttggaaa gctcatggag gtgcatggag attacacagc agaggatgtt720
ggtgtgaagg tagacaggcc agctgatgag acaatggttg aggagccaac agaaatcatc780ggagcttagg ggattataga tttgtttgtt ttttcgctgg caaaaaaaaa 8302102211261212PRT213擬南芥4002Met Ala Val Gly Lys Asn Lys Arg Ile Ser Lys Gly Arg Lys Gly Gly1 5 10 15Lys Lys Lys Ala Val Asp Pro Phe Ser Lys Lys Asp Trp Tyr Asp Val20 25 30Lys Ala Pro Gly Ser Phe Thr Asn Arg Asn Val Gly Lys Thr Leu Val35 40 45Ser Arg Thr Gln Gly Thr Lys Ile Ala Ser Glu Gly Leu Lys His Arg50 55 60Val Phe Glu Val Ser Leu Ala Asp Leu Gln Asn Asp Glu Asp Asn Ala65 70 75 80Tyr Arg Lys Ile Arg Leu Arg Ala Glu Asp Val Gln Gly Arg Asn Val85 90 95Leu Thr Gln Phe Trp Gly Met Asp Phe Thr Thr Asp Lys Leu Arg Ser100 105 110Leu Val Lys Lys Trp Gln Thr Leu Ile Glu Ala His Val Asp Val Lys115 120 125Thr Thr Asp Gly Tyr Thr Leu Arg Met Phe Cys Ile Ala Phe Thr Lys130 135 140
Arg Arg Ala Asn Gln Val Lys Arg Thr Cys Tyr Ala Gln Ser Ser Gln145 150 155 160Ile Arg Gln Ile Arg Arg Lys Met Ser Glu Ile Met Val Lys Glu Ala165 170 175Ser Ser Cys Asp Leu Lys Glu Leu Val Ala Lys Phe Ile Pro Glu Ala180 185 190Ile Gly Arg Glu Ile Glu Lys Ala Thr Gln Gly Ile Tyr Pro Leu Gln195 200 205Asn Val Phe Ile Arg Lys Val Lys Ile Leu Lys Ala Pro Lys Phe Asp210 215 220Leu Gly Lys Leu Met Glu Val His Gly Asp Tyr Thr Ala Glu Asp Val225 230 235 240Gly Val Lys Val Asp Arg Pro Ala Asp Glu Thr Met Val Glu Glu Pro245 250 255Thr Glu Ile Ile Gly26021032111169212DNA213甘蔗(Saccharum officinarum)4003aagatgaagc ctttgtcatg gtgcatgcta aagatgctga ggctgagaag ttgagggatg 60aaccatgaca aaggcttcat ctttctcgac ctgaatcctg tccacattcc ccttcagcat120cttcaattca gcctcgatca ttttcttctt aagcaccccg ccgtcgttct cttcctgcat180ccccgcccca ttccctagcg tcgcccccct cgccgccgca cggacgcagc gacgagctct240
cgcagcagca atggcggttg gcaagaataa gcgtatctcc aagggcaaga agggaggcaa300gaagaagacc gtggatccgt tcagcaaaaa ggattggtat gatatcaagg ctccgtcggt360cttcagcgtg cgcaacatcg gcaagaccct ggtctccagg acacagggca ccaagattgc420ctctgagggt ttaaagcaca gagtatttga ggtctccttg gctgatcttc agagtgatga480agaccaggcg tacaggaaga tcagacttcg tgcagaggat gtacaaggga gaaatgttct540cacaaacttc tggggtatga gcttcaccac cgacaagctc cgttcacttg tgaagaagtg600gcagacgctt attgaggctc atgttgatgt caagaccacc gataactata tgctgcggct660gttctgcatt gggttcacca agaggcggcc caatcaagtg aagcgcactt gctatgctca720agcaagccaa atcagacaga ttcgtcggaa gatgactgaa atcatgagca accaagcttc780aacttgtgat ctgaaagagc tcgtgtccaa gttcatccct gaggtcattg gaaaggaaat840cgagaaagcc acctctagca tattcccctt gcaaaatgtc ttcatccgca aggtgaagat900cctgaaagca ccaaagttcg acattggaaa gctcatggag gtccatggtg actatgccaa960ggaggatgtt ggtgtcaaga tggacaggcc tgctgaaggc gacgaggcca tgggaggaca 1020ggaggttgct gcagctgagt gattagtctc actgtttacg tccgagttag agctgccata 1080tttccttgaa acacttagga acactttttt tgagagtctg acatgtggtg gcttcgattc 1140tccttgaaaa tttgcagcat gggaaatgt 11692104211263212PRT213甘蔗4004Met Ala Val Gly Lys Asn Lys Arg Ile Ser Lys Gly Lys Lys Gly Gly1 5 10 15Lys Lys Lys Thr Val Asp Pro Phe Ser Lys Lys Asp Trp Tyr Asp Ile20 25 30
Lys Ala Pro Ser Val Phe Ser Val Arg Asn Ile Gly Lys Thr Leu Val35 40 45Ser Arg Thr Gln Gly Thr Lys Ile Ala Ser Glu Gly Leu Lys His Arg50 55 60Val Phe Glu Val Ser Leu Ala Asp Leu Gln Ser Asp Glu Asp Gln Ala65 70 75 80Tyr Arg Lys Ile Arg Leu Arg Ala Glu Asp Val Gln Gly Arg Asn Val85 90 95Leu Thr Asn Phe Trp Gly Met Ser Phe Thr Thr Asp Lys Leu Arg Ser100 105 110Leu Val Lys Lys Trp Gln Thr Leu Ile Glu Ala His Val Asp Val Lys115 120 125Thr Thr Asp Asn Tyr Met Leu Arg Leu Phe Cys Ile Gly Phe Thr Lys130 135 140Arg Arg Pro Asn Gln Val Lys Arg Thr Cys Tyr Ala Gln Ala Ser Gln145 150 155 160Ile Arg Gln Ile Arg Arg Lys Met Thr Glu Ile Met Ser Asn Gln Ala165 170 175Ser Thr Cys Asp Leu Lys Glu Leu Val Ser Lys Phe Ile Pro Glu Val180 185 190Ile Gly Lys Glu Ile Glu Lys Ala Thr Ser Ser Ile Phe Pro Leu Gln195 200 205Asn Val Phe Ile Arg Lys Val Lys Ile Leu Lys Ala Pro Lys Phe Asp
210 215 220Ile Gly Lys Leu Met Glu Val His Gly Asp Tyr Ala Lys Glu Asp Val225 230 235 240Gly Val Lys Met Asp Arg Pro Ala Glu Gly Asp Glu Ala Met Gly Gly245 250 255Gln Glu Val Ala Ala Ala Glu260210521151212DNA213人工序列220
223引物prm022554005ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggct gtcgggaaga a 51210621149212DNA213人工序列220
223引物prm022564006ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctaagctccg atgatttct 49
權利要求
1.一種改良植物生長特性的方法，包括在植物中引入和表達編碼小亞基核糖體蛋白S3a多肽的核酸。
2.權利要求1的方法，包括在植物中引入和表達(i)S3a編碼核酸的一部分；(ii)能與S3a編碼核酸雜交的序列；(iii)S3a編碼核酸的可選擇剪接變體；(iv)S3a編碼核酸的等位變體；和(v)編碼S3a胺基酸序列的同系物或衍生物的核酸，其中，(i)至(v)所編碼的蛋白質與已知的S3a蛋白序列比對且包含與圖2序列比對中所示的框區相應的保守區域。
3.權利要求1或2的方法，其中所述改良的植物生長特性是相對於對應的野生型植物而言增加的產率。
4.權利要求3的方法，其中所述增加的產率是增加的種子產率。
5.權利要求3或4的方法，其中所述增加的產率選自(i)增加的種子生物量；(ii)增加的(飽滿)種子數；(iii)增加的種子大小；(iv)增加的種子體積；(v)增加的收穫指數；和(vi)增加的千籽粒重(TKW)。
6.權利要求1至5中任一項的方法，其中所述改良的植物生長特性是增加的生長速率。
7.權利要求1至6中任一項的方法，其中所述編碼S3a的核酸來源於植物，優選來源於雙子葉植物，還優選來源於十字花科，更優選該核酸來自於擬南芥。
8.權利要求1至7中任一項的方法，其中所述編碼S3a的核酸序列在植物中過表達。
9.權利要求1至8中任一項的方法，其中所述編碼S3a的核酸的表達由組成型啟動子尤其是GOS2啟動子驅動。
10.用於改良植物生長特性尤其是產率特別是種子產率的方法，包括在植物中引入編碼S3a多肽或其變體的基因的基因座的遺傳修飾。
11.權利要求10的方法，其中所述遺傳修飾通過下列之一實現定點誘變、同源重組、TILLING、直接進化和T-DNA激活。
12.可通過權利要求1至11中任一項的方法獲得的植物。
13.構建體，其包含(i)S3a編碼核酸；(ii)能驅動(i)中核酸序列表達的一個或多個控制序列；和任選地(iii)轉錄終止序列。
14.權利要求13的構建體，其中所述控制序列包括至少一個組成型啟動子，優選GOS2啟動子。
15.用權利要求13或14的構建體轉化的植物。
16.用於生產具有改良的生長特性的轉基因植物的方法，該方法包括(i)把S3a編碼核酸引入到植物或植物細胞中；(ii)在促進再生和使植物生長成熟的條件下培養植物細胞。
17.具有改良的生長特性的轉基因植物，特徵在於在所述植物中引入和表達編碼S3a蛋白的核酸序列。
18.權利要求12、15或權利要求17的轉基因植物，其中所述植物是單子葉植物，如甘蔗，或選自稻、玉米、小麥、大麥、大豆、高粱、向日葵、芸苔、甘蔗、苜蓿、粟、大麥、油菜籽和棉花的禾穀類。
19.權利要求12、15、17或18中任一項的植物的可收穫部分。
20.權利要求19的植物的可收穫部分，其中所述的可收穫部分是種子。
21.S3a或S3a編碼核酸在改良植物的生長特性尤其是提高產率特別是種子產率中的用途。
22.權利要求21的用途，其中所述種子產率包括如下一項或多項增加的(飽滿)種子數、增加的種子重量、增加的收穫指數和增加的TKW。
23.權利要求21或22的用途，其中所述S3a編碼核酸如SEQ ID NO1所示，而其中所述S3a是如SEQ ID NO2所示的胺基酸。
24.S3a或S3a編碼核酸作為分子標誌的用途。
全文摘要
本發明涉及一種通過在植物中引入和表達編碼S3a蛋白的核酸而改良植物的生長特性的方法。本發明還涉及其中引入了編碼S3a蛋白的核酸的轉基因植物，該植物相對於對應的野生型植物具有改良的生長特性。本發明還涉及可用於本發明方法的構建體。
文檔編號C07K14/415GK1934259SQ200580009205
公開日2007年3月21日 申請日期2005年3月18日 優先權日2004年3月22日
發明者V·弗蘭卡德, D·杜迪斯, A·費赫爾 申請人:克羅普迪塞恩股份有限公司