一種截短的甘露聚糖酶的設計與製備的製作方法

2023-09-12 21:36:15

專利名稱：一種截短的甘露聚糖酶的設計與製備的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程和蛋白質表達領域，尤其涉及截短的Aus Man5A(dAus Man5A)的設計和表達，以及該酶的性質和應用的研究。
背景技術：
β -甘露聚糖酶(β-1,4-D-mannan mannohydrolase, EC 3.2.1.78)是一種能從均一甘露聚糖和異甘露聚糖主鏈的內部降解β_1，4-甘露糖苷鍵的水解酶，屬於半纖維素酶類，其廣泛地存在於微生物、植物和動物中。它可以廣泛應用於食品、醫藥、飼料、造紙、印染和石油工業等領域。在食品和醫藥領域，β-甘露聚糖酶作用於甘露聚糖後可以產生功能性低聚糖，這種低聚糖可以有效地降低人體血糖和膽固醇水平且有利於人和動物腸道內益生菌群的生長，進而調節人和動物的免疫系統、提高免疫力。在飼料工業中，它作為飼料添加劑能有效降解植物細胞壁中的甘露聚糖成分，消除抗營養因子，提高能量利用率、改善飼料轉化率。在造紙工業中，β_甘露聚糖酶和β_木聚糖酶等半纖維素降解酶類協同使用， 處理紙漿，能明顯改善紙質。將β_甘露聚糖酶運用紡織印染的漂白工藝中，能有效地去除產品上粘附的多餘染料，更可以減少氯和鹼的用量以及它們帶來的環境汙染問題，有利於生態環境的保護。目前已報導的能產β_甘露聚糖酶的微生物主要來自於細菌、真菌和放線菌，例如細菌中的枯草芽孢桿菌，真菌中的麴黴、木黴、青黴、酵母，以及放線菌中的鏈黴菌等。目前，關於第5家族β -甘露聚糖酶的報導較多，它們的最適pH值為3. O 7. 5，最適溫度在45 92°C。
近年來，隨著對自然界中半纖維素資源的開發、飼糧中甘露聚糖抗營養因子的消除以及甘露寡糖生理功能的發現，甘露聚糖酶的需求量越來越大，導致對甘露聚糖酶的研究和開發進入一個新高潮。但就國內外相關文獻或專利報導來看，微生物β_甘露聚糖酶發酵酶活性普遍不高，導致了生產成本很高，從而阻礙了該酶在眾多領域中的廣泛應用。另外為了提高β_甘露聚糖酶的發酵產率和酶活性，早期的研究工作主要集中在產酶菌種的篩選、誘變、產酶誘導，酶的分離純化及性質，酶水解底物方式及應用等方面。進入 90年代，隨著基因工程技術和蛋白質工程技術的廣泛應用，研究工作逐步轉向酶基因的克隆和表達以及酶活性位點的研究等方面。目前，雖已有一些有關甘露聚糖酶基因的克隆和表達的文獻和專利報導，但有關基於理性設計的甘露聚糖酶的分子改造，尤其是關於截短基因設計和表達的研究鮮有報導。據報導，蛋白質N端和C端的無序殘基對蛋白的結構或功能的影響是難以捉摸的。 發明內容
本發明的目的是提供一種催化效率高的dAus Man5A截短酶分子的設計與構建的方法，對原有的Aus Man5A進行了分子改造。
本發明的技術方案將原有Aus Man5A的N端和C端分別截掉3個無序殘基,構建出dAus Man5A截短酶，截短酶的核苷酸序列為SEQ ID NO :1，相應地基因命名為dAusman5A。
攜帶有Aus Man5A基因的重組質粒pUCm-T_man5A有由江南大學構建和保藏(專利申請號:201010550927. 4)。
所述的截短酶的胺基酸序列為SEQ ID N0:2。
所述的截短酶的活性測定方法
於25mL具塞試 管A和B中，各加入用pH 4. 8、乙酸-乙酸鈉緩衝液配製的質量濃度為O. 5%的角豆膠溶液2. 4mL，50°C預熱lOmin，在A管中加入O.1mL適當稀釋的酶液，50°C 準確反應IOmin ;立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水楊酸(DNS)試劑，在B管中再補加 O.1mL酶液，A和B管均煮沸7min ;冷卻後各加去離子水5mL，搖勻；540nm處以B管為空白對照測定A管吸光度值，並從甘露糖標準曲線上查出相應的還原糖(以甘露糖計)含量並折算成酶活性單位。酶活性單位定義在本測定條件下，以每分鐘產生I μ mol還原糖所需的酶量定義為I個β -甘露聚糖酶活性單位(IU)。
所述的截短酶基因的構建和表達的方法
(I)截短殘基的選定以裡氏木黴β-甘露聚糖酶的三維結構(IQNR)為模板，用 Modeller9. 9 軟體模擬出 Aus Man5A 的三維結構。利用 Discovery Studio 3. OClient 和 PyMOL軟體對模擬出的三維結構進行分析，確定末端的無序殘基。
(2)截短酶dAus Man5A基因的合成基於上面設計的截短酶基因序列，採用PCR技術將Aus Man5A的基因序列5'和3'端分別去掉9個鹼基。PCR涉及到的兩對引物分別為
dN3C3-F CTCGAGAAAAGAAGCACC TCCGGCCTCCAATTC,
dN3C3~R GCGGCCGCTTAAATAGCA GCAACATGATCCGTC。
以重組質粒pUCm-T-man5A為模板、dN3C3_F和dN3C3_R為弓I物進行PCR反應，反應條件為94°C 4min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin,30 個循環；72°C IOmin ;10°C永久保存。 將PCR產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測後回收目的片段dAus man5A並將它與pUCm_T載體連接，將連接產物熱激轉化入大腸桿菌JM109感受態細胞後進行藍白斑篩選、菌液PCR鑑定及測序鑑定。
(3)重組表達質粒的構建將測序正確的pUCm-T-dAus man5A及pPIC9KM分別用XhoI和Not I進行雙酶切，回收目的片段並進行連接和轉化。然後對重組菌進行篩選和鑑定，將經過初步鑑定的質粒送至上海生工進行測序驗證，測序正確的重組質粒命名為 pPIC9KM-dAusman5A (圖1)。
(4) GS115/dAus man5A的構建、表達、產物純化及活性測定將測序正確的 pPIC9KM-dAus man5A經Sac I線性化後電轉入畢赤酵母GS115感受態細胞，先經MD平板篩選後再用G418篩選高拷貝的GS115/dAus man5A重組子，將高拷貝的重組子按照畢赤酵母表達手冊上的標準流程進行誘導表達，並對發酵液進行活性測定和酶學性質初步鑑定。
本發明的有益效果本發明提供了一種dAus Man5A截短酶的設計與構建的方法， 新型截短酶工程菌GS115/dAus man5A的構建，以及截短酶的高效表達的方法。截短酶具有底物親催化效率高的優點，有較大的工業化生產、應用潛力和經濟價值，也為其它β -甘露聚糖酶的研究奠定了理論基礎。


圖1 :重組質粒pPIC9KM_dAus man5A的構建示意圖具體實施方式
以下結合具體實施例，進一步闡述本發明的操作方法。但是這些實施例僅用於詳細說明本發明，而不用於限制本發明的範圍。
實施例1截短酶基因及其表達質粒的構建
以重組質粒pUCm-T-man5A為模板、dN3C3_F和dN3C3_R為引物進行PCR反應，反應條件為94°C 4min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin,30 個循環；72°C IOmin ;10°C永久保存。 將PCR產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測後回收目的片段dAus man5A並將它與pUCm_T載體連接，將連接產物熱激轉化入大腸桿菌JM109感受態細胞後進行藍白斑篩選、菌液PCR鑑定及測序鑑定。將測序正確的pUCm-T-dAus man5A及pPIC9KM分別用Xho I和Not I進行雙酶切，回收目的片段並進行連接和轉化。然後對重組菌進行篩選和鑑定，將經過初步鑑定的質粒送至上海生工進行測序驗證，測序正確的重組質粒命名為pPIC9KM-dAUsman5A。
實施例2GS115/dAus man5A的構建、表達、及活性測定
用Sal I對pPIC9KM-dAus man5A進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、 篩選 ，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/dAus man5A。該基因工程菌用1.0%甲醇誘導表達72h，採用DNS法測得發酵液中甘露聚糖酶活性比原酶的活性有較大提高。考馬斯亮藍法測定蛋白濃度的結果表明，截短酶的蛋白表達水平也明顯高於原酶。
權利要求
1.一種表達水平和催化催化效率高的dAus Man5A截短酶，其核苷酸和胺基酸序列分別為 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2。
2.截短酶工程菌的構建和表達方法 (1)截短殘基的選定以裡氏木黴β_甘露聚糖酶的三維結構(IQNR)為模板，用Modeller9. 9 軟體模擬出 Aus Man5A 的三維結構。利用 Discovery Studio 3. OClient 和PyMOL軟體對模擬出的三維結構進行分析，確定末端的無序殘基； (2)截短酶dAusMan5A基因的合成基於上面設計的截短酶基因序列，採用PCR技術將Aus Man5A的基因序列5'和3'端分別去掉9個鹼基；PCR涉及到的兩對引物分別為dN3C3-F CTCGAGAAAAGAAGCACCTCCGGCCTCCAATTC,dN3C3-R GCGGCCGCTTA A ATAGCAGCA ACATGATCCGTC ； 以重組質粒pUCm-T-man5A為模板、dN3C3_F和dN3C3_R為引物進行PCR反應，反應條件為94°C 4min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin, 30 個循環；72°C IOmin ;10°C永久保存；將PCR產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測後回收目的片段dAus man5A並將它與pUCm_T載體連接，將連接產物熱激轉化入大腸桿菌JM109感受態細胞後進行藍白斑篩選、菌液PCR鑑定及測序鑑定； (3)重組表達質粒的構建將測序正確的pUCm-T-dAusman5A及pPIC9KM分別用XhoI和Not I進行雙酶切，回收目的片段並進行連接和轉化。然後對重組菌進行篩選和鑑定，將經過初步鑑定的質粒送至上海生工進行測序驗證，測序正確的重組質粒命名為pPIC9KM_dAusman5A ； (4)GS115/dAusman5A的構建、表達、產物純化及活性測定將測序正確的pPIC9KM-dAus man5A經Sac I線性化後電轉入畢赤酵母GS115感受態細胞，先經MD平板篩選後再用G418篩選高拷貝的GS115/dAus man5A重組子，將高拷貝的重組子按照畢赤酵母表達手冊上的標準流程進行誘導表達，並對發酵液進行活性測定和酶學性質初步鑑定。
全文摘要
一種截短的甘露聚糖酶的設計與製備。本發明提出了一種催化效率和表達水平較高的dAus Man5A截短酶的設計與構建的方法，其核苷酸序列為SEQ ID NO1，胺基酸序列為SEQ ID NO2，相應的基因命名為dAusman5A。本發明還公開了截短酶工程菌的構建以及高效表達的方法，製備的截短酶具有表達水平和催化效率高的特性，具有較大的工業化生產潛力和經濟價值。
文檔編號C12N15/56GK102994531SQ201210562588
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月24日 優先權日2012年12月24日
發明者鄔敏辰, 唐存多, 陳忠法, 李劍芳 申請人:江南大學