溶劑誘導的細胞自溶作用的製作方法

2023-09-12 06:02:50

專利名稱:溶劑誘導的細胞自溶作用的製作方法
本發明涉及從酵母細胞中提取蛋白質的一種方法。另一方面，本發明涉及破碎細胞來釋放蛋白質(例如酶)的幾種方法。更進一步，本發明還涉及從酵母中獲取酶的方法。
發酵技術與各種碳能培養基、特定的微生物菌株結合能夠產生有用的胞內酶。人們迫切需要破碎細胞，獲得細胞內所含的蛋白質，尤其是需要從中獲取有用的酶，而酶本身沒有遭到破壞。
現已有各種破碎酵母細胞，以釋放所含蛋白質，特別是酶的方法。機械破碎技術中包括了球磨、研磨、聲波處理等，且常用冷卻的辦法來減少蛋白質的斷裂。然而，機械破碎總是使酶發生降解，而得到極不均勻的細胞碎片混合物，這種混合物則很難同水溶性成分有效地分離開來。也可通過加酶來使細胞壁破壞或破碎，釋放出細胞內含物。但是，所加的酶可能是昂貴的，同時也引進了異種蛋白質，帶來一些不必要的分離問題，或者是在使用所需的酶的過程中引起一些不必要的副作用。
已採用過化學方法來引起自溶作用(質壁分離)，包括了各種碳氫化合物，例如甲苯;羰基化合物，它包括乙酸乙酯、丙酮，其它二烷基酮;以及其它化學物質，例如乙醚和醇，如C-C的烷基醇。這些化學方法的結果隨所用的有機物，細胞生長條件，暴露時間和溶劑濃度而變化。其中有些方法是危險的，這是因為在所要求的處理溫度下，揮發性可為燃燒，實際上是爆炸創造條件。一些方法需要高濃度的溶解劑，這勢必在以後的純化步驟中引起一些分離上的麻煩。
利用安全的材料，溫和的條件與最小的外加溶解成分，來獲得從細胞中釋放出蛋白質的良好結果的新方法仍然是當前的需要。
發明人發現，某些在水中濃度相對來說十分低的多氯脂肪族處理劑，伴隨幾小時的大約在室溫下的孵化就能導致酵母細胞的分解(斷裂)，從而釋放出細胞內產物，包括酶和其它蛋白質。
本發明人的方法是，利用水中非常少量的多氯脂肪族處理劑與酵母細胞的混合，組成一種水的分散體系，得到的三組分混合物須孵化一定的時間。此方法實質上是使所有細胞適當的破裂，一般來說至少有80%(以個數計)的細胞破裂，使可溶性蛋白質成分釋放到水的分散體系中，而後，這些酶和其它蛋白質可採用常用的方法回收。
本發明人的方法是，利用多氯脂肪族處理劑產生溶劑誘導的自溶作用，此法溫和，可靠、效率高、酶回收好、勞動強度小。加入相當少的多氯脂肪族處理劑不會干擾回收過程，也不需要分離。實際上，在細胞分解後所需的純化過程中，它們能夠作為抑菌劑。
多氯化合物本發明人所用的多氯脂肪族處理可稱之為非苯型碳氫化合物的多氯衍生物。更詳細地說，這些處理劑是鏈烴的多氯衍生物，通常在標準溫度和壓力下是液體。
下面的例子是一些可以利用的，在常溫常壓下是液體的鏈烴多氯衍生物，它們能夠單獨使用或混合使用。以下這些化合物僅僅是作為例子而已，而不限於此範圍。
二氯甲烷1，2-二氯乙烯(順式或反式)1，1-二氯乙烷氯仿2，2-二氯丙烷1，1，1-三氯乙烷四氯化碳氯化乙烯三氯乙烯1，2-二氯丙烷1，1，2-三氯乙烷四氯乙烯1，3-二氯丙烷s-四氯乙烷(對稱四氯乙烷)1，2，3-三氯丙烷五氯乙烷目前，以氯仿或二氯甲烷最好。
酵母的範圍根據本方法，本發明使用了在水溶液的有氧的發酵條件下生長在含碳培養基上的酵母細胞。
合適的酵母包括了以下這些屬的種，例如假絲酵母屬、漢遜酵母屬、球擬酵母屬、酵母屬、畢赤酵母屬、德巴利酵母屬和酒香酵母屬。目前最好的屬包括假絲酵母屬、漢遜酵母屬、球擬酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬。合適種的實例包括親石酒香酵母 粉狀畢赤酵母博伊丁假絲酵母 多形畢赤酵母解脂假絲酵母 膜醭畢赤酵母糙醭假絲酵母 松畢赤酵母產朊假絲酵母 巴斯德畢赤酵母星形假絲酵母 喜海藻糖畢赤酵母強力假絲酵母 釀酒酵母克勞森假絲酵母 脆壁酵母皺落假絲酵母 羅斯酵母熱帶假絲酵母 產酸酵母漢遜德巴利酵母 雅致酵母小漢遜酵母 魯酵母土星漢遜酵母 乳酸酵母加州漢遜酵母 聲生球擬酵母森林漢遜酵母 白球擬酵母多形漢遜酵母 波蒙球擬酵母碎囊漢遜酵母 易變球擬酵母葡糖酶漢遜酵母 光滑球擬酵母亨利漢遜酵母 胎生球擬酵母不發酵漢遜酵母 草樹球擬酵母威克漢漢遜酵母 喜硝酸鹽球擬酵母喜林竽漢遜酵母 松球擬酵母霍氏梯漢遜酵母 泡濾球擬酵母如果需要，可用兩個或更多的酵母種的混合物。眾所周知，不同的酵母需要略有不同的培養基使它們很好地生長，專一的生物化學轉化需用專一的酵母屬或種來順利地進行，因此，採用哪一種或哪一些酵母，部分地取決於所用的含碳養基。例如，已知以上某些種的特定菌株不能在甲醇上很好地生長，即不能利用甲醇。
處理方法酵母細胞很容易處理成一種細胞漿，它包含著全部酵母細胞的物質成份，若以整個細胞為基礎，固體的重量百分含量大約為8.5-15%，最好為10-13%。酵母細胞能與水和本發明人的多氯處理組分混合，形成一種水漿，每升約含85-150克細胞，最好時含100-130克。較低的細胞濃度也可採用，但結果可能不會那麼令人滿意。目前的數據指出，細胞重量濃度低到2-3%時，酶釋放就不會發生。
水漿或細胞漿其餘的百分組成實質上是水和多氯處理劑。水組分可以是純水、含少量鹽的水，或者是發酵器流出物中的不經處理的液體，用這種液體可能是方便的，切實可行的，或者是所希望的。
以整個三組分體系為基礎，在處理劑、時間和溫度一定的情況下，多氯處理劑的量應該能有效地使特定細胞自溶。建議處理劑的體積百分含量約為0.8-6%，最好約是1.5-4%。
混合可通過任何方便的方法進行，例如倒在一起，攪拌等，這取決於所用的量和材料。不要機械拍打或強烈混合，以免引起細胞的物理破裂。
任何混合順序都是合適的。細胞與水組分混合，然後加多氯處理化合物，這個順序目前是最好的。但是，也能夠先將多氯化合物和水組分混合，再加入酵母細胞。
最好的方便的辦法是利用從發酵步驟出來的水合酵素本身，它含有上清液的水溶液和懸浮的酵母細胞。如有需要，這些細胞能通過諸如離心、過濾的辦法得到分離。如果要排除殘餘的礦物，則可用水洗，然後再懸浮在淡水中。換句話說，如有需要，水合酵素的細胞濃度可通過過濾、離心、除溶劑或諸如此類的辦法得到增加。若水合酵素來自高細胞密度酵母發酵過程，則在需要時，可直接使用這種水合酵素。
PH對於三組分體系，雖然PH在約6.5-8.5這樣一個範圍是合適的，但起初最好調到PH至少約為7，比較好是大約7.25-8的PH起始調節範圍。某些酵母的水分散體系的PH隨時間變化常略有點降低。生產酵母細胞的水合酵素的PH通常有點偏酸性。在某些情況下，加入少量的稀的氫氧化銨、氫氧化鈉，或者相似的鹼，最好是稀溶液，可調節PH。
溫度接觸溫度可以方便地採用大體上是室溫範圍這樣的溫度，或者當水合酵素本身被直接使用時，通常從發酵罐出來時水合酵素的溫度。
通常採用的接觸溫度約為20至35℃，更好的是約25至35°為方便起見，最好把接觸溫度取定為保存或孵化時的溫度。
保存時間(Holding Time)「保存」或「孵化」時間應至少約16小時，較常用的是約16至90小時，目前最好的時間約是24至48小時。
由酵母細胞、水和多氯處理化合物混合而成的三組分體系可在不鏽鋼、玻璃襯裡或類似的保存器、罐中保存一定的時間。發酵容器本身也可用作保存器。PH和溫度應按上述條件控制。通常，不需要連續的攪拌，但在需要時，可以適當的攪拌或摻合。
目前尚不知這種保存物是否需要避開空氣或氧氣，然而，通常建議用密閉的容器使容器中的多氯碳氫化合物溶劑的損失減到最小。
目前也不知這種保存物是否需要避免光，然而，通常保存容器內是暗的。
在保存或孵化時間內，酵母細胞壁破裂，斷開成碎片，並將所含的蛋白組分釋放到周圍的水環境中去。
此後可回收包括酶在內的蛋白質。
回收可以採用多種方法從分解的細胞中回收蛋白質，特別是酶。如有需要，採用本發明的處理過程得到的含蛋白水溶液可以通過離心除去細胞碎片和其它懸浮的固體。水溶液中的可溶性蛋白質可通過下述方法從固相中回收溶劑分配、吸收在固體基質上、超過濾、離心和沉澱，或者是這些方法的結合。對本發明人的工藝來說，最好的回收辦法是離心和/或超過濾(特別是回收醇氧化酶和乳糖酶時)。
酶本發明特別適合於從一些生產某些酶的能力特別強的微生物中回收酶。例如，脆壁克魯維酵母能大量生產出乳糖酶。巴斯德畢赤酵母，至少是某些菌株，當生長在甲醇培養基上時，能生產大量的非常需要的醇氧化酶，同時也生產過氧化氫酶和甲酸脫氫酶等。
實例所舉實例是為了幫助熟悉工藝的人進一步了解本發明。應該把這裡所用的物質視作舉例，而不是一種限制。在考慮本發明的合理的和適用的範圍時，應該作為一個整體來閱讀本說明書，包括正文、實例、數據和權利要求
書。
發酵描述下面所做的發酵描述代表幾種類型的發酵過程，它們為進一步的處理提供含細胞的流出液，如以下實例所述。
在一個連續的有氧發酵過程中，甲醇和無機鹽水介質以40∶60的體積比分別投入到發酵罐中，用酵母種巴斯德畢赤酵母NRRL Y-11430接種，投入的速率恰使甲醇成為生長限制因素。發酵罐是一個1500升充滿泡沫的發酵器，其中盛有液體610升，發酵罐可自動控制PH、溫度和液面。用常用的漿型葉輪攪拌，轉速1000轉/分。通氣速率為發酵罐中一體積的酵素每分鐘通4體積空氣(表壓，約38鎊/平方英寸;25℃)。無水氨按維持發酵混合物PH在3.5左右的速率加入。
無機鹽水介質的製備方法是將15.86毫升75%(以重量計)H3PO4、9.53克K2SO4、7.8克Mg SO4·7H2O、0.6克CaCl2·2H2O和2.6克85%(以重量計)KOH與一升自來水混合而成。無機鹽水介質以31.5升/小時的速率投入，甲醇以21升/小時的速率投入。
微量無機鹽溶液(就一升溶液來說)是將65克FeSO4·7H2O，20克ZnSO4·7H2O，3.0克MnSO4·H2O，6.0克CuSO4·5H2O，5.0毫升濃H2SO4和足夠的去離子水混合而製成1升溶液。加有酵母生長素的微量無機鹽溶液是將780毫升微量無機鹽溶液，20毫升水，200毫升甲醇和0.032克酵母生長素混合而製成的。加有酵母生長素的無機鹽溶液的投入是藉助於甲醇流，按每升甲醇10毫升這種溶液的比率單獨投入。
發酵在約30℃、38磅/平方英寸壓力的條件下進行，平均滯留時間約為11.6小時，細胞密度一般是每升發酵器流出物含128.4克細胞。酵素總的固體量一般約為每升134.7克。
所獲得的酵母細胞可通過離心的方法從發酵流出物(水酵素)中分離出來，懸浮在水中洗滌，再離心分離，在100℃乾燥過夜，稱重。以乾重計算，酵母細胞的產生率一般大約是每投入100克甲醇得40.6克細胞。
實例1加足夠稀的氫氧化鈉，將巴斯德畢赤酵母NRRL Y-11430水漿或細胞漿的PH調到7.5，每升水漿或細胞漿大約含130克純細胞，這種水漿或細胞漿基本上是按發酵描述部分所述的方法，從以甲醇作培養基的高細胞密度發酵過程中獲得的。
加0.5毫升所選用的處理劑到15毫升已調過PH的細胞漿內。所得處理混合物在室溫下保存約兩天，有時摻合一下。然後，對每個樣品進行離心，測定上清液的醇氧化酶活性，獲得如下結果表Ⅰ實驗標號使用的溶劑醇氧化酶活性(a)1 水 無2 0.5克醋酸鈉 很小3 四氫呋喃 很小4 己烷 很小5 氯仿 63.96 甲苯 6.47 乙醚 0.33
8 乙醚(0.1毫升) 很小9 0.6%疊氮化鈉 很小10 二甲基亞碸 很小11 丙酮 很小12 1% Triton X-100(b)很小13 乙酸乙酯 很小(a)酶活力單位/毫升，按鄰聯(二)茴香胺/過氧化物酶法測定。(b)R-ohm-Haas表面活性劑。
己烷和乙醚是已知的處理劑，它們用來作比較。顯然，本發明中的第5號實驗在所用的濃度範圍內比其它一些的活性高几個數量級。
實例Ⅱ加1.5毫升所選用的處理劑到50毫升已調過PH的巴斯德畢赤酵母細胞漿樣品中，混合，室溫下放置，樣品的製備方法基本與上述方法相似。24小時以後，再加1.5毫升處理劑到己烷樣品中。下面的第17號實驗中加了3毫升乙醚，總孵化時間約48小時。其它樣品的總孵化時間也為28小時，樣品離心分離，按上述方法測定。
表Ⅱ標號處理劑處理劑總量(毫升) 所得上清液醇氧化酶活性(a)14 己烷 3.0 0.4715 氯仿 1.5 189.716 乙醚 1.5 017 乙醚 3.0 219.618 甲苯 1.5 48.5(a)見表Ⅰ腳註(a)
在高濃度時，加乙醚所得的上清液表現出相當大的醇氧化酶活性。這一既有的工藝方法因使用易燃、可能爆炸的材料而受到影響。本發明用氯仿的方法顯示出非常高的活性，這與用乙醚的方法相似，而且本發明用的是一種在低濃度下相對安全的試劑。同時還應注意的是這些處理過的細胞能夠離心沉澱，所需g力比機械破碎(珠研磨機或法蘭四壓榨器)細胞所需的力要小，而且產生非常好的上清液。
己烷法和甲苯法實際上是無效的。
實例Ⅲ巴斯德畢赤酵母NRRL Y-11430的生產仍基本上按上述方法進行。巴斯德畢赤酵母水漿每升約含130克細胞，0.01%(以重量計)的疊氮化鈉，並按上述方法調PH至7.5，分別加入不同量的氯仿或二氯甲烷。將所得混合物室溫放置約四天(96小時)，有時振蕩一下。然後，每個樣品以13，000轉/分的轉速離心分離15分鐘。上清液在4℃儲存，約兩天後，分析醇氧化酶。
表Ⅲ50毫升畢赤酵母漿 醇氧化酶 溶液的顏色標號處理劑所加處理劑毫升數的測定(a)19 氯仿 0.5 366.8 深紅20 氯仿 1.0 318.5 紅21 氯仿 1.5 235.7 紅22 二氯甲烷 0.5 311.6 深紅23 二氯甲烷 1.0 149.5 紅24 二氯甲烷 1.5 209.3 紅(a)見表Ⅰ腳註(a)以上結果表明，無論是氯仿還是二氯甲烷都產生所需的含醇氧化酸上清液。看來在所用的相當長的孵化時間內，較小量的多氯化合物生產能力大。
實例Ⅳ下面的實驗仍然用上述的巴斯德畢赤酵母，實驗過程也基本上與上面的相同。但是孵化時間是48小時，而不是上述實例的96小時。所得上清液在測定前在4℃保存兩天。每個例子中的巴斯德畢赤酵母的體積仍是50毫升，每升約含130克細胞，結果如表Ⅳ所示表ⅣA50毫升畢赤酵母漿 醇氧化酶 溶液的顏色標號處理劑所加處理劑毫升數的測定(a)25 氯仿 0.5 147 亮橙色26 二氯甲烷 0.5 149 亮橙色27 二氯甲烷 0.2 很小 亮橙色28 1.1.1-三氯乙烷 0.5 159 亮橙色(a)見表Ⅰ腳註(a)每種多氯處理劑都是有效的。處理劑的最小用量很容易確定，如二氯甲烷的實驗所示。
重複以上實驗，但孵化時間是三天而不是上述的兩天，所得結果如表ⅣB所示表ⅣB50毫升畢赤酵母漿醇氧化酶測定(a)標號 處理劑 中處理劑的毫升數29 二氯甲烷 1.0 18630 二氯甲烷 0.5 7231 1，1，1-三氯乙烷 0.5 29832 乙醚 1.5 28933 無 - 2
(a)見表Ⅰ腳註(a)這些比較結果說明，三氯乙烷和二氯甲烷是非常有效的。將這些結果與表ⅣA的結果比較，說明在二氯甲烷量較小(0.5毫升)時，較長的孵化時間可能並不好。
實例Ⅴ用以下實驗分析PH對溶劑誘導的酵母細胞自溶作用的影響。所選的酵母細胞仍是上述生長在以甲醇作碳能的培養基上的巴斯德畢赤酵母NRRL-Y-11430。對一組體積為50毫升的巴斯德畢赤酵母細胞，用氫氧化銨調PH，使其在6.5-8.0的範圍內。每個樣品每升約含130克細胞。在每個樣品中加1.0毫升二氯甲烷。每個樣品孵化兩天。接著將每個樣品離心分離，決定其上清液的醇氧化酶活性。所得結果如下表Ⅴ標號起始PH 孵化後的PH 醇氧化酶的測定(a)34 6.5 6.2 很小35 7.0 6.5 8036 7.25 6.6 12437 7.5 6.7 16638 7.75 6.9 13939 8.0 7.0 152(a)見表Ⅰ腳註(a).
從以上實驗似乎可得出孵化開始時，細胞混合物的PH至少應調到7左右，7.5左右可能更好。在孵化期間，PH為什麼有些下降還不十分清楚，但可能是從空氣中吸收了一些二氧化碳，或者是細胞代謝產生了酸的緣故。
實例Ⅵ在水有氧的發酵條件下，脆壁克魯維酵母NRRL Y-2264生長在以粗乳糖(乾酪清滲透)作碳能的培養基上，其發酵溫度為37℃。每個體積為50毫升的脆壁克魯維酵母樣品含4.5克(9%，以重量計)酵母細胞，每個樣品加足夠稀的氫氧化鈉調PH至約7.5。
然後，對每個調過PH的樣品，加入0.5毫升的二氯甲烷或三氯乙烷。在24、48和96小時的孵化時間內，上清液的乳糖活性是穩定的。乳糖酶的活性通過β半乳糖苷酶的測定方法決定。
表Ⅵ標號處理劑孵化時間乳糖酶活性(a)40 二氯甲烷 24小時 10.841 二氯甲烷 48小時 8.342 二氯甲烷 72小時 5.243 三氯乙烷 24小時 4.244 三氯乙烷 48小時 8.5745 三氯乙烷 72小時 6.94(a)酶活力單位/毫升，以鄰硝基苯基半乳糖苷為底物，按β-半乳糖苷酶活性為準測定就每種溶劑來說，對已知濃度的處理劑，似乎都有一個最佳孵化時間，如上所述，這一時間很容易確定。
實例Ⅶ與實例Ⅵ所述相似，脆壁克魯維酵母Y-2264仍生長在水的有氧的發酵條件下，其PH約為4.7，發酵溫度37℃，並有少量的維生素。
用濃氫氧化鈉調酵母細胞水漿的PH約至7.5。每個樣品中每升酵母細胞約含110克細胞，對一組50毫升的酵母漿，加入不同量的二氯甲烷或三氯乙烷。每個樣品室溫孵化約48小時，有時振蕩一下。然後，對每個樣品離心分離，其上清液通過β半乳糖苷酶法測定乳糖酶的活性。在孵化時間以後，每個樣品的最終PH估計約為7.0。結果如下
表ⅦA標號處理劑加的毫升數乳糖酶的活性(a)46 二氯甲烷 0.2 無47 二氯甲烷 0.5 7.8848 二氯甲烷 1.0 4.8849 二氯甲烷 1.5 3.6850 三氯乙烷 0.2 無51 三氯乙烷 0.5 4.9752 三氯乙烷 1.0 4.1153 三氯乙烷 1.5 7.11(a)見表Ⅵ腳註(a)這些結果說明，對某一已知試劑來說，多氯處理劑看來有一最佳濃度，這一濃度會隨有關的特定的酵母菌株的變化而變化。如上所述，最大活性是容易確定的。
如上所示的另外幾份脆壁克魯維酵母被用來做試驗。用濃氫氧化鈉改變起始PH。在每個樣品中加一毫升處理劑，每一個50毫升的酵母細胞樣品每升約含110克細胞。樣品在室溫下孵化兩天，有時搖動一下。然後，對每個樣品離心分離，通過β半乳糖苷酶法測定上清液的乳糖酶活性。結果如下表ⅦB標號處理劑起始PH 最終PH 乳糖酶活性(2)54 二氯甲烷 6.5 6.43 無55 二氯甲烷 7.0 6.72 4.2856 二氯甲烷 7.25 6.75 4.2857 二氯甲烷 7.5 6.84 4.2858 二氯甲烷 7.75 6.88 4.71
59 二氯甲烷 8.0 6.96 4.8860 三氯乙烷 6.5 6.23 4.9761 三氯乙烷 7.0 6.40 7.9762 三氯乙烷 7.25 6.45 7.863 三氯乙烷 7.55 6.49 8.8364 三氯乙烷 7.75 6.49 8.9165 三氯乙烷 8.0 6.50 7.28(a)見表Ⅵ腳註(a)結果表明，本發明的多氯脂肪族處理劑酶提取法在PH約為7-8的範圍內是相當有效的。
實例Ⅷ本實例的數據說明起始細胞密度的重要性。巴斯德畢赤酵母NRRLY-11430完全按上述的方法生長。用4體積的巴斯德畢赤酵母細胞介質稀釋50毫升的酵母細胞漿，其細胞密度為～25%(以重量計)。(稀釋過的)樣品和未稀釋的對照樣品的PH都調至7.9-8.2之間，並且使它們的二氯甲烷和疊氮化鈉的含量，如本文較前部分所述，分別為1%和0.01%。兩個樣品在32-35℃孵化22小時，在此期間，這兩個樣品中的細胞都沉降下來。
表Ⅷ標號上清液的顏色上清液(總的)醇氧化酶活性＃54-對照 紅色 398酶活力單位55-稀釋 黃色 40酶活力單位＃2，2′-連氮基-D1-(3-乙基苯基二氫噻唑)測定方法。
由此可見，第55號實驗中的2-3%(以重量計)數量級的低細胞密度對上清液總的醇氧化酶活性產生不利的影響，並將可達到的醇氧化酶活性減小到僅僅根據稀釋因素所預計的活性之下以上所公開的內容，包括數據，說明了本發明的價值和有效性。所述的實例、本發明所涉及領域的知識和背景，以及化學和其它應用科學的一般原理形成了一個基礎。本發明的廣泛性的描述(包括實施條件的範圍和有效組分的屬類)在此基礎上發展起來，並構成本發明之權利要求
的基礎。
權利要求
1.從整體酵母細胞中回收蛋白質的一種方法包括，它包括(a)形成一種已調過PH的水的混合物，它由含蛋白質的酵母細胞和大量的水溶液，以及較少的有效量的通常為液態的多氯脂肪族碳氫化合物處理劑所組成，其中所說的PH大約為6.5-8.5，而其中所說的混合物含有0.8-6%(以體積計)的處理劑，(b)在溫度約20-35℃，PH約6.5-8.5的條件下孵化所說的混合物16-90小時，由此，至少有一部分所說的蛋白質從所述細胞中釋放到所述的水裡，形成一種含蛋白質的水溶液，(c)分離液體和固體材料，其中所述的液體中含蛋白質。
2.根據權利要求
1的方法，其中所說的處理劑至少是選自於下面一組合物中的一種二氯甲烷，1，2-二氯乙烯(順式或反式)，1，1-二氯乙烷，氯仿2，2-二氯丙烷，1，1，1-三氯乙烷，四氯化碳，氯化乙烯，三氯乙烯，1，2-二氯丙烷，1，1，2-三氯乙烷，四氯乙烯，1，3-二氯丙烷，對稱(s-)四氯乙烷，1，2，3-三氯丙烷，五氯乙烷。
3.根據權利要求
2的方法，其中所說的蛋白質是酶。
4.根據權利要求
3的方法，其中所說的孵化溫度約為25℃-35℃，孵化時間約為24-48小時。
5.根據權利要求
2的方法，其中所說的酵母選自於以下一組屬假絲酵母屬、漢遜酵母屬、球擬酵母屬、酵母屬、畢赤酵母屬、德巴利酵母屬以及酒香酵母屬。
6.根據權利要求
5的方法，其中所說的蛋白質是酶
7.根據權利要求
6的方法，其中所說的酵母是畢赤酵母。
8.根據權利要求
7的方法，其中所說的酶是醇氧化酶。
9.根據權利要求
8的方法，其中所說的處理劑至少是二氯甲烷、氯仿和1，1，1-三氯乙烷中的一種。
10.根據權利要求
6的方法，其中所說的酵母是克魯維酵母屬。
11.根據權利要求
10的方法，其中所說的酶是乳糖酶。
12.根據權利要求
11的方法，其中所說的處理劑至少是二氯甲烷、氯仿和1，1，1-三氯乙烷中的一種。
13.根據權利要求
1的方法，其中還包括從固體物質中回收分離液體，其中所說的液體包含蛋白質。
14.根據權利要求
12的方法，其中還包括從固體物質中回收分離液體，其中所說的液體含有蛋白質。
專利摘要
從酵母細胞中回收蛋白質(例如酶)的方法，包括在適當的pH下，形成一個含有酵母細胞、水和較少有效量的多氯脂肪族碳氫化合物的混合物；在適當溫度和時間，例如室溫，16-90小時下孵化。所得上清液分離成含高活性酶的水溶液。如果需要，酶可以收回。典型的應用包括以脆壁克魯維酵母獲取乳糖酶，以巴斯德畢赤酵母獲取醇氧化酶。典型的溶劑則包括二氯甲烷、1，1，1-三氯乙烷與氯仿。
文檔編號C07K14/37GK86103223SQ86103223
公開日1987年1月28日 申請日期1986年5月9日
發明者索馬斯·R·霍普金斯 申請人:菲利普石油公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan