一種促進2-酮基-l-古龍酸高效生產的方法
2023-09-14 03:27:05 2
專利名稱：一種促進2-酮基- l-古龍酸高效生產的方法
技術領域：
本發明屬於微生物發酵工程領域，具體涉及ー種在發酵過程中通過連續添加D-核糖母液來促進2-酮基-L-古龍酸高效生產的方法。
背景技術：
維生素C (V。)是ー種水溶性維生素，又名L-抗壞血酸，能參與體內多種羥化反應和氧化還原反應，是ー類重要的細胞代謝氧化還原化合物，在生物體中起著必不可少的生理作用。20世紀70年代初，尹光琳等篩選出了可以直接將L-山梨糖轉化為合成維生素C的重要前體2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)的混合菌種一巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)和普通生酮古龍酸菌(Ketogulonigenium sp.),發明了維生素C ニ步發酵法。該方法通過兩步發酵大大筒化了萊氏法生產維生素C的合成路線，具有糖酸轉化率高的突出優勢，目前國內生產廠家生產維生素C都採用ニ步發酵法。第二步混菌發酵的發酵水平決定了ニ步發酵法的發酵水平。在目前維生素C的生產企業中，發酵的エ藝路線和反應器的改造研究沒有大的突破，因此為了提高發酵水平和產能，需要促進菌系高產。D-核糖是ー種五碳糖，存在於所有活細胞中，通過影響代謝起作用，是生物體內遺傳物質核糖核酸(mRNA、tRNA、rRNA和5 SRNA等各種RNA)的碳水化合物組成部分，它也是若干輔酶和維生素的組成部分，在生物體內通常與磷酸共同轉運，具有十分重要的生理作用。D-核糖是ー種單糖，具備一般單糖的化學性質，極易被細胞所利用。
發明內容
本發明目的在於提供一種促進2-酮基-L-古龍酸高效生產的方法，該方法產率高，且發酵周期短，可顯著促進2-KLG的高效生產。為實現上述目的，本發明採用如下技術方案
一種促進2-酮基-L-古龍酸高效生產的方法，包括發酵培養，其以L-山梨糖為發酵培養基的碳源進行發酵培養，在發酵過程中添加O. 5 一 10% (重量體積百分比，下同)D-核糖母液，優選的添加量為5%。本發明所用D-核糖母液來自鄭州拓洋生物工程有限公司，編號為DR10701。該D-核糖母液是生產D-核糖的副產品，是ー種粘稠、紅褐色、呈半流動的物體，其主要成分為D-核糖。採用D-核糖母液作為添加物使用，可充分利用它所含的主要成分D-核糖促進生產菌產酸，價格低廉，其二次循環再利用可進ー步提升其產品附加值。菌株普通生酮古龍酸菌(KetoguLonicigenium vuLgare)和巨大芽孢桿菌(BaciLLus megaterium)採用市售普通產品即可,本發明所用菌株購自中原製藥廠，產品編號分別為TY92002和TY92003。具體的，所述發酵培養基中含有如下重量體積百分比的物質L-山梨糖8 一13. 5%、玉米漿 O. 5 - 2%、尿素 O. 02 — 2%, KH2PO4 O. 05 — I. 5%, MgSO4 · 7H20 O. 01 — I. 0%、泡敵O. 02 一 O. 08% ;滅菌前培養基的pH為6. O — 7. 5。
較好的，在發酵5 — 10小時開始連續添加D-核糖母液。發酵培養的溫度為27 — 32°C，優選為29. 5°C。發酵培養的pH為5. 0 一 8. 0，優選為7. O。可通過流加鹼來調控pH，常用的鹼有氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀等。發酵培養的通氣量為0. 2 — I. 5v/v/m，優選為0. 8 v/v/m。為避免汙染，本發明發酵方法中發酵容器的壓カ以維持在0. 02MPa以上為宜。本發明發酵培養基中，所用玉米漿中乾物質質量百分含量為40%左右。若使用其它濃度的玉米漿，可進行相應計算後確定其培養基的組成。泡敵的量只要控制培養基中的泡沫量適宜即可。在發酵過程中，比較優選的技術方案為將D-核糖母液與部分L-山梨糖配成溶液，先進行滅菌(滅菌溫度為80 — 110°C，優選100°C)，然後一起流加。 本發明中所指的質量體積百分比都是指每100毫升溶液中所含溶質的克數。具體的，本發明採用連續流加含D-核糖母液的L-山梨糖溶液的エ藝。用混菌斜面(普通生酮古龍酸菌和巨大芽孢桿菌混合菌斜面)接種搖瓶培養基中，29. 5°C、200rpm搖床振蕩培養18 — 24小吋。將混菌搖瓶種液按10%接種量接入5L種子罐，在溫度29. 5°C、轉速400rpm、通氣量0. 5v/v/m的條件下進行培養，當其產酸彡5g じ1時，將種子培養液按5 — 10%接種量通過預先滅菌並冷卻的無菌接種管道用壓カ差接入50L發酵罐中培養。初始L-山梨糖的濃度為15 — 30g じ1，發酵5 — 10小時後開始流加由D-核糖母液與補糖L-山梨糖組成的混合液(經低滅)，控制發酵液中L-山梨糖的濃度為10 — 30g じ1，當發酵液殘糖彡0. 6 g じ1時，ニ步發酵結束。本發明エ藝包括在發酵容器中培養能夠利用L-山梨糖發酵轉化2-酮基-L-古龍酸的微生物，向發酵容器中一次性或連續加入含有D-核糖母液的L-山梨糖溶液，在相應的溫度、pH、通氣量等條件下培養，發酵液達到相應的指標後從所述的容器中放出並從中回收2-酮基-L-古龍酸。本發明通過在第二步混菌發酵中連續添加D-核糖母液來促進普通生酮古龍酸菌(KetoguLonicigenium vuLgare)和巨大芽抱桿菌(BaciLLus megaterium)混合菌系的菌體生長，刺激菌體各種酶的活性，提高糖酸轉化率，從而促進2-酮基-L-古龍酸的高效生產，縮短發酵周期。該方法可顯著促進2-KLG高效生產，產率高，且發酵周期短。
具體實施例方式以下以通過優選實施例對本發明エ藝作進ー步的詳細說明，但本發明的保護範圍並不局限於此。下述各實施例中用到的相關培養基組成如下
種子/搖瓶培養基L-山梨糖2. 0%(重量體積百分比，下同)，玉米漿0. 3%，牛肉膏0. 2%，酵母膏 0. 5%，蛋白腖 I. 0%，尿素 0. 1%，KH2PO4 0. 1%，MgSO4 7H20 0. 01%, CaCO3 0. 1%，泡敵
0.05% ;滅菌前培養基 pH 6.8。118 — 120°C，滅菌 20 — 30min。發酵培養基L_山梨糖8 — 13. 5% (其中15%作為底料，85%作為補料)，玉米漿
1.0%，尿素 0. 1%, KH2PO4 0. 1%, MgSO4 *7H20 0. 04%，泡敵 0. 05% ;滅菌前培養基 pH6. 5。118 —120°C，滅菌30min。作為底料的L-山梨糖在發酵罐內90°C低滅，並與冷卻的玉米漿於38°C混合。作為補料的L-山梨糖與D-核糖母液混合後裝入補料瓶90°C低滅，D-核糖母液的添加量控制在0. 5 - 10%。
對照例I
一種促進2-酮基-L-古龍酸高效生產的方法，其包括如下步驟
I)將混菌斜面(普通生酮古龍酸菌和巨大芽孢桿菌混合菌斜面)接種搖瓶培養基中，於29. 5°C、200rpm搖床振蕩培養18小吋。將混菌搖瓶種液按10%接種量接入5L種子罐，在溫度29. 5°C、轉速400rpm、通氣量0. 5v/v/m的條件下進行培養，當其產酸量彡5g じ1時(古龍酸含量測定採用碘量法，該法為本領域的常規方法)，將種子培養液按5%的接種量通過預先滅菌並冷卻的無菌接種管道用壓カ差接入50L發酵罐中進行發酵培養。2)發酵培養在50L自控發酵罐中進行，L-山梨糖的總濃度為10%。將前述培養好的種液接入約20L發酵培養基中，初始L-山梨糖的濃度為20. 5 g じ1，發酵5h後開始流加L-山梨糖，控制流加速度以維持發酵液中L-山梨糖含量在20 g じ1左右。發酵液pH採用流加鹼的方式控制在6. 8左右，發酵38h流加L-山梨糖結束。發酵終點2-KLG濃度達到90. 15g じ1，發酵周期49h，發酵轉化率(mol/mol)達90. 22%。 對照例2
一種促進2-酮基-L-古龍酸高效生產的方法，其包括如下步驟
I)將混菌斜面(普通生酮古龍酸菌和巨大芽孢桿菌混合菌斜面)接種搖瓶培養基中，於29. 5°C>200rpm搖床振蕩培養24小吋。將混菌搖瓶種液按10%接種量接入5L種子罐，在溫度29. 5°C、轉速400rpm、通氣量0. 5v/v/m的條件下進行培養，當其產酸量彡5g じ1時，將種子培養液按10%的接種量通過預先滅菌並冷卻的無菌接種管道用壓カ差接入50L發酵罐中進行發酵培養。2)發酵培養在50L自控發酵罐中進行，L-山梨糖的總濃度為13. 5%。將前述培養好的種液接入約20L發酵培養基中，初始L-山梨糖的濃度為20. 5 g じ1，發酵5h後開始流加L-山梨糖，控制流加速度以維持發酵液中山梨糖含量在20 g じ1左右。發酵液pH採用流加鹼的方式控制在7. 0左右，發酵47h流加糖結束。發酵終點2-KLG濃度達到122. 15g じ1，發酵周期60h,發酵轉化率(mol/mol)達90. 48%。實施例I
一種促進2-酮基-L-古龍酸高效生產的方法，其包括如下步驟
1)步驟I同對照例I;
2)發酵培養在50L自控發酵罐中進行，L-山梨糖的總濃度為10%。將前述培養好的種液接入約20L發酵培養基中，初始L-山梨糖的濃度為20. 5 g じ1，D-核糖母液添加量為0.5%。將D-核糖母液與作為補料的L-山梨糖配成溶液並消好後，採用流加方式加入。於發酵5h開始流加由L-山梨糖與D-核糖母液組成的混合液，控制流加速度以維持發酵液中L-山梨糖含量在20 g じ1左右。發酵液pH採用流加鹼的方式控制在6. 8左右，發酵35h流加糖結束。發酵終點2-KLG濃度達到92. 07 g じ1，發酵周期45h，發酵轉化率(mol/mol)達 92. 15%。實施例2
一種促進2-酮基-L-古龍酸高效生產的方法，其包括如下步驟
1)步驟I同對照例2；
2)發酵培養在50L自控發酵罐中進行，L-山梨糖的總濃度為13.5%。將前述培養好的種液接入約20L發酵培養基中，初始L-山梨糖的濃度為20. 5 g じ1，D-核糖母液添加量為5%。將D-核糖母液與作為補料的L-山梨糖配成溶液並消好後，採用流加方式加入。於發酵5h開始流加由L-山梨糖與D-核糖母液組成的混合液，控制流加速度以維持發酵液中L-山梨糖含量在20 g じ1左右。發酵液pH採用流加鹼的方式控制在7.0左右，發酵42h流加糖結束。發酵終點2-KLG濃度達到131.2 g じ1，發酵周期52h，發酵轉化率(mol/mol)達 97. 18%。實施例3
一種促進2-酮基-L-古龍酸高效生產的方法，其包括如下步驟
1)步驟I同對照例2；
2)發酵培養在50L自控發酵罐中進行，L-山梨糖的總濃度為13.5%。將前述培養好的 種液接入約20L發酵培養基中，初始L-山梨糖的濃度為20. 5 g じ1，D-核糖母液添加量為10%。將D-核糖母液與作為補料的L-山梨糖配成溶液並消好後，採用流加方式加入。於發酵5h開始流加由L-山梨糖與D-核糖母液組成的混合液，控制流加速度以維持發酵液中L-山梨糖含量在20 g じ1左右。發酵液pH採用流加鹼的方式控制在7.0左右，發酵41h流加糖結束。發酵終點2-KLG濃度達到131. 15g じ1 ，發酵周期51h，發酵轉化率(mol/mol)達 97. 14%。
權利要求
1.一種促進2-酮基-L-古龍酸高效生產的方法，包括發酵培養，其特徵在於，以L-山梨糖為發酵培養基的碳源進行發酵培養，在發酵過程中添加O. 5 - 10% D-核糖母液。
2.如權利要求I所述促進2-酮基-L-古龍酸高效生產的方法，其特徵在於，所述發酵培養基中含有如下重量體積百分比的物質=L-山梨糖8 - 13. 5%、玉米漿O. 5 - 2%、尿素O.02 — 2%, KH2PO4 O. 05 — I. 5%, MgSO4 · 7H20 O. 01 — I. 0%、泡敵 O. 02 — O. 08% ;滅菌前培養基的pH為6. O - 7.5。
3.如權利要求I或2所述促進2-酮基-L-古龍酸高效生產的方法，其特徵在於，在發酵5 — 10小時開始連續添加D-核糖母液。
4.如權利要求3所述促進2-酮基-L-古龍酸高效生產的方法，其特徵在於，D-核糖母液的添加量為5%。
5.如權利要求3所述促進2-酮基-L-古龍酸高效生產的方法，其特徵在於，發酵培養的溫度為27 — 32°C。
6.如權利要求5所述促進2-酮基-L-古龍酸高效生產的方法，其特徵在於，發酵培養的溫度為29. 5°C。
7.如權利要求3所述促進2-酮基-L-古龍酸高效生產的方法，其特徵在於，發酵培養的 pH 為 5. O — 8. O。
8.如權利要求7所述促進2-酮基-L-古龍酸高效生產的方法，其特徵在於，發酵培養的pH為7. O。
9.如權利要求3所述促進2-酮基-L-古龍酸高效生產的方法，其特徵在於，發酵培養的通氣量為O. 2 — I. 5v/v/m。
10.如權利要求9所述促進2-酮基-L-古龍酸高效生產的方法，其特徵在於，發酵培養的通氣量為O. 8 v/v/m。
全文摘要
本發明屬於微生物發酵工程領域，具體涉及一種促進2-酮基-L-古龍酸高效生產的方法，其以L-山梨糖為發酵培養基的碳源進行發酵培養，通過在發酵過程中添加0.5－10%D-核糖母液來實現。該方法利用普通生酮古龍酸菌(KetoguLonicigeniumvuLgare)和巨大芽孢桿菌(BaciLLusmegaterium)混合菌係為生產菌株，通過在發酵過程中添加D-核糖母液促進菌體生長，進而促進2-酮基-L-古龍酸高效生產，縮短發酵周期。試驗結果表明，在二步發酵過程中流加5%的D-核糖母液，發酵周期從60h縮短至52h，發酵終點2-KLG濃度由122.15g·L-1提高到131.2·L-1，發酵轉化率(mol/mol)從90.48%提高到97.18%。
文檔編號C12P39/00GK102851348SQ20121031474
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月30日 優先權日2012年8月30日
發明者王敬臣, 史小利, 仲平, 崔鳳霞, 黃惠英, 閆世梁, 史立軍, 肖媛, 張生克, 宋向軍, 劉銀霞, 朱騰躍, 王新華, 秦天蒼 申請人:鄭州拓洋實業有限公司