一種重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球及其製備方法
2023-09-14 18:44:20 1
專利名稱：：一種重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球及其製備方法
技術領域：
：本發明涉及藥物以及包裹生物活性因子微球
技術領域：
，更具體地涉及一種重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球及其製備方法和用途。
背景技術：
：重組骨形態發生蛋白-2是採用基因工程重組技術開發的一種骨分化調節生長因子，具有誘導未分化的間充質細胞向軟骨細胞和成骨細胞定向分化的能力，促進成骨細胞分化成熟，參與骨和軟骨的生長發育及其重建過程，進而加速骨缺損的修復。但重組骨形態發生蛋白-2在體內半衰期短，局部使用會被組織液稀釋或蛋白酶所分解，能保持有效濃度的時間有限，不能有效發揮其骨誘導作用。所以重組骨形態發生蛋白-2的活性發揮必須需要有合適的載體，以便長時間緩慢地釋放重組骨形態發生蛋白-2，實現在一定時間內保持局部較高的濃度，利於其有效發揮誘導成骨作用。微球作為一種控/緩釋給藥體系，具有保護藥物免遭破壞、延長藥物作用時間、降低用藥量等優點，在藥物釋放領域受到很大關注。目前已有一些相關製備重組骨形態發生蛋白-2微球的報導，然而它們都或多或少存在一些明顯的缺陷，例如製備步驟複雜，控釋效果難以令人滿意，以及雜質和反應物(如殘留的單體、低聚物、催化劑、添加劑及降解產物)對產品性能有可能產生不良的影響。AntoniosGMikos等(P.QuintenRuhe，ElizabethL.Hedberg，NestorTorioPadron,PaulH.M.Spauwen，JohnA.J"ansen，AntoniosG.Mikos.rhBMP-2releasefrominjectablepoly飢-lactic-co-glycolicacid)/calcium-phosphatecementcomposites.JBoneJointSurgAm2003;85-ASu卯l3:75-81.)採用復乳法製備載重組骨形態發生蛋白-2的DL-乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)微粒。在該方法中，重組骨形態發生蛋白-2溶於磷酸緩衝鹽溶液/牛血清白蛋白溶液中，然後注入PLGA的二氯甲烷溶液中形成初乳，漩渦震蕩60秒後加入聚乙烯醇溶液形成復乳。漩渦震蕩60秒後加入PVA和異丙醇4溶液，快速攪拌1小時後加入二氯甲烷促使微粒析出，經離心凍幹後得微球。平均粒徑為17.2±1.3um，包封率為79%±8%，28天累積釋放率為18%±1.9%。胡蘊玉等人採用復乳-溶劑蒸發技術製備載重組骨形態發生蛋白-2的聚乳酸與聚乙醇酸共聚物(PLGA)微球。製備的載藥微球粒徑在100~350nm，24小時體外釋放為15.2%±0.8%，隨後呈持續緩慢釋放，28天時累積釋放率達48.6%±5.3%。金巖等(ChenFaming,ZhaoYimin，ZhangRong，JinTao,SunHaihua，WuZhifen，JinY肌Periodontalregenerationusingnovelglycidylmethacrylateddextran(Dex-GMA)/gelatinscaffoldscontainingmicrospheresloadedwithbonemorphogeneticproteins.JournalofControlledRelease.2007,121:81-90)公開了一種製備載重組骨形態發生蛋白-2葡聚糖-縮水甘油基丙烯酸酯(Dex-GMA)/聚乙二醇(PEG)微球的方法。首先製備Dex-GMA:葡聚糖在氮氣保護下於6CTC溶於DMAP/DMS0，完全溶解後冷卻到3(TC加入三乙胺催化劑，攪拌15分鐘後緩慢加入GMA，在氮氣保護下於3(TC反應72小時，採用冷的異丙醇將產物析出，過濾，異丙醇清洗數次，室溫真空乾燥得到Dex-GMA。然後製備Dex-GMA/PEG微球將PEG溶液和Dex-GMA的氯化鉀在氮氣保護下晃動10分鐘後轉移到閃爍瓶中，渦流震蕩60秒得到水-水乳液，室溫下靜置10-15分鐘後加入TEMED和KPS，在37。C孵育30分鐘，甲丙烯醯基連接到Dex-GMA鏈上。Dex-GMA/PEG微球採用復乳縮聚製得，離心清洗三次，凍幹後得微球。然而，這種方法製備的微球易粘連，平均粒徑為31.1±12.7um。重組骨形態發生蛋白-2可通過兩種方式載入，其一在加入PEG前將重組骨形態發生蛋白-2分散到Dex-GMA溶液中，包封率為87.8%±1.2%，另一是在渦流震蕩前將重組骨形態發生蛋白-2加入到PEG/Dex-GMA中，包封率為86.6%±0，8%。然而，該方法製備的微球的暴釋現象明顯，近50%，此後第l-3天每天釋放5%,第6-21天每天釋放0.2%，28天累積釋放率接近65%。馮慶玲等(NiuXufeng，FengQingling，WangMingbo,GuoXiaodong,ZhengQixin.PreparationandcharacterizationofchitosanmicrospheresforcontrolledreleaseofsyntheticoligopeptidederivedfromBMP-2.JournalofMicroencapsulation.D01:10.1080/02652040802319742)採用乳化-離子交聯法製備載重組骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球。將蛋白與殼聚糖的混合溶液滴入含表面活性劑司盤-80的液體石蠟中，室溫下機械攪拌2小時後滴入三聚磷酸鈉溶液繼續反應2小時形成微球，採用大量石油醚、異丙醇清洗，凍幹後備用。微球粒徑10-60um，平均粒徑為39nm，分布較寬，微球表面規整無裂紋，易粘連，交聯反應持續2小時以上可保持微球的球形度，包封率在75%-90%。然而，該方法製備的微球易粘連，且釋放到第7天時累積釋放率就已達62.3%，故釋放周期較短，難以達到4周釋放周期。另外，乳化法雖然是一種較為成熟的高分子微球製備方法，通常與交聯、溶劑蒸發聯合使用，但在用於蛋白包裹的過程中，大量表面活性劑、乳化劑、化學交聯劑的使用，有機溶劑的殘留和"脫油"過程均會影響微球的生物相容性和蛋白的活性。此外，該工藝相對繁瑣，乳劑穩定性不易控制，微球粒徑不均勻，分布較寬等。綜上所述，在目前現有的這些技術中，大多製備工藝複雜，並且製得的骨形態發生蛋白-2微球性能難以令人滿意。因此，本領域迫切需要開發工藝簡便、且製備的骨形態發生蛋白-2微球性能優異的方法。
發明內容本發明的目的是提供一種重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球及其製備方法，以克服現有技術存在的上述缺陷。在本發明的第一方面，提供了一種人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球，微球基質成分為殼聚糖，包裹的藥物為人骨形態發生蛋白-2，殼聚糖通過與離子交聯劑發生反應將人骨形態發生蛋白-2包裹其中，並且所述微球的平均粒徑在501000陶，包封率在75%100%，蛋白活性90%100%保持，緩釋周期達4周以上，28天累積釋放為35%90%。在另一優選例中，所述微球的平均粒徑為100-700微米。在另一優選例中，90。/。以上的所述微球的粒徑在0.9M1.1M範圍內，其中M是所述微粒的平均粒徑。更佳地，95%的所述微球的粒徑為0.9M1.1M範圍內，其中M是所述微粒的平均粒徑。在另一優選例中，所述微球中選自下組的物質的各自含量《0.05wt。/。表面活性劑、油相、和石油醚。在另一優選例中，微球中表面活性劑、油相、和石油醚的各自含量《0.005wt%，《0.001wt。/。或更低。通常，所述油相包括液體石蠟，所述的表面活性劑包括司班、吐溫。在另一優選例中，所述殼聚糖的分子量為3100KDa，更佳地為550KDa。在另一優選例中，所述的殼聚糖是脫乙醯化的殼聚糖，其脫乙醯度為50%95%。在另一優選例中，所述微球保持了95%100%的蛋白活性。在另一優選例中，人骨形態發生蛋白-2與殼聚糖按重量比為1100:300，更佳地為350:300。在另一優選例中，所述的微球是採用靜電液滴-離子交聯法製備的。在本發明的第二方面，提供了一種活性蛋白的殼聚糖微球，微球基質成分為殼聚糖，包裹的藥物為活性蛋白，殼聚糖通過與離子交聯劑發生反應將活性蛋白包裹其中，微球的平均粒徑在5Q1000陶，包封率在75%100%，蛋白活性90%100%保持，緩釋周期達4周以上，28天累積釋放為35%90%。在另一優選例中，所述殼聚糖微球的優選特徵同本發明第一方面的優選特徵。在本發明的第三方面，提供了一種製備活性蛋白的殼聚糖微球的方法，包括步驟(a)提供一含殼聚糖和所述活性蛋白的混合水溶液或水性溶液；其中，在所述混合溶液中，殼聚糖的濃度按重量體積比為0.2-6%;並且所述活性蛋白與殼聚糖的重量比1100:300;和(b)在靜電場下，將所述的混合溶液滴入凝膠浴中，從而形成活性蛋白的殼聚糖微球，其中所述的凝膠浴是含離子交聯劑的水溶液或水性溶液，其PH為27。在另一優選例中，所述的離子交眹劑選自下組三聚磷酸鈉、聚磷酸、或其組合。在另一優選例中，所述的凝膠浴的溶劑為水性溶劑，並且所述的水性溶劑是水與醇(如乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇或其組合)構成的混合溶劑。在另一優選例中，按混合溶劑的總體積計算，醇的用量為5-50%。在另一優選例中，步驟(a)的混合溶液中含有0.01-1.5M酸，並且在所述濃度的酸存在下對活性蛋白的活性無不利影響。在另一優選例中，所述的酸為有機酸，更佳地所述的有機酸選自甲酸、乙酸、擰檬酸、乳酸或其組合。在另一優選例中，步驟(a)還包括將殼聚糖溶於稀酸溶液中，並將人骨形態發生蛋白-2溶於其中，從而形成混合溶液。更佳地，配製殼聚糖酸溶液所用的酸為甲酸、乙酸、檸檬酸、乳酸或其組合。在另一優選例中，所述的靜電場是輸出電壓直流100-iooov(較佳地100-500V)的靜電場。在另一優選例中，殼聚糖的分子量在550KDa，脫乙醯度在50%95%。在另一優選例中，配製殼聚糖酸溶液所用的酸濃度按重量比約為0.1%8%，更佳地約為0.2%5%。對於甲酸、乙酸等液態酸，也可使用體積比。通常，配製殼聚糖酸溶液所用的液態酸(如甲酸、或乙酸)濃度按體積比約為0.2%5%。在另一優選例中，在所述混合溶液中，殼聚糖的濃度按重量體積比為0.5%-50/0。在另一優選例中，在步驟(a)的所述混合溶液中，骨形態發生蛋白-2與殼聚糖按重量比為190:300。在另一優選例中，凝膠浴含有三聚磷酸鈉或聚磷酸或其組合作為離子交聯劑，並且溶劑是水與醇(如乙醇或丙醇)的混合溶劑。更佳地，三聚磷酸鈉或聚磷酸的濃度按重量體積比為0.5-10%;乙醇或丙醇的濃度按體積比為5-50%。在另一優選例中，凝膠浴的pH為26.5。在另一優選例中，所述的活性蛋白是骨形態發生蛋白-2。在另一優選例中，所述的活性蛋白是重組的人骨形態發生蛋白-2。在本發明的第四方面，提供了一種藥物組合物，它含有藥學上可接受的載體以及本發明第一方面中所述的人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球或第二方面中所述的活性蛋白的殼聚糖微球。應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。例如，就殼聚糖的分子量而言，範圍3100KDa的上限100KDa可以與另一優選範圍550KDa的下限5KDa進行組合，從而構成範圍5-100KDa。限於篇幅，在此不再--累述。圖1顯示了在本發明一個實例中，重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球製備過程示意圖。圖2顯示了本發明的微球整體形態。圖3顯示了本發明的微球表面形態。圖4顯示了本發明重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球異位成骨活性。具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，首次意外地發現將殼聚糖和骨形態發生蛋白-2的混合溶液，在高壓靜電條件下，滴加於三聚磷酸鈉或聚磷酸的水溶液中，可以製得外觀圓整，均勻度好，顆粒規則無粘連的微球。凍幹後的微球不粘連，再分散性好，且控釋性能優異，包封率為75%100%，蛋白活性90%100%保持，緩釋周期達4周以上，28天累積釋放35%90%。在此基礎上，本發明人完成了本發明。本發明的微球製備方法工藝簡單，生產成本低，易於實施，反應條件溫和，無須添加乳化劑、化學交聯劑，利於重組人骨形態發生蛋白-2的活性保持，通過調整殼聚糖分子量、殼聚糖脫乙醯度、殼聚糖濃度、重組人骨形態發生蛋白-2與殼聚糖重量比、凝膠浴濃度等工藝參數可調控微球粒徑和包封率。活性成分如本文所用，術語"活性成分"狹義上指骨形態發生蛋白-2或其活性衍生物或活性片段。廣義上，術語"活性成分"指各種蛋白或多肽類的活性蛋白，例如BMP-2，免疫球蛋白等。適用於本發明的骨形態發生蛋白-2沒有特別限制，可以是人的骨形態發生蛋白-2或其他哺乳動物的骨形態發生蛋白-2。骨形態發生蛋白-2可以是天然的，也可以是重組的。當然，優選的骨形態發生蛋白-2是人的骨形態發生蛋白-2，尤其是重組的人骨形態發生蛋白-2。殼聚糖殼聚糖是由甲殼類動物提取的氨基葡萄糖和乙醯氨基葡萄糖組成的多聚糖。殼聚糖是甲殼素脫乙醯基的產物，作為唯一的鹼性氨基多糖，具有來源廣泛，成本低廉等優點。此外，殼聚糖具有良好的生物黏附性、生物相容性、安全性，且降解產物無毒、無免疫原性、無致癌性並具有促進藥物吸收的作用。另外，殼聚糖是一種線性長鏈高聚物分子，含有大量可以與其他細胞分子形成氫鍵的-0H和-則2基團，當環境pH小於其離子解離常數(6.5)時，-NH2質子化形成-NH/使分子帶正電。上述分子特性使殼聚糖成為優良的生物粘附材料，可以有效攜帶骨形態發生蛋白-2等活性成分。在本發明中，所使用的殼聚糖沒有特別限制，通常，殼聚糖分子量為3100KDa，較佳地550KDa。脫乙醯度通常為40-99%，較佳地為50%95%。可否在將殼聚糖與其他物質(尤其是一些可生物降解的材料)混合，構成包封材料。骨形態發生蛋白-2的殼聚糖微球複合物本發明提供了一種人骨形態發生蛋白-2的殼聚糖微球，其中微球基質為殼聚糖，包裹的藥物為重組人骨形態發生蛋白-2。如本文所用，術語"本發明微球"和"本發明的骨形態發生蛋白-2的殼聚糖微球"可互換使用，都指由骨形態發生蛋白-2和殼聚糖為原料，通過靜電液滴-離子交聯法所製備的微球。在本發明的微球中，殼聚糖直鏈上的NH3+通過與離子交聯劑上P30,。5一發生分子間離子交聯反應形成緊密地"梯"狀結構將重組人骨形態發生蛋白-2包裹其中。本發明微球外觀圓整，均勻度好，顆粒規則無粘連，平均粒徑為50900Wn，包封率為75%100%，蛋白活性95%100%保持。凍幹後的微球不粘連(圖2)'，再分散性良好，表面多皺褶(圖3)，緩釋周期達4周以上，28天累積釋放35%90%。藥物組合物本發明還包括含有骨形態發生蛋白-2的殼聚糖微球的藥物組合物。所述的藥物組合物含有藥學上可接受的載體以及本發明上述的骨形態發生蛋白-2的殼聚糖微球。本發明還包括含有活性蛋白的殼聚糖微球的藥物組合物。所述的藥物組合物含有藥學上可接受的載體以及本發明上述的活性蛋白的殼聚糖微球。本發明的微球可單獨直接用於疾病治療，還可與其他治療劑聯用，例如與其他促進骨生成的化合物一起聯用。當本發明的微球用於治療時，它可與一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑混合，如溶劑、稀釋劑等，從而形成藥物組合物。通常，本發明的藥物組合物包括以下劑型如下口服給藥片劑、膠囊、可分散的粉末、顆粒或懸浮液(混懸劑)(含有如約0.05-5%懸浮劑(助溶劑))、糖漿(含有如約10_50%糖)、和酏劑(含有約20-50%乙醇)，或者以無菌可注射溶液或混懸劑形式(在等滲介質中含有約0.05-5%助溶劑)進行非腸胃給藥。這些藥物製劑通常可含有與載體混合的約0.5-99.5wt%，較佳地2.5-90wt%，更佳地5y。-60wty。(重量)的活性成分(本發明的微球)，按組合物的總重量計。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)肌內、口服或局部給藥。一種優選的給藥方式是將本發明微球與修補骨損傷的材料混合，製成與骨缺損處相吻合的形狀，從而用於促進在骨損傷處新骨的形成。所用的活性成分的有效劑量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度而變化。通常，當本發明微球每天以約0.05-100mg/kg動物體重(較佳地0.1-50mg/kg體重，更佳地O.5-20mg/kg體重給藥)的劑量給予時，能得到令人滿意的效果。製備方法
技術領域：
：本發明還提供了一種製備本發明微球的方法。簡而言之，本發明方法可以稱為靜電液滴-離子交聯法。參見圖1，製備本發明微球的靜電液滴-離子交聯法的基本製備過程如下首先，提供含殼聚糖和骨形態發生蛋白-2的混合溶液。在所述混合溶液中，殼聚糖的濃度按重量體積比為0.2-6%，較佳地為0.5%-5%。在所述混合溶液中，骨形態發生蛋白-2與殼聚糖的重量比通常為l100:300，較佳地為190:300，更佳地為350:300。所述混合溶液的溶劑為水或水性溶劑。如本文所用，"水性溶劑"指由水和其他溶劑(如醇溶劑)構成的混合溶劑，其中在混合溶劑中水佔50wt。/。以上。一類優選的水性溶劑是水與醇(如乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇或其組合)構成的混合溶劑。然後，在高壓靜電作用下，將混合溶液滴入凝膠浴中，從而形成人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球。在本發明中，高壓靜電場通常為輸出電壓直流100-1000V的靜電場，較佳地為輸出電壓直流100-500V的靜電場。可採用市售的設備來產生所需的高壓靜電場。將混合溶液滴入凝膠浴的速度沒有特別限制，通常可以是l-500ml/h，較佳地為5-200ml/h。在本發明中，凝膠浴是含離子交聯劑的水溶液或水性溶液，其pH為27(較佳地pH3-6.5，更佳地pH4-6)。離子交聯劑宜為三聚磯酸鈉、聚磷酸、或其組合。溶劑為水或水性溶劑。在本發明中，優選的水性溶劑是水與醇(如乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇或其組合)構成的混合溶劑。其中，按混合溶劑的總體積計算，醇的用量為5-50%。本發明的結果表明，在凝膠浴中添加醇有利於微球分散，不產生粘連。本發明的凝膠浴無毒性，可溶於水，易清洗，不易殘留。在本發明的一個實例中，首先將殼聚糖溶於稀酸溶液中，所用的殼聚糖分子量在550KDa，脫乙醯度在50%95%，所用的酸為甲酸、乙酸、檸檬酸、或乳酸，殼聚糖的溶液按重量體積比為0.5%-5%，然後將重組人骨形態發生蛋白-2按其與殼聚糖重量比為1100:300溶於殼聚糖溶液中，在高壓靜電作用(輸出電壓直流100-400V)下，將混合液滴入凝膠浴中，通過離子交聯製備出重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球，然後用去離子水清洗微球，冷凍乾燥後保存待用。本發明的主要優點包括(1)微球粒徑分布均勻，可在50900Wn之間調控，分散性和球形度良好；(2)凝膠浴pH為27，殼聚糖直接與其接觸，直鏈上的NH/通過與離子交聯劑上PA。5—發生分子間離子交聯反應形成"梯"狀結構將重組人骨形態發生蛋白-2緊密包裹其中，交聯反應迅速，包封率可達75%100%;(3)反應條件溫和，無剪切震蕩，無須添加乳化劑、化學交聯劑，利於保持重組人骨形態發生蛋白-2的活性，蛋白活性95%100%保持；(4)凍幹後微球表面多皺褶，增大比表面積，利於被緊密包裹在微球內部的重組人骨形態發生蛋白-2的釋放，28天累積釋放35%90%，緩釋周期可達4周以上；(5)製備工藝簡單，生產成本低，易於實施，可以通過調整殼聚糖分子量、殼聚糖脫乙醯度、殼聚糖濃度、重組人骨形態發生蛋白-2與殼聚糖重量比、凝膠浴濃度等工藝參數達到對微球粒徑、包封率的可控。(6)與現有技術中表面活性劑、油相、和石油醚等物質殘留量高相比，本發明製備工藝中所用的原料如乙酸、三聚磷酸鈉、乙醇等，均溶於水，在後處理清洗過程中可去除，基本不殘留。解決了傳統乳化法製備載重組人骨形態發生蛋白-2微球不均勻、分散性差，引入表面活性劑、乳化劑、有機溶劑或化學交聯劑影響微球的生物相容性和蛋白的活性等問題。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則份數和百分比按重量計。通用方法(1)平均粒徑顯微鏡下隨機挑取2-3組微球，每組不少於20個微球，讀取微球的粒徑，計算平均值。(2)包封率採用Bradford蛋白檢測法，按以下公式計算包封率=(原料液中蛋白質含量-凝膠浴中蛋白質含量)/原料中蛋白質含量X100(3)累積釋放率累積釋放率=蛋白累積釋放量/微球中蛋白含量X100%(4)蛋白活性率將包裹在殼聚糖微球中的重組人骨形態發生蛋白-2破囊後提取出。按提取出的人骨形態發生蛋白-2蛋白，取等量重組人骨形態發生蛋白-2為對照，採用常規小鼠異位成骨技術及甲基麝香草酚藍比色法檢測活性，按下式計算蛋白活性保持率。蛋白活性率=提取蛋白的活性/對照蛋白的活性X100%實施例1:將分子量為5KDa、脫乙醯度為95%的殼聚糖溶於2%乙酸的水溶液中，配製成重量體積比為1%的溶液，按照重組人骨形態發生蛋白-2/殼聚糖重量比為3:100將重組人骨形態發生蛋白-2溶於其中，混合液在高壓靜電作用(輸出電壓直流350V)下滴入pH為4的凝膠浴中，製備成重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球。所述凝膠浴中三聚磷酸鈉的濃度為2%，乙醇的濃度為10%,且溶劑為水。去離子水清洗微球，冷凍乾燥後保存待用。微球外觀圓整，均勻度好，顆粒規則無粘連。凍幹後的微球不粘連，再分散性良好，表面多鮍褶(圖2和圖3)。經測試，平均粒徑為100Wii，包封率為95%,蛋白活性100%保持，緩釋周期達4周以上，28天時累積釋放85.5%±5.8%。將昆明種小白鼠按體重的3%進行水合氯醛腹腔注射麻醉後固定於手術板上，取右側的大腿剃毛消毒，切開約1cm的皮膚切口，鈍性分離大腿肌袋，用手術鉗擴充出肌袋，植入含如上製備的含100微克rhBMP-2的殼聚糖微球的樣品後，縫合肌膜和皮膚。手術後放入飼養盒中，進行正常的潔淨級標準飼料餵養。4周致死動物，迅速取出植入材料及其周圍軟組織。異位成骨活性試驗測試表明，4周後在肌袋內形成新鮮骨的平均鮮重為180毫克。證實所製備的重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球具有好的誘導成骨活性(圖4)。實施例2:將分子量為5KDa、脫乙醯度為95%的殼聚糖溶於5%乙酸水溶液中，配製成重量體積比為5%的溶液，按照重組人骨形態發生蛋白-2/殼聚糖重量比為1:10將重組人骨形態發生蛋白-2溶於其中，混合液在高壓靜電作用(輸出電壓直流150V)下滴入pH為4的凝膠浴中製備成重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球。凝膠浴中三聚磷酸鈉的濃度為2%，乙醇的濃度為30%，且溶劑為水。去離子水清洗微球，冷凍乾燥後保存待用。經測試，微球平均粒徑為760Wn，包封率為80%，蛋白活性95%保持，緩釋周期達4周以上，28天時累積釋放52.9%±3.8°/0。樣品經小鼠肌袋內植入異位成骨活性試驗測試表明，4周後含100微克rhBMP-2的微球的樣品在肌袋內形成新鮮骨的平均鮮重為140毫克。證實所製備的重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球具有好的誘導成骨活性。實施例3:將分子量為50KDa、脫乙醯度為50%的殼聚糖溶於0.2%乙酸的水溶液中，配製成重量體積比為0.2%的溶液，按照重組人骨形態發生蛋白-2/殼聚糖重量比為5:100將重組人骨形態發生蛋白-2溶於其中，混合液在高壓靜電作用(輸出電壓直流300V)下滴入pH為5的凝膠浴中製備成重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球。凝膠浴中三聚磷酸鈉的濃度為2%，乙醇的濃度為30%，且溶劑為水。去離子水清洗微球，冷凍乾燥後保存待用。經測試，微球平均粒徑為250陶，包封率為90%，蛋白活性98%保持，緩釋周期達4周以上，28天時累積釋放37.6%±5.7%。樣品經小鼠肌袋內植入異位成骨活性試驗測試表明，4周後含100微克rh麗P-2的微球的樣品在肌袋內形成新鮮骨的平均鮮重為110毫克。證實所製備的重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球具有好的誘導成骨活性。實施例4:將分子量為30KDa、脫乙醯度為95%的殼聚糖溶於2%乙酸的水溶液中，配製成重量體積比為2%的溶液，按照重組人骨形態發生蛋白-2/殼聚糖重量比為1:100將重組人骨形態發生蛋白-2溶於其中，混合液在高壓靜電作用(輸出電壓直流220V)下滴入pH為4的凝膠浴中製備成重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球。凝膠浴中三聚磷酸鈉的濃度為3%，乙醇的濃度為30%，且溶劑為水。去離子水清洗微球，冷凍乾燥後保存待用。經測試，微球平均粒徑為450um，包封率為100%，蛋白活性100%保持，緩釋周期達4周以上，28天時累積釋放48.6%±4.3%。樣品經小鼠肌袋內植入異位成骨活性試驗測試表明，4周後含100微克rhBMP-2的微球的樣品在肌袋內形成新鮮骨的平均鮮重為130毫克。證實所製備的重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球具有好的誘導成骨活性。實施例5:將分子量為30KDa、脫乙醯度為95%的殼聚糖溶於2%乙酸溶液中，配製成重量體積比為2%的溶液，按照重組人骨形態發生蛋白-2/殼聚糖重量比為30:100將重組人骨形態發生蛋白-2溶於其中，混合液在高壓靜電作用(輸出電壓直流250V)下滴入pH為6.5的凝膠浴中製備成重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球。凝膠浴中三聚磷酸鈉的濃度為3%，乙醇的濃度為30%。去離子水清洗微球，冷凍乾燥後保存待用。經測試，微球平均粒徑為520ym，包封率為75%,蛋白活性95%保持，緩釋周期達4周以上，28天時累積釋放70.3%±8.3%。樣品經小鼠肌袋內植入異位成骨活性試驗測試表明，4周後含100微克rh函P-2的微球的樣品在肌袋內形成新鮮骨的平均鮮重為160毫克。證實所製備的重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球具有好的誘導成骨活性。實施例6-18重複實施例1的製備過程，不同點僅在於分別用以下條件替換實施例1中的相應條件。在實施例6中，在凝膠浴中，用10%異丙醇替換10%乙醇。在實施例7中，在凝膠浴中，用10%異丙醇+10%乙醇替換10%乙醇。在實施例8中，用2%的檸檬酸溶液替換2%乙酸溶液。在實施例9中，用1%的甲酸溶液替換2%乙酸溶液。在實施例10中，用分子量為15KDa、脫乙醯度為70%的殼聚糖替換分子量為5KDa、脫乙醯度為95%的殼聚糖。在實施例ll中，人骨形態發生蛋白-2/殼聚糖重量比為1:300。在實施例12中，人骨形態發生蛋白-2/殼聚糖重量比為80:300。在實施例13中，高壓靜電條件為輸出電壓直流480V。在實施例14中，高壓靜電條件為輸出電壓直流200V。在實施例15中，凝膠浴中三聚磷酸鈉的濃度為6%。在實施例16中，凝膠浴中三聚磷酸鈉的濃度為10%。含有1%聚磷酸。在實施例18中，凝膠浴中三聚磷酸鈉的濃度為2%並且含有3%聚磷酸。結果同樣製備了骨形態發生蛋白-2的殼聚糖微球。經測試，這些微球平均粒徑為70-800微米。包封率為75-95%，蛋白活性保持率約95%，緩釋周期達4周以上。另外，實施例1-18的結果提示，骨形態發生蛋白-2和殼聚糖的混合溶液中殼聚糖的濃度越大，則微球的平均粒徑越大。高壓靜電的電壓值越高，平均粒徑約小。骨形態發生蛋白-2和殼聚糖的混合溶液中殼聚糖重量比例越大，凝膠浴中離子交聯劑濃度越大，凝膠浴pH越小，包封率越高。另外，本發明微球大小非常均一，其粒徑發布窄，幾乎90%以上(如100%)的微球粒徑在0.9M1.1M範圍內，其中M是微粒的平均粒徑(如下表所示)。tableseeoriginaldocumentpage17tableseeoriginaldocumentpage18實施例19實施例19與實施例4基本相同，不同點在於使用不含醇的凝膠浴。方法如下將分子量為30KDa、脫乙醯度為95%的殼聚糖溶於2%乙酸溶液中，配製成重量體積比為2%的溶液，按照重組人骨形態發生蛋白-2/殼聚糖重量比為1:100將重組人骨形態發生蛋白-2溶於其中，混合液在高壓靜電作用下滴入pH為4的凝膠浴中製備成重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球。凝膠浴為三聚磷酸鈉的水溶液，濃度為3%。去離子水清洗微球，冷凍乾燥後保存待用。經測試，微球較易分散，平均粒徑為470um，包封率為100%,蛋白活性100%保持，緩釋周期達4周以上，28天時累積釋放50.4%±3.6%。樣品經小鼠肌袋內植入異位成骨活性試驗測試表明，4周後含100微克rhBMP-2的微球的樣品在肌袋內形成新鮮骨的平均鮮重為134毫克。證實所製備的重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球具有好的誘導成骨活性。與實施例19(不含醇溶劑的凝膠浴出)相比，添加一定濃度的醇溶劑(如實施例4)有利於微球分散，不產生粘連，對粒徑、包封率等影響不顯著。實施例20重複實施例1的製備過程，不同點僅在於用免疫球蛋白G蛋白替換重組的人骨形態發生蛋白-2。結果，製得了免疫球蛋白G的殼聚糖微球。經測試，微球平均粒徑約為120微米，包封率為75%。這表明，本發明的靜電液滴-離子交聯法同樣可適用於包封其他活性蛋白。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。權利要求1、一種人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球，其特徵在於，微球基質成分為殼聚糖，包裹的藥物為人骨形態發生蛋白-2，殼聚糖通過與離子交聯劑發生反應將人骨形態發生蛋白-2包裹其中，並且所述微球的平均粒徑在50～1000μm，包封率在75％～100％，蛋白活性90％～100％保持，緩釋周期達4周以上，28天累積釋放為35％～90％。2、如權利要求1所述的人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球，其特徵在於，90%以上的所述微球的粒徑在0.9ML1M範圍內，其中M是所述微粒的平均粒徑。3、如權利要求1所述的人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球，其特徵在於，所述微球中選自下組的物質的各自含量《0.05wt%:表面活性劑、油相、和石油醚。4、如權利要求1所述的人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球，其特徵在於，所述的微球是採用靜電液滴-離子交聯法製備的。5、一種製備活性蛋白的殼聚糖微球的方法，其特徵在於，包括步驟(a)提供一含殼聚糖和所述活性蛋白的混合水溶液或水性溶液；其中，在所述混合溶液中，殼聚糖的濃度按重量體積比為0.2-6%;並且所述活性蛋白與殼聚糖的重量比1100:300;和(b)在靜電場下，將所述的混合溶液滴入凝膠浴中，從而形成活性蛋白的殼聚糖微球，其中所述的凝膠浴是含離子交聯劑的水溶液或水性溶液，其PH為27。6、如權利要求5所述的方法，其特徵在於，步驟(a)的混合溶液中含有0.01-1.5M酸，並且在所述濃度的酸存在下對活性蛋白的活性無不利影響。7、如權利要求5所述的方法，其特徵在於，配製殼聚糖酸溶液所用的酸濃度按重量比為0.1%8%。8、如權利要求5所述的方法，其特徵在於，在所述混合溶液中，殼聚糖的濃度按重量體積比為0.5%-5%。9、如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述的活性蛋白是骨形態發生蛋白-2。10.—種藥物組合物，其特徵在於，它含有藥學上可接受的載體以及權利要求1所述的人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球。全文摘要本發明涉及一種重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球及其製備方法。本發明的微球基質成分為殼聚糖，包裹的藥物為重組骨形態發生蛋白-2，平均粒徑為50-900μm，包封率可達75％～100％，蛋白活性保持率高，緩釋周期長。本發明微球外觀圓整，均勻度好，顆粒規則無粘連，凍幹後的微球不粘連，再分散性良好。本發明還提供了製備所述微球的方法，該方法工藝簡單，生產成本低，易於實施，反應條件溫和，無須添加乳化劑、化學交聯劑。文檔編號A61K9/16GK101637454SQ20091005128公開日2010年2月3日申請日期2009年5月14日優先權日2009年5月14日發明者劉昌勝,馬莉華申請人:華東理工大學