一種檢測鴨黃病毒病卵黃抗體的間接elisa方法
2023-09-14 18:28:55
專利名稱：一種檢測鴨黃病毒病卵黃抗體的間接elisa方法
技術領域：
本發明涉及用於一種檢測鴨黃病毒病卵黃抗體的間接ELISA方法，屬於動物傳染學病領域。
背景技術：
自2010年4月以來，一種由黃病毒引起的種(蛋)鴨產蛋驟降的新發疫病在我國江蘇、浙江、山東、河南、福建等地相繼發生，可致使產蛋鴨採食量迅速下降、產蛋率急速下降、 甚至停產及不同程度死亡。產蛋率高的鴨群患病後4飛天左右從產蛋高峰的809Γ95%迅速下降至209Γ30%，嚴重的可在發病後7天左右出現停產；剛開產種(蛋)鴨產蛋率上升緩慢或減蛋、長時間低產蛋率或無產蛋高峰出現。不同地區、不同品種鴨群發病率高低不一，群內發病率幾乎100%，病死率為(Γ12%。其臨床症狀除了產蛋驟降外，很重要的一個特徵是發生鴨卵巢出血的病鴨伴有搖頭扭頸等神經症狀，剖檢病變主要為卵泡膜出血、充血，卵泡變形萎縮等，部分出現腦膜出血。研究人員從表現產蛋驟降的病死種鴨中採集其卵巢、肝臟、腦等進行病毒分離，經對所分離的病毒進行形態學觀察、理化特性測定、RT-PCR檢測及序列分析明確該病病原為黃病毒科(/^^iririifee)的一個新成員[1_3]。明確病因是為了更好地做好防治工作。當務之急，做好鴨黃病毒感染的診斷和免疫防制工作是擺在科研工作者、基層獸醫和蛋鴨養殖戶面前的一件大事，建立鴨黃病毒抗體檢測方法，對該病的主動免疫效果評價、流行病學調查極有意義，而ELISA方法因其檢測通量大、結果確切、靈敏度高而倍受歡迎。但該病主要發生在產蛋鴨，若進行血清抗體檢測， 在採血過程中必然會對產蛋鴨產生應激，影響其產蛋率。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測鴨黃病毒病卵黃抗體的間接ELISA方法，該方法通過對鴨所產蛋的卵黃提取抗體，進行免疫檢測，可對鴨黃病毒病進行快速診斷，方法簡便易行，用以減少損失、提高養殖效益。本發明採取的技術方案如下
以鴨黃病毒作為包被抗原，對鴨所產蛋的卵黃提取抗體，建立了檢測鴨黃病毒病卵黃抗體的間接ELISA方法。所述鴨黃病毒為鴨黃病毒(Duck fla ν virus) WR株，保藏登記號為CGMCC NO. 4906。所述抗原先經過濃縮，包括如下步驟收集含有鴨黃病毒的胚尿囊液後於4°C、 8000 r/min離心30 min,上清於45000 r/min離心4°C離心2 h,棄上清後沉澱用滅菌PBS 重懸，得到病毒濃縮液，儲存於-70°C。所述病毒濃縮液經進一步純化，將病毒濃縮液通過蔗糖梯度離心純化後經超速離心加以濃縮獲得。進一步純化的步驟為製備10%、20%、30%、40%和50%等5個梯度的蔗糖平衡液，
3將病毒濃縮液加在10%蔗糖液上層，於4°C、40000 r/min水平離心3 h ；結果在10%_20%、 30%-40%、40%-50%間發現有病毒帶，收集各帶後4°C下45000 r/min離心2 h，棄上清後沉澱用滅菌PBS重懸，並用RT-PCR方法檢測各帶的病毒含量，以30%-40%帶病毒量最大，得到病毒純化液，儲存於一 70°C為抗原備用。 所述間接ELISA方法包括包被抗原、封閉、加樣、加酶標二抗、顯色、終止。
根據權利要求6所述的檢測鴨黃病毒病卵黃抗體的間接ELISA方法，其特徵在於 所述間接ELISA方法的最佳工作條件為抗原稀釋3200倍，樣品稀釋40倍，酶標二抗稀釋濃度為1:3200，陰陽臨界值為0. 45。本發明的顯著優點建立的檢測鴨黃病毒病卵黃抗體的間接ELISA方法，該方法可以對目前我國流行的鴨黃病毒病進行有效的診斷，並可開展大規模的流行病學調查，為鴨黃病毒病的防治和流行情況的掌握提供一種快速、簡便的檢測方法。
具體實施例方式實施例1
本發明的鴨黃病毒抗原，是通過如下方式獲得的 (1)抗原的濃縮
用半番胚大量培養本研究室分離鑑定的一株具有良好免疫活性的鴨黃病毒WR 株(菌株的保藏號CGMCC No. 4906,來源於申請人申請的一項發明專利申請號為 201110143407. 6，一種鴨黃病毒及其滅活疫苗)，收集含有病毒的胚尿囊液後於4°C、8000 r/min離心30 min，上清於45000 r/min離心4°C離心2 h，棄上清後沉澱用滅菌PBS重懸， 得到病毒濃縮液，儲存於-70°C。(2)抗原的純化
抗原的純化是通過蔗糖梯度離心及超速離心加以濃縮獲得。製備10%、20%、30%、40%和 50%等5個梯度的蔗糖平衡液，在10%蔗糖液上加上病毒濃縮液，於4°C、40000 r/min水平離心3 h後。在10%-20%、30%-40%、40%-50%間發現有病毒帶，收集各帶後4°C下45000 r/ min離心2 h，棄上清後沉澱用滅菌PBS重懸。並用RT-PCR方法檢測各帶的病毒含量，以 30%-40%帶病毒量最大，得到病毒純化液，儲存於一 70°C為抗原備用。實施例2
本發明的鴨黃病毒病陽性卵黃抗體和陰性卵黃抗體，是通過如下方式獲得的 (1) 陽性卵黃抗體
WR株病毒純化液(實施例1步驟(2)得到的純化液)經甲醛滅活後與弗氏完全佐劑按 1 1比例進行乳化，免疫成年開產蛋鴨，間隔15 d後再次免疫，三免後收集鴨蛋，吸取0.5 ml卵黃與1. 5 ml滅菌PBS混勻後加入2 ml氯仿，旋渦振蕩混勻4°C過夜，於4°C、8000 r/ min離心5 min後收集上清，備用。(2) 陰性卵黃抗體
採集沒有感染鴨黃病毒或未免疫過鴨黃病毒疫苗的健康鴨所產的鴨蛋，吸取0. 5 ml卵黃與1.5 ml滅菌PBS混勻後加入2 ml氯仿，旋渦振蕩混勻4°C過夜，於4°C、8000 r/min離心5 min後收集上清，備用。實施例3本發明的鴨黃病毒卵黃抗體間接ELISA檢測方法的最適抗原抗體濃度、酶標二抗體濃度及臨界值，是通過如下方式獲得的 (1) 最適抗原抗體濃度
以矩陣法測定。以純化的抗原(病毒純化液)用包被液按1 100、1 200、1 400、1 800、
1 1600、1 3200、1 6400、1 12800 和 1 25600 進行稀釋，包被於 96 孔 Costar 酶標板，4°C過夜後，以PBST洗滌3次後用5%脫脂牛奶37°C封閉2 h，以PBST洗滌3次，陰、陽性卵黃抗體以PBS稀釋10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍和640倍，每個陰陽性卵黃抗體滴度重複4次，與包被抗原進行作用2 h，以PBST洗滌3次後以1000倍的酶標二抗進行反應1 h後洗滌3次，TMB顯色15 min後以2 mol/L H2S04終止反應，並測定每孔的0D450值。由陰陽性卵黃抗體的每個滴度平均值的比值(P/N值)測定得到，在抗原稀釋3200倍，卵黃抗體稀釋40倍時，P/N值最高，高達5.5，且陽性卵黃抗體的00450值為1.075 1)，所以抗原抗體最佳稀釋濃度為抗原稀釋3200倍，卵黃抗體稀釋40倍。(2)酶標二抗體濃度
以純化的抗原用包被液按1:3200進行稀釋，包被於96孔Costar酶標板，4°C過夜後， 以PBST洗滌3次後用5%脫脂牛奶37°C封閉2 h，以PBST洗滌3次，陰陽性卵黃抗體以PBS 稀釋40倍，每個陰陽性卵黃抗體滴度重複4次，與包被抗原進行作用2 h，以PBST洗滌3 次後用酶標二抗(1 200、1 400、1 800、1 1600、1 3200、1 6400、1 12800 和 1 25600 稀釋) 進行反應1 h後洗滌3次，TMB顯色15 min後以2 mol/L H2S04終止反應，並測定每孔的 0D450值。由陰陽性卵黃抗體的每個滴度平均值的比值(P/N值)測定得到，在抗原酶標二抗稀釋(1:1600) (1:3200)時，P/N值最高，分別達7禾口 5. 16。同時1:3200的OD值為1. 12 1)，故酶標二抗最佳稀釋濃度為1:3200。(3) 臨界值
通過測定30份陰性卵黃抗體獲得。以純化的抗原用包被液按1:3200進行稀釋，包被於96孔Costar酶標板，4 °C過夜後，以PBST洗滌3次後用5%脫脂牛奶37 °C 封閉2 h，以PBST洗滌3次，陰性卵黃抗體以PBS稀釋40倍，與包被抗原進行作用
2h，以PBST洗滌3次後用酶標二抗(1:3200稀釋)進行反應1 h後洗滌3次，TMB 顯色15 min後以2 mol/L H2S04終止反應，並測定每孔的0D450值。求得平均值 X 為 0. 2514，標準差SD = O. 0646四，所以陰陽臨界值=1" + 350 = 0. 2514 + 3X0. 064629
=0. 447 ^ 0. 45，因此判定樣品OD值如果高於臨界值即為陽性，低於臨界值即為陰性。(4)特異性檢驗
以免疫過H9亞型禽流感疫苗、H5亞型禽流感疫苗、減蛋症候群疫苗、鴨瘟疫苗、鴨大腸桿菌病疫苗鴨群所產鴨蛋的卵黃抗體進行特異性檢驗。選取免疫過H9亞型禽流感疫苗、H5 亞型禽流感疫苗、減蛋症候群疫苗、鴨瘟疫苗、鴨大腸桿菌疫苗的鴨群所產鴨蛋各10枚，提取卵黃抗體後備用；以純化的抗原(實施例1步驟(2)得到的純化液)用包被液按1:3200進行稀釋，包被於96孔Costar酶標板，4°C過夜後，以PBST洗滌3次後用5%脫脂牛奶37°C封閉2 h，以PBST洗滌3次，將抗H9亞型禽流感、H5亞型禽流感、減蛋症候群、鴨瘟、鴨大腸桿菌病卵黃抗體、陽性卵黃抗體、陰性卵黃抗體以PBS稀釋40倍，與包被抗原進行作用2 h，以 PBST洗滌3次後用酶標二抗(1:3200稀釋)進行反應1 h後洗滌3次，TMB顯色15 min後以2 mol/L H2S04終止反應，並測定每孔的0D450值。結果免疫過H9亞型禽流感疫苗、H5亞型禽流感疫苗、減蛋症候群疫苗、鴨瘟疫苗、鴨大腸桿菌病疫苗的鴨群所產鴨蛋提取的卵黃抗體和陰性卵黃抗體的0D450值均低於0. 45，而陽性卵黃抗體0D450值高於0. 45。(5)重複性檢驗
重複3次對陰、陽性卵黃抗體的檢測。以純化的抗原用包被液按1:3200進行稀釋，包被於96孔Costar酶標板，4°C過夜後，以PBST洗滌3次後用5%脫脂牛奶37°C封閉2 h，以 PBST洗滌3次，陽性卵黃抗體和陰性卵黃抗體以PBS稀釋40倍，與包被抗原進行作用2 h， 以PBST洗滌3次後用酶標二抗(1:3200稀釋)進行反應1 h後洗滌3次，TMB顯色15 min 後以2 mol/LH2S04終止反應，並測定每孔的0D450值。結果陰性卵黃抗體的0D450值均低於0. 45，而陽性卵黃抗體0D450值均高於0. 45。(6)對臨床樣品的檢測實例
某蛋鴨場飼養2000隻，按常規免疫程序接種了 H5，H5 + H9禽流感疫苗，但未免疫鴨黃病毒病疫苗，產蛋高峰時產蛋率為90%，之後產蛋率在5天內突然下降到20%，我們選取了產蛋高峰時所下的蛋20枚，選取下降後所產的蛋30枚，按已建好的鴨黃病毒病卵黃抗體間接 ELISA檢測方法進行檢測。結果產蛋高峰所產蛋的卵黃抗體0D450值均低於0. 45，最高的為0. 35 ；產蛋率下降後的0D450值參差不齊，僅有20%的卵黃抗體低於0. 45，其它均高於臨界值，最高為1. 352，以此診斷該鴨群感染鴨黃病毒。參考文獻曹貞貞，張存，黃瑜，刁有祥，葉偉成，劉月煥，韓婧文，馬國明，張冬冬，許豐，王丹， 姜甜甜，袁媛，謝小雨，高緒慧，唐熠，施少華，萬春和，張晨，何玢，楊夢婕，陸新浩，張冰，張國中，馬學軍，張大丙.鴨出血性卵巢炎的初步研究[J].中國獸醫雜誌，2010，46 (12) 3-6.萬春和，施少華，程龍飛，陳紅梅，傅光華，張大丙，林芳，林建生，黃瑜.一種引起種 (蛋)鴨產蛋驟降新病毒的分離與初步鑑定[J].福建農業學報，2010，25(6): 663-666.Jingliang Suj Shuang Li， Xudong Huj Xiuling Yuj Yongyue Wang, Peipei Liuj Xishan Lu， Guozhong Zhang， Xueying Huj Di Liuj Xiaoxia Li， Wenliang Suj Hao Lu，Ngai Shing Mokj Peiyi Wang, Ming Wang, Kegong Tianj George F. Gao. Duck Egg-Drop Syndrome Caused by BYD Virus, a New Tembusu-Related Flavivirus [J]. PLoS One.，2011 Mar 24; 6 (3) : el8106.
權利要求
1.一種檢測鴨黃病毒病卵黃抗體的間接ELISA方法，其特徵在於以鴨黃病毒作為包被抗原，對鴨所產蛋的卵黃提取抗體，建立了檢測鴨黃病毒病卵黃抗體的間接ELISA方法。
2.根據權利要求1所述的檢測鴨黃病毒病卵黃抗體的間接ELISA方法，其特徵在於 所述鴨黃病毒為鴨黃病毒Ofcd /Yaririrtt^ WR株，保藏登記號為CGMCC NO. 4906。
3.根據權利要求1所述的檢測鴨黃病毒病卵黃抗體的間接ELISA方法，其特徵在於 所述抗原先經過濃縮，包括如下步驟收集含有鴨黃病毒的胚尿囊液後於4°C、8000 r/min 離心30 min，上清於45000 r/min離心4°C離心2 h，棄上清後沉澱用滅菌PBS重懸，得到病毒濃縮液，儲存於-70°C。
4.根據權利要求1所述的檢測鴨黃病毒病卵黃抗體的間接ELISA方法，其特徵在於 所述病毒濃縮液經進一步純化，將病毒濃縮液通過蔗糖梯度離心純化後經超速離心加以濃縮獲得。
5.根據權利要求4所述的檢測鴨黃病毒病卵黃抗體的間接ELISA方法，其特徵在於 進一步純化的步驟為製備10%、20%、30%、40%和50%等5個梯度的蔗糖平衡液，將病毒濃縮液加在10%蔗糖液上層，於40C >40000 r/min水平離心2 h ；結果在10%-20%、30%_40%、 40%-50%間發現有病毒帶，收集各帶後4°C下45000 r/min離心2 h，棄上清後沉澱用滅菌 PBS重懸，並用RT-PCR方法檢測各帶的病毒含量，以30%-40%帶病毒量最大，得到病毒純化液，儲存於一 70°C為抗原備用。
6.根據權利要求1所述的檢測鴨黃病毒病卵黃抗體的間接ELISA方法，其特徵在於 所述間接ELISA方法包括包被抗原、封閉、加樣、加酶標二抗、顯色、終止。
7.根據權利要求6所述的檢測鴨黃病毒病卵黃抗體的間接ELISA方法，其特徵在於 所述間接ELISA方法的最佳工作條件為抗原稀釋3200倍，樣品稀釋40倍，酶標二抗稀釋濃度為1:3200，陰陽臨界值為0. 45。吧
全文摘要
本發明提供了一種檢測鴨黃病毒病卵黃抗體的間接ELISA方法，該方法以鴨黃病毒作為包被抗原，對鴨所產蛋的卵黃提取抗體，建立了檢測鴨黃病毒病卵黃抗體的間接ELISA方法。該方法可以對目前我國流行的鴨黃病毒病進行有效的診斷，並可開展大規模的流行病學調查，為鴨黃病毒病的防治和流行情況的掌握提供一種快速、簡便的檢測方法。
文檔編號G01N33/569GK102323411SQ201110232859
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月15日 優先權日2011年8月15日
發明者萬春和, 傅光華, 施少華, 李敏, 梁昭平, 王斌, 王鑫, 程龍飛, 許芬芬, 陳紅梅, 黃瑜 申請人:福建省農業科學院畜牧獸醫研究所