手足口病混合感染中柯薩奇A組16型病毒的檢測方法與流程
2023-09-14 09:03:25
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種手足口病臨床樣品中柯薩奇a組16型腸道病毒的檢測方法。
背景技術：
柯薩奇a組16型（coxsackievirusa16，cv-a16）是引起手足口病(hand-foot-mouthdisease,hfmd)主要病原體之一。hfmd是嚴重危害兒童的一種常見傳染病,多數患者以發熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要特徵，預後良好,少數患者可並發呼吸道感染、肺水腫、心肌炎和無菌性腦膜炎等,甚至死亡。hfmd的流行會成為重大公共衛生問題之一。
目前已經明確引起手足口病的病原體有二十多種,主要為小rna病毒科腸道病毒屬的柯薩奇病毒a組16、4、5、7、9、10型,b組2、5、13型、埃可病毒(echoviruses)以及人腸道病毒71型（enterovirus71，ev-a71）,其中以ev-a71和柯薩奇a組16型（coxsackievirusa16，cv-a16）最為常見。研究發現，hfmd流行期間，多種腸道病毒的共感染和/或混合感染普遍存在，多種腸道病毒的共感染和/或混合感染可加重疾病和/或延長病程。因此對混合感染監測有助於hfmd預防和治療。
腸道病毒的vp1蛋白直接決定病毒的抗原性，而vp1蛋白n-末端的bc-環（90～107位胺基酸）不僅具有高度變異性，而且還存在型特異的中和抗體和體抗原表位，獲得該區域序列信息對確定病毒的型別非常重要，在不同腸道病毒之間的抗原差異主要是由於vp1中的bc-環發生胺基酸的改變。在hfmd病原學調查中，根據該位置而設計腸道病毒通用引物進行巢式或半巢式rt-pcr、測序，並在ncbiblast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)比對，以確定為何種腸道病毒感染。如果通過以上檢測未顯示cv-a16，為了進一步鑑定是否還存在cv-a16的感染，目前的做法是必須先用cv-a16的特異引物進行rt-pcr，然後巢式或半巢式pcr，1%瓊脂糖電泳以確定其片段大小而確定為cv-a16感染。這需要進行兩次rt-pcr，不但增加了成本，還需要較長時間，對於大規模流行病調查，花費巨大，故而有必要改進腸道病毒混合感染中cv-a16檢測方法。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是，克服以上所述缺陷，提供一種檢測速度快、準確率高、減少費用的cv-a16病毒的檢測方法。
為了解決以上所述技術問題，本發明所述手足口病混合感染中柯薩奇a組16型病毒的檢測方法，所述方法包括以下步驟：
（1）提取病毒rna，根據腸道病毒vp1的特點設計腸道病毒a組通用引物進行巢式或半巢式pcr；首先用引物entaf(5’tncargcwgcngaracngg3』)和entaro（5』anggrttngtngmwgtytgcca3』）進行第一步的rt-pcr擴增，然後再用引物entaf和entari（5』ggnggnacrwacatrtaytg3』）進行第二步半巢式pcr擴增，測序並進行ncbiblast比對，如果該核苷酸序列與genbank資料庫中腸道病毒參考株核苷酸序列同源性大於75%，即認為是同一血清型，檢測出手足口病患者感染的腸道病毒種類；
（2）經過所述步驟（1）的鑑定，如果未檢測出柯薩奇a組16型病毒，根據腸道病毒a組通用引物和cv-a16序列設計特異cv-a16上遊引物ca16afo（5’tacaagccgcggagacagg3』）和下遊引物ca16ari（5』ggtgggacatacatgtactg3』），以所述步驟（1）中rt-pcr產物為模板進行巢式pcr擴增，取擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，即可鑑定。
本發明的有益效果：相比於現有技術，本發明省略一步rt-pcr法，就可完成該樣品的cv-a16鑑定，一個樣品可節約成本近30元人民幣，時間也從原來4小時縮短到1.5小時，而且只需一次rt-pcr即可完成，因此該方法能夠快速、簡便、而且大幅度降低成本，為大規模的腸道病毒混合感染中cv-a16分子流行病學監測提供了保障。
附圖說明
圖1為所述實施例的腸道病毒1%瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖2為所述實施例的cv-a161%瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖3為所述實施例所測一個樣本的cv-a16序列；
圖4為cv-a16部分vp1的引物設計和擴增示意圖。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。
本發明所述手足口病混合感染中柯薩奇a組16型病毒的檢測方法，所述方法包括以下步驟：
（1）提取病毒rna，根據腸道病毒vp1的特點設計腸道病毒a組通用引物進行巢式或半巢式pcr；首先用引物entaf(5’tncargcwgcngaracngg3』)和entaro（5』anggrttngtngmwgtytgcca3』）進行第一步的rt-pcr擴增，然後再用引物entaf和entari（5』ggnggnacrwacatrtaytg3』）進行第二步半巢式pcr擴增，測序並進行ncbiblast比對，如果該核苷酸序列與genbank資料庫中腸道病毒參考株核苷酸序列同源性大於75%，即認為是同一血清型，檢測出手足口病患者感染的腸道病毒種類；
（2）經過所述步驟（1）的鑑定，如果未檢測出柯薩奇a組16型病毒，根據腸道病毒a組通用引物和cv-a16序列設計特異cv-a16上遊引物ca16afo（5’tacaagccgcggagacagg3』）和下遊引物ca16ari（5』ggtgggacatacatgtactg3』），以所述步驟（1）中rt-pcr產物為模板進行巢式pcr擴增，取擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，即可鑑定。
本發明所述方法，從臨床病人的糞便中提取病毒rna，用腸道病毒a組通用引物entaf和entaro先進行rt－pcr，然後以其產物為模板進行巢式和半巢式pcr，通過測序並在ncbiblast（美國國家生物技術信息中心的一套在蛋白質資料庫或dna資料庫中進行相似性比較的分析工具，blast程序能迅速與公開資料庫進行相似性序列比較，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)比對，確定為不是cv-a16感染，再用所設計引物做巢式pcr即可。舉例如下：
實施例：
1、樣品處理
取1克糞便標本，加入5mlpbs充分振蕩混勻，3000r/min離心30min，取上清液，保存於-80℃；
2、病毒rna提取
病毒rna的提取按試劑盒（qiampviralrnaminikit）說明書操作，具體如下：取560avl加入1.5ml離心管，再加入140μl上清液，顛倒混合15sec，室溫放置10min；加入560μl無水乙醇，顛倒混合15sec；將上述溶液630μl加入qiamp吸附柱中，8000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液；加入500μlaw1，8000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液；加入500μlaw2，14000rpm離心3min，倒掉收集管中的廢液；將吸附柱放入空收集管中，14000rpm離心1min；將吸附柱放入一個乾淨的離心管中，加ave洗脫緩衝液，室溫放置1min，8000rpm離心1min；-20℃貯存；
3、擴增與測序
rt-pcr根據superonesteprt-pcrkit操作說明，具體如下：2хreactionbuffer25μl，rt-pcrmix1μl，entaf20pmol，entaro20pmol，rna10μl加水至50μl，混勻離心後50℃逆轉錄40min，按94℃2min,94℃0.3min,52℃0.3min,72℃0.3min,30個循環；72℃延伸10min，此為第一步；然後再取rt-pcr產物10μl，用2хtaqpcrmastermix25μl，以entaf和entari引物按以上第一步的條件（即94℃2min,94℃0.3min,52℃0.3min,72℃0.3min,30個循環；72℃延伸10min）擴增，取擴增產物5μl1%瓊脂糖凝膠電泳（所得到的電泳圖見附圖1）。有相應大小的特異片段（約328bp）用基於sanger雙脫氧終止法的abi3730xl高自動化測序儀測序。
以上測序結果均通過用ncbiblast比對後，確定為何種腸道病毒。
4、非cv-a16的樣品再次pcr
隨機抽取14個通過以上步驟未檢測出cv-a16感染的樣品，用步驟3中第一步得到的rt-pcr產物10μl，用2хtaqpcrmastermix25μl，以ca16afo和ca16ari引物，按以上步驟3中第一步的條件（即94℃2min,94℃0.3min,52℃0.3min,72℃0.3min,30個循環；72℃延伸10min）擴增，取擴增產物2μl1%瓊脂糖凝膠電泳（所得到的電泳圖見附圖2）。
從電泳圖（附圖2）上可看到，凡是感染了cv-a16的樣本均有約335bp特異片段顯示，再將該片段用abi3730xl高自動化測序儀測序（基於sanger雙脫氧終止法），序列通過ncbiblast比對，所用陽性樣品的序列（見附圖3，以一個樣品為例）與cv-a16同源大於75%，均為cv-a16感染。這說明通過特異引物擴增的片段，測序結果與電泳圖是相吻合的，在以後的工作中，只需通過1%瓊脂糖凝膠電泳，不需要再測序，即可判斷為cv-a16感染，這大大簡化了工作步驟，程序簡易，縮短時間，減少費用，對大規模流行病的調查意義重大。