在酮酸存在下的酶促反應的製作方法

2023-09-14 17:20:50 1

專利名稱:在酮酸存在下的酶促反應的製作方法
在酮酸存在下的酶促反應
發明領域
本發明涉及在特定的反應增強化合物的存在下X-Gly至χ-α -羥基-Gly或 X-NH2 (X是具有甘氨酸基團可以與其共價附著的羰基的肽或任何化合物)的酶促轉化。在優選實施方案中，這些反應增強化合物是酮酸(或其鹽或酯)，它們可以有利地替代過氧化氫酶使用，所述過氧化氫酶是現有技術這些類型酶促反應，例如醯胺化反應的一般組分。
相關領域的描述
眾多人激素、生長因子、細胞因子、神經遞質衍生的脂肪酸和其他重要的生物學化合物具有胺基酸或肽作為其分子結構的基本部分。許多疾病對患者中的這些生物學化合物的水平升高呈陽性應答。可以以多種方式給患者施用治療上有效量的此類生物學相關化合物。因此，關於此類化合物的有效的、划算的製造方法是非常重要的。當生物學化合物以適合於經口遞送的劑量形式製備時，這是特別正確的，所述經口遞送的劑量形式是通常優選的施用方式，儘管相對於其他施用方式生物利用率較低。
哺乳動物細胞和其他真核生物可以執行特定的翻譯後加工操作，而原核生物則不能。某些原核生物，例如大腸桿菌(E. coli)廣泛用作宿主用於經由重組DNA (rDNA)技術生產哺乳動物蛋白質，因為它們可以很容易在分批發酵方法中生長，且因為它們在遺傳上是充分表徵的。然而，許多哺乳動物蛋白質需要一定類型的翻譯後加工。如果這些蛋白質由例如大腸桿菌基因工程產生，那麼翻譯後加工通常必須使用複雜的、體外化學操作來完成， 這對於大規模生產應用是成本高昂的。即使當使用哺乳動物宿主重組生產肽時，通常也需要有效生產只在稍後對其實施進一步修飾的前體。
一種類型的此類進一步加工活性涉及肽或蛋白質的羧基末端胺基酸的特異性醯胺化。許多天然存在的激素和肽包含此類修飾，如果蛋白質將是生物學活性的，那麼所述修飾通常是必需的。一個例子是降鈣素，其中用非醯胺化脯氨酸殘基替代天然形式的醯胺化脯氨酸導致生物學活性非常顯著的減少。為了完全活性需要翻譯後醯胺化的其他生物學肽包括但不限於生長激素釋放因子、其他降鈣素、降鈣素基因相關肽、促胰液素、肽YY等。
蛋白質的羧基末端胺基酸的特異性醯胺化通常由α醯胺化酶催化。為了最大功效需要醯胺化的許多重要的生物學蛋白質的多肽序列可以例如通過基因工程技術來製造。 然而，重要的和有時必需的羧基末端醯胺化通常必須在體外進行。在這點上需要避免昂貴且繁瑣的化學醯胺化技術，並且因此需要採用醯胺化酶來執行特異性的醯胺化。
肽基甘氨酸α -醯胺化單加氧酶(PAM)催化肽底物轉化為醯胺化的肽產物。該轉化是2步反應。PAM具有2個催化結構域肽基甘氨酸α _羥基化單加氧酶(PHM)催化步驟1(底物轉化為中間體)和肽基甘氨酸α-羥甘氨酸α-醯胺化裂合酶(PAL)催化步驟 2 (中間體轉化為產物)。全長的PAM催化2個步驟。
在自然界中，大約50%的肽激素和神經遞質以前述方式由PAM醯胺化。PAM活性已在眾多不同物種中識別出來，並且在不同的物種如大鼠、母牛和青蛙中往往具有顯著的結構同源性。還已知PAM的功能、底物和輔因子在物種之間是相似的(通常相同)。底物是具有含有游離羧基的甘氨酸殘基的化合物，通常是肽。PAM催化的醯胺化反應是本領域眾所周知的。例如，在美國專利6，103，495中詳細描述了一種反應，其中使用肽基甘氨酸α-醯胺化單加氧酶催化甘氨酸延伸型鮭魚降鈣素前體轉化為在其C末端醯胺化的真正的鮭魚降鈣素(即，具有替代前體C末端甘氨酸的氨基)。
由於酶的失活，PAM的活性在醯胺化反應的過程中迅速減少。為了預防此類失活， 現有技術的酶促醯胺化反應一般需要第二種酶(例如過氧化氫酶或辣根過氧化物酶)用於良好的轉化和反應得率。然而，這消極影響了該方法的成本和效率，並且從調節立場上通常是不合需要的。例如，過氧化氫酶是大的蛋白質，它難以純化，並且它可能被不需要的蛋白酶汙染，所述蛋白酶在醯胺化反應中可以攻擊任何產物、前體和/或酶。在藥物產物的情況下與過氧化氫酶共同純化的蛋白質還可超過調節標準地汙染最終產物。此外，當過氧化氫酶來自動物來源時，或當過氧化氫酶製造中使用動物組分時，必須特別小心以避免傳染性海綿狀腦病。
發明概述
因此本發明的目的是提供有效、高得率、低成本的酶促醯胺化反應，其中過氧化氫酶或其他酶促清除劑相對於現有技術可以大大減少，並且優選完全消除。另一目的是提供根據前述反應方法製造的醯胺化生物學化合物。
在一個方面，本發明提供了用於體外生產醯胺化產物的方法，所述方法包括在(A) 肽基甘氨酸α-醯胺化單加氧酶和(B)反應增強化合物的存在下，所述反應增強化合物是 α -酮酸，或其鹽或酯，使具有游離酸形式且附著至羰基的甘氨酸殘基的前體反應，其中所述α 「酮酸具有分子結構RC (0) C (0) 0Η，且其中R選自芳基、C1-C4烴部分、滷化或羥基化的 C1-C4烴部分和C1-C4羧酸。
在另一方面，本發明提供了用於體外生產醯胺化產物的方法，所述方法包括通過在(i)肽基甘氨酸α-羥基化單加氧酶和(ii)反應增強化合物的存在下，所述反應增強化合物是α 「酮酸，或其鹽或酯，使具有游離酸形式且附著至羰基的甘氨酸殘基的前體反應形成羥基化中間體，其中所述α-酮酸具有分子結構RC(O)C(O)OH,且其中R選自芳基、 C1-C4烴部分、滷化或羥基化的C1-C4烴部分和C1-C4羧酸；和同時或隨後在路易斯鹼或肽酸α-羥甘氨酸α-醯胺化裂合酶的存在下使所述中間體反應。
在另一實施方案中，本發明提供了用於增強肽藥物試劑的生物利用率的方法，其中所述試劑在非天然醯胺化的位置處醯胺化，所述非天然醯胺化通過如下步驟完成，使具有游離酸形式的甘氨酸殘基的前體在(A)肽基甘氨酸α-醯胺化單加氧酶和(B)反應增強化合物的存在下，所述反應增強化合物是α 「酮酸，或其鹽或酯，在需要醯胺化的位置處反應，其中所述α 「酮酸具有分子結構RC (0) C (0) 0Η，且其中R選自芳基、C1-C4烴部分、滷化或羥基化的C1-C4烴部分和C1-C4羧酸。
在另一方面，本發明提供了用於增強肽藥物試劑的生物利用率的方法，其中所述試劑在非天然醯胺化的位置處醯胺化，所述非天然醯胺化通過下列步驟完成(A)在(i)肽基甘氨酸α-羥基化單加氧酶和(ii)反應增強化合物的存在下，所述反應增強化合物是 α -酮酸，或其鹽或酯，使具有游離酸形式且附著至羰基的甘氨酸殘基的前體在需要醯胺化的位置處反應，其中所述α 「酮酸具有分子結構RC (0) C (0) 0Η，且其中R選自芳基、C1-C4烴部分、滷化或羥基化的C1-C4烴部分和C1-C4羧酸，因此形成羥基化中間體；和
(B)同時或隨後使所述中間體與路易斯鹼或肽基α -羥甘氨酸α _醯胺化裂合酶反應。
在上述方法的一個實施方案中，反應增強化合物是α-酮酸鹽。在另一實施方案中，反應增強化合物是α-酮酸酯。在再一實施方案中，反應增強化合物是α-酮酸。
在一個實施方案中，R(在反應增強化合物的分子結構中)是芳基(優選苯基)。 在另一實施方案中，R是C1-C4烴，優選C1-C4烷基。直鏈R基團可能比相應的支鏈R基團略微更加有效。
本發明還提供了已根據本文提及的任何一種方法製備的醯胺化產物。
發明詳述
本發明應用於製造需要具有醯胺基的任何化合物。因為本文討論的酶識別具有甘氨酸殘基的肽，所以本發明對於此類結構的醯胺化有用，即使當它們是較大分子的部分時， 所述較大分子在其他位置上包括非天然的或修飾的胺基酸，或胺基酸衍生物例如保護基團等。即使具有作為其分子結構部分的非肽區域的化合物也應從本發明受益，只要存在由本文使用的酶識別的甘氨酸。
催化本文反應的酶被認為識別具有游離酸形式(即具有游離的羧基)且附著至羰基的甘氨酸殘基的任何前體底物。參見，例如，Merkler等人，Archives of Biochemistry and Biophysics, 1966，第330卷，No. 2，430-434(甘氨酸延伸型脂肪酸底物)；和美國專利 6，103，495 (在天然鮭魚降鈣素的醯胺形成的氨基位置上具有C末端甘氨酸的鮭魚降鈣素， 用作鮭魚降鈣素醯胺化的底物)。因此，預期使用本文討論的醯胺化酶的任何底物的任何酶促醯胺化都可以從本發明受益，它增強替代現有技術過氧化氫酶(或其他現有技術的反應增強化合物例如清除劑酶(scavenging enzyme))的酶促醯胺化。對於PHM催化的反應同樣應該是正確的，PHM是PAM的功能性結構域之一。
存在眾多的藥物試劑，不僅包括天然的激素和神經遞質，還包括藥物活性截短物及其修飾，或衍生的脂肪酸，當醯胺化時所述藥物試劑更具有生物學活性。即使當生物學活性不必增加時，藥物試劑的醯胺化也可能令人滿意地增加相對於使用游離酸形式的試劑的經口生物利用率。參見2004年10月7日公開的美國專利公開號20040197323 (Mehta等人的美國專利申請序號10/761,481的公開)，其公開內容引入本文作為參考。本領域技術人員將理解如本文所教導的醯胺化肽或其他化合物的其他原因。本發明被認為增強PAM催化和PHM催化的反應，不管所選擇的產物或底物，只要底物是由PAM或PHM識別的底物。
肽基甘氨酸α -醯胺化單加氧酶(PAM)及其2個催化結構域肽基甘氨酸α -羥基化單加氧酶(PHM)和肽基甘氨酸α-羥甘氨酸α-醯胺化裂合酶(PAL)在文獻中得到報告。本領域還已報告了優選的反應條件，輔因子等。本文報告了醯胺化和醯胺化產物純化的一個具體例子。本發明的主要改進是現在可以用某些α-酮酸(或其鹽或酯)替代現有技術醯胺化中通常使用的過氧化氫酶。
不希望被理論束縛，認為本文討論的酶促反應不合需要地生產過氧化氫作為副產物，所述過氧化氫對酶促反應和/或可回收的產物得率有負面影響。在現有技術中認為過氧化氫酶可能已充當過氧化物清除劑以使形成的任何過氧化氫的負面影響最小化。
再次不希望被理論束縛，認為本發明的α _酮酸(或其鹽或酯)有效地執行過氧化物清除劑的作用而無需過氧化氫酶或其他清除劑酶。認為例如α-酮酸可以以下列方式與過氧化反應[0027]R-C (0) -C (0) -0Η+Η202 — RC (0) 0H+C02+H20
當使用丙酮酸作為α-酮酸時，假定它與過氧化氫反應以產生乙酸、水和二氧化碳。
因為R基團在這個反應中沒有變化，所以大量的R部分是可能的。申請人已測試了許多酮酸(或其相應的酯或鹽)，並且在下表1中已報告了其用於醯胺化重組人甲狀旁腺激素截短物(PTH的前31個胺基酸，隨後為C末端甘氨酸)的效率。在表1的腳註裡還報告了使用過氧化氫酶的醯胺化。在表1中醯胺化產物的轉化不是可直接比較的，因為使用了不同濃度的反應增強酮酸(或其鹽或酯)。選擇適合於每種化合物的優選濃度。同樣，因此關於表1中測試的每種化合物使用單獨的對照，從而使得每種化合物的表現可以與其對應的對照進行比較。如所表明的，3種測試化合物並不優於對應的對照。表1中列出的對照值是在本發明的反應增強化合物不存在下醯胺化rhPTH(l-31)Gly32-0H觀察到的一般值。
用α -酮酸/酯的醯胺化反應
下文列出了執行以測試各種酮酸(或其鹽或酯)的功效的一些反應細節。
為了確定下表1中的信息，在水中製備所有試劑的貯存液。在下列條件下進行醯胺化:4mg/mL rhPTH(l-31)Gly32_0H、30mM 2-嗎啉代乙磺酸(MES)pH[6. 3-6. 5]、0· 5 μ M硫酸銅、5mM碘化鉀、2mM抗壞血酸、[0-1%]乙醇和15，000U/mL PAM。所有反應均於37°C溫育 4小時。以下列順序加入試劑rhPTH(l-31)Gly32-0H、水、MES、碘化鉀、乙醇、硫酸銅、α -酮酸或酯、抗壞血酸和ΡΑΜ。所有反應均用6%三氟乙酸酸化至ρΗ 2. 0並通過CEX-HPLC (面積％ )分析，以檢測所需產物rhPTH(l-31)NH2的形成。結果如下表1。
表 1
在α -酮酸/酯的存在下 rhPTH(l、0.5 μΜ硫酸銅、5mM碘化鉀、2 mM抗壞血酸、[0如表1中所示，α -酮酸的鹽和酯傾向於與相應的α -酮酸類似地表現。較大的 R基團傾向於不能如較小的R基團(優選C1-C4) 一樣表現良好，除了芳族基團當位於吸電子位時傾向於表現良好。直鏈化合物傾向於比相應的支鏈化合物表現得稍好一些。預期烴部分可以是滷化或羥基化的而不明顯損害功能。如所顯示的，有效的化合物表現相當良好並且因此是現有技術過氧化氫酶的適當的替代物，因此避免了上文討論的過氧化氫酶的缺點ο
下文列出了根據本發明醯胺化底物並純化所得產物的一些詳細的方法步驟。
實施例1 使用肽基甘氨酸α -醯胺化單加氧酶將甘氨酸延伸型甲狀旁腺激素片段轉化為醯胺化的對應物
使用丙酮酸鹽的rhPTH(l-34)Gly35-0H的醯胺化
表2中顯示了用於醯胺化rhPTH(l-34)Gly35-0H的組分和最終濃度。隨後為醯胺化的概述。
8表2 rhPTH(l 將在 l，900mL 25mM MES、200mM NaCl pH 6. 0 中的大約 12. 4 克 rhPTH(l_34) Gly35-0H裝進配有攪拌器和氣體噴霧器的玻璃容器中。
向這種溶液中以列出的順序加入下列組分3，025mL水、74lmL250mM MES pH6. 3、1. 03mL 3mM硫酸銅、124mL碘化鉀、62mL 190標準強度乙醇、124mL 400mM丙酮酸鈉和124mL100mM抗壞血酸鈉。
將反應容器置於水浴中並將反應混合物攪拌加熱至25-27°C。
用21mL 2M HCl將反應混合物的pH調整至5. 8。啟動氧噴射；調整噴射速率以避免反應混合物的過量發泡。
加入47mL PAM並將反應混合物於25_27°C溫育4小時35分鐘(在溫育時間段自始至終執行氧噴射)。
用74mL 2M HCl將反應混合物酸化至pH2. 4。
如Miller 等人 ABB 298 :380_388 (1992)美國專利號 4，708，934、歐洲公開 0308067和0382403、以及Biotechnology第II卷(1993)第64-70頁中所描述的可以獲得 PAM酶，其公開內容引入本文作為參考。PAM酶還可由內部命名為UGL 73-26/M MWCB 00的 PAM表達細胞系獲得，所述細胞系根據國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約 (Budapest Treaty on the International Recognition of Deposits of Microorganisms for Purposes of Patent Procedure)作為ATCC編號PTA-6784保藏於美國典型培養物保藏中心(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas Virginia, 20110-2209, U. S. Α.。 對保藏的細胞系實施在這個條約下公布的規程，並且樣品將在條約要求的時間和在條約要求的條件下，並符合條約籤名人的專利法和規程時可用。例如，在基於本申請的美國專利或要求其優先權或參考其的任何其他美國申請授權後，對保藏材料的可用性的所有限制將不能取消地去除至布達佩斯條約或35U. S. C. § 112所要求的程度。
甘氨酸延伸型前體可以通過類似於美國專利6，103，495，實施例1_2中所描述的方式發酵產生，並如美國專利6，103，495，實施例3中所描述的在醯胺化之前進行純化.它還可根據美國專利公開U. S. 2005/0221442 (美國申請號11/076,260)產生。前述的公開內容引入本文作為參考。
在其中用於醯胺化的酶是肽基甘氨酸α -羥基化單加氧酶(PHM)的情況下，使用與如上所述相同的反應混合物，其中用PHM替代ΡΑΜ。此外，在4-6小時的溫育時間段結束時，通過添加鹼使反應混合物的PH增至8-9。在終止反應之前將反應混合物再攪動4-8小時。通過只表達PAM的N末端部分(約前40dKa)可以獲得ΡΗΜ。參見例如Mizuno等人， BBRC第148卷，No. 2，第546-52頁(1987)，其公開內容(因為它涉及Mizuno' s" AEl" 引入本文作為參考。已知青蛙皮膚天然地表達PHM。
實施例2 醯胺化後的純化
陽離子交換(CEX)層析
使用CEX 層析實現從殘留的 rhPTH(l-34)Gly35-0H 純化 rhPTH(l_34) _NH2。下文描述了 CEX層析法的概述。將酸化的醯胺化輸出物裝載到9cmX19cm、用25mM MES pH 6.5 平衡的Toyopearl SP650M(Tosoh Bioscience LLC)柱上。柱以180cm/小時操作並且在 280nm監控柱流出物的UV吸光度。用25mM MES pH 6. 5洗滌柱直至柱流出物的pH回到 6.5。用25mM MES,80mM NaCl pH6. 5洗滌柱直至洗滌峰完全洗脫並且達到穩定的UV基線。 用25mMMES，200mM NaCl pH 6. 5從柱洗脫產物rPTH(l_34) _NH2。收集整個UV峰；並通過 RP-HPLC篩選級分以確定匯集的標準。反相(RP)層析
使用RP層析將鹽形式的肽從氯化物交換為乙酸鹽；RP層析提供了肽的邊緣純化。 用3體積的333mM乙酸鈉稀釋CEX層析輸出物並充分混合。在裝載前允許混合物在室溫下放置75分鐘。將乙酸鹽稀釋的樣品裝載到6cmX17cm、用250mM乙酸鈉pH 7. 5平衡的 Amberchrom CG300M(Tosoh Bioscience LLC)柱上。柱以 180cm/小時操作並且在 280nm監控柱流出物的UV吸光度。用250mM乙酸鈉pH 7. 5將柱洗滌60分鐘。用0. 乙酸平衡柱。用0. 乙酸、40%乙醇從柱中洗脫出產物rhPTH(l-34)-NH2。收集整個UV峰。
rhPTH (1-34) -NH2 的表徵
將RP層析輸出物通過凍幹法濃縮為白色絮狀粉末，從而得到11.8克(來自醯胺化的95 %總得率)rhPTH (1-34) _NH2。通過電霧化電離質譜法(ESI-MS)確定 rhPTH(1-34)-NH2分子量為4，116. 9Da，這與計算出的平均分子量4，116. 8Da相一致。
儘管本發明已關於其具體實施方案進行了描述，但許多其他變化和修飾及其他用途對於本領域技術人員將是顯而易見的。本發明因此不限制於本文的具體公開內容，而僅限制於附加的權利要求
。
權利要求
1.用於體外生產醯胺化產物的方法，所述方法包括在(A)肽基甘氨酸α-醯胺化單加氧酶和(B)反應增強化合物的存在下，使具有游離酸形式且附著至羰基的甘氨酸殘基的前體反應，其中，所述的反應增強化合物選自丙酮酸乙酯、丙酮酸或其鹽、丙酮酸甲酯、苯甲醯甲酸或其鹽、2- 丁酮酸或其鹽、3-甲基-2-氧代丁酸或其鹽和2-酮戊二酸或其鹽。
2.權利要求
1的方法，其中所述反應增強化合物選自丙酮酸或其鹽。
3.權利要求
2的方法，其中所述反應增強化合物是丙酮酸鈉。
4.用於體外生產醯胺化產物的方法，所述方法包括(A)通過在(i)肽基甘氨酸α-羥基化單加氧酶和(ii)反應增強化合物的存在下，使具有游離酸形式且附著至羰基的甘氨酸殘基的前體反應形成羥基化中間體，其中，所述的反應增強化合物選自丙酮酸乙酯、丙酮酸或其鹽、丙酮酸甲酯、苯甲醯甲酸或其鹽、2-丁酮酸或其鹽、3-甲基-2-氧代丁酸或其鹽和2-酮戊二酸或其鹽；和(B)同時或隨後使所述中間體與路易斯鹼或肽基α-羥甘氨酸α _醯胺化裂合酶反應。
5.權利要求
4的方法，其中所述反應增強化合物選自丙酮酸或其鹽。
6.權利要求
5的方法，其中所述反應增強化合物是丙酮酸鈉。
7.權利要求
1的方法，其中所述產物是非天然醯胺化的肽。
8.權利要求
4的方法，其中所述產物是非天然醯胺化的肽。
9.權利要求
1的方法，其中所述產物是醯胺化的肽，其中所述的肽在非天然醯胺化的位置處醯胺化。
10.權利要求
4的方法，其中所述產物是醯胺化的肽，其中所述肽在非天然醯胺化的位置處醯胺化。
11.用於增強肽藥物試劑的生物利用率的方法，其中所述試劑在非天然醯胺化的位置處醯胺化，所述非天然醯胺化通過如下步驟完成，使具有游離酸形式的甘氨酸殘基的前體在(A)肽基甘氨酸α-醯胺化單加氧酶和(B)反應增強化合物的存在下，在需要醯胺化的位置處反應，其中，所述的反應增強化合物選自丙酮酸乙酯、丙酮酸或其鹽、丙酮酸甲酯、苯甲醯甲酸或其鹽、2- 丁酮酸或其鹽、3-甲基-2-氧代丁酸或其鹽和2-酮戊二酸或其鹽。
12.用於增強肽藥物試劑的生物利用率的方法，其中所述試劑在非天然醯胺化的位置處醯胺化，所述非天然醯胺化通過下列步驟完成(A)在(i)肽基甘氨酸α-羥基化單加氧酶和(ii)反應增強化合物的存在下，使具有游離酸形式且附著至羰基的甘氨酸殘基的前體在需要醯胺化的位置反應，因此形成羥基化中間體，其中，所述的反應增強化合物選自丙酮酸乙酯、丙酮酸或其鹽、丙酮酸甲酯、苯甲醯甲酸或其鹽、2-丁酮酸或其鹽、3-甲基-2-氧代丁酸或其鹽和2-酮戊二酸或其鹽；和(B)同時或隨後使所述中間體與路易斯鹼或肽基α -羥甘氨酸α _醯胺化裂合酶反應。
13.權利要求
1的方法，其中所述產物是肽。
14.權利要求
4的方法，其中所述產物是肽。
15.用於體外生產α-羥基-甘氨酸的方法，所述方法包括在(i)肽基甘氨酸α-羥基化單加氧酶和(ii)反應增強化合物的存在下，使具有游離酸形式且附著至羰基的甘氨酸殘基的前體反應，其中，所述的反應增強化合物選自丙酮酸乙酯、丙酮酸或其鹽、丙酮酸甲酯、苯甲醯甲酸或其鹽、2- 丁酮酸或其鹽、3-甲基-2-氧代丁酸或其鹽和2-酮戊二酸或其鹽。
16.權利要求
15的方法，其中所述反應增強化合物選自丙酮酸或其鹽。
17.權利要求
16的方法，其中所述反應增強化合物是丙酮酸鈉。
專利摘要
在酮酸或其鹽或酯的存在下酶促實現X-Gly至X-α-羥基-Gly或X-NH2(X是具有能夠與甘氨酸形成共價鍵的羰基的肽或任何其他化合物)的體外轉化，以提供良好的得率而無需過氧化氫酶或類似的酶促反應增強劑。肽基甘氨酸α-醯胺化單加氧酶(PAM)是用於催化該轉化的優選酶。可替代地，使用肽基甘氨酸α-羥基化單加氧酶(PHM)將X-Gly轉化為可以回收的X-α-羥基-Gly，或任選地可以同時或順次通過路易斯鹼或酶肽基α-羥甘氨酸A-醯胺化裂合酶(PAL)的作用轉化為醯胺。PHM和PAL都是PAM的功能性結構域。
文檔編號C12P21/06GKCN101065493 B發布類型授權 專利申請號CN 200580040163
公開日2011年11月16日 申請日期2005年11月23日
發明者A·P·康薩爾沃, J·P·吉利甘, N·M·梅塔, W·斯特恩 申請人:尤尼基因實驗室公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (1),