在臨床樣本中檢測流行性感冒a型和b型病毒的方法
2023-09-14 05:53:50 2
專利名稱：在臨床樣本中檢測流行性感冒a型和b型病毒的方法
技術領域：
本發明是申請號為97191313.7，國際申請號為PCT/US97/15602的專利申請的分案申請。
本發明提供了顯色和螢光的4,7-二烷氧基-N-乙醯基神經氨酸底物，它可在臨床樣本中用來檢測流行性感冒A型和B型病毒。更具體的是，本發明提供了可用來區分具有神經氨酸酶反應活性的各種病毒的4,7-二烷氧基N-乙醯基神經氨酸底物。這樣，流行性感冒A型和B型病毒可用本發明的4,7-二烷氧基-N-乙醯基神經氨酸衍生物來區分於副流行性感冒病毒1、2、3和4型和流行性腮腺炎病毒。
感染疾病是人們最通常看內科醫生的原因。病毒比所有其它組合微生物更多地導致這些感染。在所有由於病毒產生的各種感染中，呼吸道病毒(流行性感冒A和B；副流行性感冒1、2、3和4；呼吸道合胞(syncytial)病毒和腺病毒)最為流行。人們早已於公元前430年雅典的瘟疫發現了流行性感冒病毒的致死性(Langmuir等，New Engl.J.Medicine,313(1985)1027)。流行性感冒是導致急性呼吸道疾病的首位原因和美國第六位的年死亡因素(每月死亡統計報告(Monthly Vital Statistics Report),43卷，第6號(1995))。結果，開發出病毒和病毒感染的診斷方法越來越變得重要。
快速診斷病毒感染也已成為行醫優良的一個整體部分。一些病毒對於其產生的抗體具有可定義的抗原。因此，免疫分析被廣泛地用於測量病毒粒子是否存在。若需要測量病毒粒子較寬的分類，可以檢測病毒特定的組份。例如，流行性感冒病毒表達了有神經氨酸酶(唾液酸酶)活性的表面糖蛋白。含2-酮苷連接的N-乙醯基神經氨酸的神經氨酸酶酶水解底物(Neu5Ac，也稱為唾液酸)。Neu5Ac由9個碳原子、一個羧基和一個N-乙醯基的骨架構成。下面顯示了其一般結構以及用來指出碳原子的編號系統。 當具有神經氨酸酶活性的病毒粒子與顯色或/靈螢光Neu5Ac糖苷培養時，酶會使顯色或螢光的糖苷配基從底物上裂解下來，該反應產物指示有病毒粒子的存在。在本說明書中，與上式中的5-位碳連接的N-乙醯基被稱為AcHN。
美國專利5,252,458揭示了通過使酶與酶的顯色底物反應檢測病毒存在的一個方法，在此併入供參考。Yolken等(傳染病雜誌(J.InfectiousDiseases),142(1980)516-523)開發了直接測量流行性感冒神經氨酸酶的分析方法。Yolken等使用Neu5Ac的4-甲基7-羥基香豆素基-2-酮苷作為螢光的底物在製備含少量培養的病毒以及一些從感染流行性感冒病毒的志願者的鼻洗液樣本的製劑中測量神經氨酸活性。Yolken等提示「成功地開發出用於檢測流行性感冒神經氨酸酶的螢光度量酶分析方法，由此提供了能足夠快地讓合適的防治介入的診斷流行性感冒的實用的手段」根據Yolken等的方法，光量分析對臨床應用靈敏度不足。相反，Yolken等注意到螢光分析可適用於檢測出臨床樣本的流行性感冒神經氨酸酶。
Pachucki等(臨床微生物學雜誌(J.Clical Microbiology),26(1988)2664-2666)等試驗了Neu5Ac的4-甲基7-羥基香豆素基(umbelliferyl)-2-酮苷對從流行性感冒病人收集到的臨床樣本的作用。由於其靈敏度低，分析沒有在臨床樣本中直接迅速地檢測到神經氨酸酶。但是，該分析在組織培養物培養25小時後識別出了91％的病毒陽性分離物。
使用修飾的Neu5Ac底物會增加神經氨酸酶分析的特異性。在唾液酸中，4-位碳(C-4)被報導在酶底物交互作用中起重要的作用。再者，由於唾液細菌酶有神經氨酸酶活性(Varki等，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.),258(1983)12465-12471)，必須消除這些不需要的交互作用。現已顯示4-甲氧基-Neu5Ac的酮苷對某些細菌性唾液酸酶有耐受性，但，被某些病毒唾液酸酶快速地裂解(Beau等，歐洲生物化學雜誌(Eir.J.Biochem.),106(1980)531-540)。
雖然對N-乙醯基神經氨酸的4-位修飾提供了特定病毒和特定細菌性神經氨酸酶反應活性之間的特異性，但仍然需要得到這樣的底物它讓各種病毒的神經氨酸酶反應活性之間進一步有特異性或分化，同時保持病毒和細菌神經氨酸酶反應活性的特異性。例如，這類底物對特定類型的含神經氨酸酶病毒的特異性高，能有更好更多地直接治療方式。這類底物也能更精確地監視病毒感染，得到更合適的集中醫學治療。本發明的顯色和螢光4,7-改性的N-乙醯基神經氨酸底物使各種病毒神經氨酸酶反應活性之間有進一步的特異性或分化，同時保留了病毒和細菌神經氨酸酶之間的特異性。
本發明涉及可用來檢測和識別臨床樣本中流行性感冒病毒的顯色和螢光4,7-改性的N-乙醯基神經氨酸底物。更具體的是，本發明涉及能用來檢測和識別臨床樣本中流行性感冒病毒的顯色和螢光4,7-二烷氧基N-乙醯基神經氨酸底物。這些4,7-改性的N-乙醯基神經氨酸底物可用於診斷試驗來區分臨床樣本中流行性感冒A型和B型病毒與具有神經氨酸酶的其它病毒。本發明也涉及使用這類底物的的診斷方法。
本文使用的術語「顯色或螢光基團」和「標誌或報告性基團」包括，不限於，呈現吸收或發螢光的分子。術語「顏色」同樣包括，不限於，吸收和發螢光分子。
本發明的一個目的是提供用於檢測病毒的診斷方法的顯色和螢光4,7-改性的N-乙醯基神經氨酸底物。本發明的另一個目的是提供檢測臨床樣本中的流行性感冒A和B型病毒的實用、方便、節省費用的方法。本發明的另一個目是提供能區分臨床樣本中流行性感冒A和B型病毒和有一般神經氨酸反應活性的其它病毒的實用、方便、節省費用的診斷方法。
本發明的再一個目的是提供下列通式的4,7-二烷氧基-N-乙醯基神經氨酸 其中R1和R2是含1-4個碳原子的烷基。較好的是，R1和R2是甲基。
本發明的另一個目的是提供下列通式的4,7-二烷氧基-N-乙醯基神經氨酸底物 其中R1和R2是含1-4個碳原子的烷基，R3是顯色或螢光基團。較好的是，R1和R2是甲基，R3是顯色基團。
本發明的另一個目的是提供對來自懷疑有呼吸道病毒感染的個體的臨床樣本檢測流行性感冒A和B型病毒的方法，所述的方法包括(1)將臨床樣本與下列通式的顯色或螢光4,7-二烷氧基N-乙醯基神經氨酸底物一起培養 其中R1和R2是含1-4個碳原子的烷基，R3是當從底物或底物的鹽上裂解下來後出現明顯的和特殊顏色的顯色或螢光基團；(2)觀察培養的臨床樣本以決定是否形成了明顯和特殊的顏色，其中明顯和特殊顏色的形成表示在臨床樣本中有流行性感冒A或B型病毒的存在。
本發明的另一個目的是提供對來自懷疑有呼吸道病毒感染的個體的臨床樣本檢測流行性感冒A和B型病毒的方法，所述的方法包括(1)將臨床樣本分成第一部分和第二部分；(2)使第一部分與下式的顯色或螢光4,7-二烷氧基N-乙醯基神經氨酸第一底物培養 其中R1和R2是含1-4個碳原子的烷基，R3是當從第一底物或第一底物的鹽上裂解下來後出現明顯和特殊顏色的第一顯色或螢光基團；(3)觀察培養的第一部分以決定是否形成了第一明顯和特殊的顏色，其中第一明顯和特殊顏色的形成表示在臨床樣本中有流行性感冒A或B型病毒的存在；(4)使第二部分與下式的顯色或螢光4,7-二烷氧基N-乙醯基神經氨酸第二底物培養 其中R4是含1-4個碳原子的烷基，R5是當從第二底物或第二底物的鹽上裂解下來後出現明顯和特殊第二種顏色的第二顯色或螢光基團；(5)觀察培養的第二部分以決定是否形成了第二種明顯和特殊的顏色，其中第二明顯和特殊顏色的形成表示在臨床樣本中有流行性感冒A或B型病毒的存在；其中第一和第二顏色的存在表示在臨床樣本中有流行性感冒A型或B型病毒單獨存在或有與非流行性A型或B型病毒的神經氨酸酶反應活性病毒組合存在；其中有第二顏色但沒有第一顏色表示在臨床樣本中有非流行性感冒A型和B型病毒的神經氨酸酶反應活性病毒；和沒有第一和第二顏色表示臨床樣本中沒有神經氨酸酶反應活性病毒。
本發明的其它目的、優點、特性和特徵在考慮了以下敘述和增補的權利要求書中變得更為明顯。
本發明涉及下列通式的4,7-二烷氧基-N-乙醯基神經氨酸 其中R1和R2是含1-4個碳原子的烷基。R1和R2可為相同或不同的烷基。較高級的烷基(即，R含3-4個碳原子)包括直鏈和支鏈異構體。較好的是R1和R2是含1或2個碳原子的烷基；更好的是R1和R2都是甲基。
本發明4,7-二烷氧基-N-乙醯基神經氨酸可用下列一般反應式來製備 如美國專利5,556,963(1996,9,17頒布，申請號為08/286,573，申請日199,8,5)的一般揭示從Neu5Ac中製備起始物質1(Neu5Ac的8,9-0-異亞丙基-甲基酯-甲基酮苷衍生物)，這裡併入供參考。Neu5Ac可購得(MediHerbInc.,4540S.Navajo#1,Englewood,Co.80110)。也可用Kim等，J.Am.Chem.Soc..110(1988)6481所述的過程從N-乙醯基-D-甘露糖胺與丙酮酸進行酶合成，這在下式中顯示
酶反應可用薄層層析(TLC)來檢測，產物可用離子交換層析來純化。
如美國專利5,556,963所述，Neu5Ac首先被轉化為下式的烷基酯烷基酮苷 通過用有效量的丙酮和酸催化劑處理形成縮酮(1)來保護該甲基酯甲基酮苷的C-8和C-9處鄰近的羥基。合適的酸催化劑包括對-甲苯磺酸、如吡啶鎓鹽(PPTS)和其它鹽的對-甲苯磺酸鹽、ZnCl2、FeCl3等。較好的酸催化劑是非吸溼性的對-甲苯磺酸吡啶鎓鹽。
被保護的甲酯甲基酮苷(1)然後被烷基化，形成在4-位有烷氧基的化合物2和在4-位和7-位都有烷氧基的化合物3的混合物。在C-4和C-7處的羥基烷基化可為甲基化、乙基化、丙基化或丁基化，從而在2中C-4的羥基被轉化為-OR基團，3中的C-4和C-7處的羥基被轉化為-OR基團，其中R是含1-4個碳原子的烷基。較好的是，C-4和/或C-7的烷基化是甲基化或乙基化，從而得到4-甲氧基或4-乙氧基衍生物或4,7-二甲氧基或4,7-二乙氧基衍生物。更好的是，C-4和/或C-7處的烷基化是甲基化，從而得到4-甲氧基或4,7-二甲氧基衍生物。在C-4和C-7位處引入較高級烷基一般比甲基化反應慢，得率較低。此外具有較高級烷基的顯色底物對於酶裂解不如4,7-二甲氧基-Neu5Ac易受影響，結果其分析靈敏度差。不論怎樣，對於某些特定的使用和分析，這類C-4和C-7處較高級烷基可能是有用的，甚至更好。
下面揭示了通過控制反應條件使C-7處立體位阻較大的羥基烷基化。根據該方法，用過量(一般大於約1.5摩爾當量)的烷化劑在約80％氫化鈉的分散液中處理中間體1。烷化劑選自硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丙酯和硫酸二丁酯。反應通常在約0-30℃溫度下進行約10分鐘到約48小時。較好的反應溫度範圍為約0-22℃。當在4-和7-位處形成較高級的烷氧基時一般優選地需要較長的反應時間。在本發明較好的技術方案中，在約0-30℃，較好的是約0-22℃下在C-4和C-7位形成甲氧基的甲基化反應進行約10分鐘到約30分鐘。在本發明另一個較好的技術方案中，在約0-30℃，更好地是在約0-22℃下在C-4和C-7位形成乙氧基的乙氧化反應進行約1-24小時。
用過量烷化劑(如硫酸二甲酯)處理保護的甲酯甲基酮苷1產生了在4-位含烷氧基的化合物2和在4-和7-位同時含烷氧基的化合物3的混合物。一般使用約1.5摩爾當量過量的烷化劑。較好的是使用約1.5-2.0摩爾當量烷化劑。一般所需化合物3的量相應於化合物2，隨著烷化劑的增加而增加。從這類處理得到的反應混合物一般含4-烷氧基化合物2作為主要產物，和10-20重量％的4,7-二烷氧基化合物3。兩者可分離，例如可通過柱色譜層析，然後用丙酮-己烷混合物結晶可優選地除去4-烷氧基化合物2來部分分離化合物2和3。所得的殘留物含豐富的4,7-二烷氧基物質的兩個化合物的混合物；一般兩個化合物的摩爾比增加到至少約1∶1。
通過用約80％乙酸處理從合物3以從中除去縮酮基團。乙酸水解也可使C-9位羥基的部分乙醯化。因此，可用甲醇鈉處理水解產物來除去任何在C-9上的乙酸酯基團。用鹼處理使4最後去保護，接著用酸水解得到最終的4,7-二烷氧基-Neu5Ac產物(5)。當然，存在在混合物中的4-烷氧基化合物2也可用相似的方法處理以得到相應的4-烷氧基-Neu5Ac化合物。
所得的4,7-二烷氧基-Neu5Ac可進一步通過與任何合適的標誌或報告性的基團，包括，例如顯色或螢光標誌基團，偶合來使用。優選的標誌或報告性基團是顯色基團，包括，如4-氯-1-萘醇、6-溴-1-萘醇和5-溴-4-氯-吲哚。顯色改性的4,7-二烷氧基-Neu5Ac可引入神經氨酸酶分析以用來檢測來自臨床樣本中的流行性感冒A型和B型的病毒神經氨酸酶活性。合成和在病毒分析中使用這類4,7-位改性顯色的N-乙醯基神經氨酸底物類似於PCT公開號WO91/09972；Yolken等，傳染病雜誌(J.InfectiousDiseases),142(1980)516-523；和Pachucki等臨床微生物學雜誌(J.Clinical Microbiology),26(1988)2664-2666中揭示的相關的4-位改性底物，這裡併入供參考。當然，目前的4,7-二烷氧基-N-乙醯基神經氨酸可用來形成其它含顯色和螢光的衍生物，並可用於其它的病毒分析。
一般顯色或以螢光標誌基團可用下列反應式摻入4,7-二烷氧基-Neu5Ac(5)(用5-溴-3-吲哚基作為舉例型的標誌基團) 流程通過用濃三氟乙酸和甲醇處理可首先將化合物5轉化為相應的甲酯衍生物，該酯然後與過量乙醯氯反應形成4,7-二烷氧基-Neu5Ac(6)的氯乙酸甲酯衍生物。6與5-溴-3-吲哚基偶合得到5-溴-吲哚-3-醇-4,7-二甲氧基-N-乙醯基神經氨酸-乙氧基甲酯(7)。通過用甲醇中的甲醇鈉處理使7去乙醯化得到化合物8，接著用氫氧化鈉處理得到。5-溴-3-吲哚基-4,7-二甲氧基-N-乙醯基神經氨酸(9)鈉鹽。當然，混合物中的4-烷氧基-Neu5Ac進行相似的偶合反應以形成5-溴-3-吲哚基-4-甲氧基-N-乙醯基神經氨酸鹽。
偶合的4,7-二烷氧基衍生物9然後通過高效液相色譜(HPLC)，例如用C18反相板矽膠柱從兩個偶合化合物(即4-烷氧基和4,7-二烷氧基衍生物)中分離出偶合的4,7-二烷氧基衍生物9。偶合產物的混合物可溶於水並裝載到柱上。產物通過具有甲醇組份逐漸增加的梯度洗脫進行分離，收集並匯合。所得的純化的5-溴-3-吲哚基-4,7-二甲氧基-N-乙醯基神經氨酸(9)可被乾燥並儲存到使用。一般來說，所得的產物基本沒有4-甲氧基衍生物。混合物中基本沒有4-甲氧基衍生物是很重要的，因為它與腮腺炎病毒和其它含神經氨酸酶病毒的反應性很高。
如上所述，本發明顯色或螢光的4,7-二烷氧基衍生物具有下式 其中R1和R2是含1-4個碳原子的烷基，R3是顯色或螢光基團。R1和R2可為相同或不同的烷基。較好的是，R1和R2都是甲基，R3是顯色基團。更好的是，R3是4-甲基7-羥基香豆素基、3-氰基7-羥基香豆素基、2-硝基苯基、4-硝基苯基、3-試滷靈、5-溴-4-氯-3-吲哚基、5-溴-3-吲哚基、3-吲哚基、硝基苯基偶氮苯基、硝基苯基偶氮間苯二酚基、3-甲氧基苯基、3-二甲基氨基苯基、4-氯-1-萘基或6-溴-2-萘基。更好的是，R3是4-甲基7-羥基香豆素基、5-溴-4-氯-3-吲哚基或5-溴-3-吲哚基。更好的R3是5-溴-3-吲哚基。也可使用這些底物的簡單鹽，如Na+K+和NH4+。
上式範圍中的4,7-二烷氧基顯色Neu5Ac衍生物的例子包括4-甲基-7-羥基香豆素基-4,7-二甲氧基-N-乙醯基神經氨酸-α-酮苷、2-硝基苯基-4,7-二甲氧基-N-乙醯基神經氨酸-α-酮苷、4-硝基苯基-4,7-二甲氧基-N-乙醯基神經氨酸-α-酮苷、3-氰基-7-羥基香豆素基-4,7-二甲氧基-N-乙醯基神經氨酸-α-酮苷、3-試滷靈-4,7-二甲氧基-N-乙醯基神經氨酸-α-酮苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-4,7-二甲氧基-N-乙醯基神經氨酸-α-酮苷、5-溴-3-吲哚基-4,7-二甲氧基-N-乙醯基神經氨酸-α-酮苷、3-吲哚基-4,7-二甲氧基-N-乙醯基神經氨酸-α-酮苷、2-[4-(4-硝基苯基偶氮)苯基]-4,7-二甲氧基-N-乙醯基神經氨酸-α-酮苷、2-[4-(4-硝基苯基偶氮)間苯二酚基]-4,7-二甲氧基-N-乙醯基神經氨酸-α-酮苷、3-甲氧基苯基-4,7-二甲氧基-N-乙醯基神經氨酸-α-酮苷、3-二甲基氨基苯基-4,7-二甲氧基-N-乙醯基神經氨酸-α-酮苷、6-溴-2-萘基-4,7-二甲氧基-N-乙醯基神經氨酸-α-酮苷、4-氯-1-萘基-4,7-二甲氧基-N-乙醯基神經氨酸-α-酮苷、及其相應的4,7-二乙氧基、4,7-二丙基和4,7-二丁基衍生物。一般來說，優選的是4,7-二甲氧基衍生物。需要時，可使用「混合的」4,7-二烷氧基衍生物(如，4-甲氧基-7-乙氧基)。
顯色或螢光4,7-二烷氧基衍生物可用於臨床樣本中流行性感冒A型和B型病毒的診斷試驗。在本發明中被試驗的臨床樣本典型的是從患者或懷疑患有感冒的病人的咽、鼻或呼吸道收集的分泌物，諸如洗、拭抹或吐痰出來的樣本。洗出、吐痰或拭抹出的樣本在與底物混合前最好與含穩定劑的水性緩衝溶液混合。緩衝溶液一般含有將pH保持在約4-7，較好的是約5.5-6.5的緩衝劑，任選地有約0.1-10重量％非離子型洗滌劑、少量(1-20mM)鹼土金屬陽離子(Ca,Mg，優選的是Ca)和足量選自alditol、單糖、二糖的穩定劑以增加樣本中神經氨酸的熱穩定性。
與樣本結合的緩衝溶液的體積通常為0.1-2毫升。緩衝劑可為有機的或無機的。合適的緩衝劑包括，例如有機酸和其鹽的常規緩衝劑，如檸檬酸鹽緩衝劑(如，檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物等)、乙酸鹽緩衝劑(如乙酸-乙酸鈉混合物)、琥珀酸鹽緩衝劑(如，琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩衝液(如，酒石酸-酒石酸鹽混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、富馬酸鹽緩衝劑(如，富馬酸-富馬酸一鈉混合物、富馬酸-富馬酸二鈉混合物、富馬酸一鈉-富馬酸二鈉混合物)、葡糖酸鹽緩衝劑(如，葡糖酸-葡糖酸鈉混合物、葡糖酸-氫氧化鈉混合物、葡糖酸-葡糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩衝劑(如，草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩衝劑(如，乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)、乙酸鹽緩衝劑(如，乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)、馬來酸鹽緩衝劑(如，D,L-馬來酸-馬來酸二鈉混合物)、磷酸鹽緩衝劑(如，磷酸一鈉-磷酸二鈉混合物、磷酸一鈉-氫氧化鈉混合物、磷酸三鈉-鹽酸混合物等)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸、[二-(2-羥乙基)亞氨基]三(羥甲基)甲烷、N-2-乙醯氨基亞氨基二乙酸、1,3-雙[三(羥甲基)甲基氨基]丙烷、哌嗪-N,N』-2-乙磺酸、N-2-乙醯氨基-2-氨基乙磺酸、3-(N-嗎啉代)-2-羥基丙磺酸、3-(N-嗎啉代)丙磺酸、2-[三(羥甲基)甲基氨基]乙磺酸、N-2-羥乙基哌嗪-N,N』-2-乙磺酸、3-[三-(羥甲基)甲基氨基]-2-羥基丙磺酸。
用於緩衝溶液的非離子洗滌劑包括，例如，普盧蘭尼克(Pluronics)，諸如聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80、Triton X-100、NP-40，烷基葡萄糖苷，如C8和C9烷基葡萄糖苷。洗滌劑是任選的組份，可使神經氨酸酶從病毒包殼中釋放出來。用於緩衝溶液的穩定劑包括，如，三元羥基物或高級alditol，諸如，甘油、赤蘚醇、阿拉伯醇、木糖醇、山梨醇、甘露醇、己糖型葡萄糖和果糖和二糖。這些穩定劑可單獨使用或組合使用。為了穩定含神經氨酸酶病毒的活性，加入液體製劑/賦形劑系統的穩定劑量為0.2M-2.1M，較好的是0.6M-2.0M。一旦與緩衝溶液混合，樣本可較好地在2-8℃下儲存很長的時間而不會明顯失落神經氨酸酶的活性。
底物一般以0.05mM-0.5mM的量加入緩衝的、穩定的樣本中。使混合物在室溫到生理溫度(即約18-40℃)下培養足以使樣本中的神經氨酸酶與底物反應的時間。時間範圍通常為1分鐘到4小時，一般是5-120分鐘，更普通的是30-60分鐘。若樣本中有神經氨酸酶活性，標誌性或報告性基團從底物中釋放出來，釋放的標誌性或報告性沉澱物使混合物出現特徵性的顏色。對於光量衍生物，所得的反應混合物較好地被轉移到含多孔膜濾器和吸附墊的收集裝置裡以吸去溶液。這類收集裝置在我們的共同待批申請08/479,789(1995,6,7提交)中述及，在此併入供參考。在流行性感冒A型和B型神經氨酸酶的存在下，4,7-改性的Neu5Ac上的報告性基團通過神經氨酸酶的作用釋放，所得的報告性分子作為有色的沉澱物在多孔濾膜上得以收集。這類有顏色的產物的存在表示流行性感冒A型和B型陽性診斷；沒有這類有顏色的產物表示流行性感冒A型B型的診斷為陰性。濃縮或匯集有顏色的沉澱物增加了診斷試驗的靈敏度。但是，這類收集裝置不是實施本發明必不可少的。
下表指出了當神經氨酸酶與各種顯色或螢光4,7-改性Neu5Ac衍生物反應和釋放報告性分子時產生的特徵顏色。
釋放的報告性分子檢測類型顏色5-溴-4-氯-3-吲哚醇光量/肉眼 在硝基藍四唑鎓存在下為藍色/紫色5-溴-3-吲哚醇 光量/肉眼 在硝基藍四唑鎓存在下為藍色/紫色3-吲哚醇 光量/肉眼 在硝基藍四唑鎓存在下為藍色/紫色4-甲基-7-甲基香豆素 螢光度量 在360nm處激發後螢光在454nm處發射3-氰基-7-甲基香豆素 螢光度量 在415nm處激發後螢光在454nm處發射試滷靈光量/肉眼 粉紅/紅色2-硝基苯酚光量/肉眼 黃色4-硝基苯酚光量/肉眼 黃色硝基苯酚-偶氮苯酚 光量/肉眼 橙色硝基苯酚偶氮間苯二酚 光量/肉眼 藍綠色(有Mg++存在)3-甲氧基苯酚 光量/肉眼 與重氮化鹽反應後為紅色到藍色3-二甲基氨基苯酚光量/肉眼 與重氮化鹽反應後為紅色到藍色4-氯-1-萘酚 光量/肉眼 與重氮化鹽反應後為紅色到藍色6-溴-2-萘酚 光量/肉眼 與重氮化鹽反應後為紅色到藍色本發明的顯色和螢光4,7-二烷氧基Neu5Ac衍生物僅在流行性感冒A型和B型病毒存在時顯示出特徵顏色。它們在副流行性感冒1型、2型、3型和4型病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒和/或腺病毒存在時不顯示特徵性的顏色(即不釋放報告性分子)。此外，顯色和螢光的4,7-二烷氧基Neu5Ac衍生物不顯示出細菌神經氨酸酶反應活性。為了保持所需的選擇性程度，4,7-二烷氧基Neu5Ac衍生物應當基本沒有相應的4-烷氧基Neu5Ac衍生物。使選擇性可接受的4-烷氧基Neu5Ac衍生物的最大水平可用各種類型病毒的已知菌株進行實驗測定。一般來說，4-烷氧基Neu5Ac衍生物的水平應當低於約5重量％，最好低於約0.5重量％。
在單個試驗中通過組合存在的顯色和螢光4,7-二烷氧基Neu5Ac衍生物和顯色和螢光4-烷氧基Neu5Ac衍生物的神經氨酸酶反應活性和選擇性可得到更富信息性的診斷試驗。在這類系統中，臨床樣本被劃分成兩個部分，它們依次分別與4,7-二烷氧基和4-烷氧基Neu5Ac衍生物培養。在兩個培養樣本中存在和/或沒有特徵顏色可用來更準確地決定病毒類型是否在臨床樣本中存在。若臨床樣本中只存在流行性感冒A型或B型病毒，則4-烷氧基和4,7-二烷氧基衍生物都顯示出其報告性分子的特徵顏色。如流行性感冒A型或B型病毒和非流行性感冒A型和B型病毒的神經氨酸酶反應活性病毒都存在時，每個部分都顯示出其報告性分子的特徵顏色。若只有非流行性感冒A型和B型病毒的神經氨酸酶反應活性病毒在臨床樣本中存在，則只有4-烷氧基衍生物顯示出其報告性分子的特徵顏色。若臨床樣本中沒有神經氨酸酶反應活性病毒存在，則兩個部分都沒有其報告性分子的特徵顏色存在。
因此，本發明提供了用來選擇性診斷流行性感冒，特別是A型和B型，的簡單和快速技術，它可在病房裡或醫生的辦公室裡進行，使醫生能給予合適的方案來治療傳染病和/或對與傳染病患者密切接觸的人給予合適的預防性處理。
下列實施例僅用來敘述本發明。
實施例1
用流程1顯示的反應來合成4,7-二甲氧基-Neu5Ac。異亞丙烷衍生物1(1.2克)在約10毫升無水乙腈中的冰冷溶液(冰浴溫度)用氮氣飽和。加入氫化鈉(270毫克；80％在油中的分散液)，讓混合物攪拌20分鐘。加入硫酸二甲酯(1毫升)，再攪拌10分鐘，用冰浴冷卻混合物。所得的混合物經硅藻土過濾，沉澱用無水乙腈洗滌。蒸發濾液，乾燥殘留物，用丙酮萃取。過濾後，再蒸發濾液。乾燥所得的殘留物，在矽膠上經色譜層析。用二氯甲烷/甲醇(25∶1)洗脫以除去一些副產物。繼續用相同的溶劑系統洗脫得到含2和3的漿狀物，用丙酮-己烷結晶。收集到晶體2(177毫克)。濾液含2和3(約1∶1)的混合物，但3的比例比原始混合物的高。
含3(1.22克)的濾液用80％乙酸水溶液(15毫升)在85℃下處理一小時。蒸發混合物並與水共蒸發。殘留物經色譜層析。用二氯甲烷/甲醇(5∶1)洗脫以除去少量副產物。繼續用相同的溶劑系統洗脫得到部分去保護的產物4(0.87克；80％得率)。
在室溫下用1M在甲醇(5毫升)和水(5毫升)中的氫氧化鈉(3毫升)處理4,7-二甲氧基甲酯甲基酮苷(4)(0.87克)達1小時。混合物用Dowex 50(H+)樹脂中和；經過濾除去樹脂並用甲醇洗滌。蒸發合併的濾液。殘渣用在0.025M鹽酸中的Dowex 50(H+)樹脂(1.5克)在100℃下處理兩小時。過濾除去樹脂，收集和蒸發濾液。殘留物經真空乾燥得到基本純的4,7-二甲氧基-Neu5Ac(5)(0.71克；88％得率)。
實施例2根據反應流程2所示的反應合成5-溴-3-吲哚基-4,7-二甲氧基-Neu5Ac。用在甲醇(25毫升)中的三氟乙酸(0.2毫升)在室溫下對化合物5(1.0克)處理過夜。蒸發混合物。乾燥殘留物，用在二氯甲烷(5毫升)中的乙醯氯(5毫升)處理。反應混合物在室溫下攪拌過夜，然後蒸發。乾燥殘留物得到粗製的氯化物6(1.36克)。粗製物6由於其不穩定性而不經進一步純化。
粗製物6(0.7克)和1-乙醯基-5-溴-吲哚-3-醇(0.26克)在丙酮(5毫升)中的懸浮液用氮氣飽和。加入1M氫氧化鈉溶液(1毫升)。在氮氣下使反應混合物攪拌1小時。蒸發後，乾燥殘留物，並經矽膠色譜層析。用二氯甲烷/甲醇(25∶1)洗脫以除去未反應的色原體(0.128克)。用相同的溶劑系統持續洗脫得到主要含偶合產物7(0.114克)的組份。偶合產物7(0.114克)在室溫下用1M在甲醇(0.1毫升)中的甲醇鈉處理30分鐘。用Dowex 50(H+)樹脂中和後，除去樹脂並用甲醇洗滌。蒸發合併的濾液。乾燥殘留物，在矽膠上經色譜層析。匯合併蒸發主要含偶合產物8的組份得到約60毫克8。
在室溫下用在50％甲醇水溶液(5毫升)中的1M氫氧化鈉(0.5毫升)處理偶合產物8達30分鐘。混合物用Dowex 50(H+)樹脂中和。過濾除去樹脂，用甲醇洗滌。蒸發合併的濾液，殘留物經HPLC純化。第一組份含未偶合的產物。偶合物質為寬峰，它由偶合的4-甲氧基-Neu5Ac和偶合的4,7-二甲氧基-Neu5Ac產物9構成。由於微量的偶合4-甲氧基衍生物會使診斷分析不具特異性，只匯合含高純度9的組份。蒸發時收集高純度9(4毫克)；收集物質含低於約5重量％相應的4-烷氧基衍生物。
實施例3該實施例顯示了實施例2的5-溴-3-吲哚基-4,7-二甲氧基-Neu5Ac(9)在流行性感冒A和B的培養病毒的診斷試驗中的特異性。用合適的細胞系、培養基和適合具體病毒生長和培養的培養條件，從病人的分離物或冷凍儲存培養物使病毒生長。使用了下列細胞(1)對於流行性感冒和副流行性感冒病毒使用RMK(恆河猴腎)細胞；(2)對於呼吸道合胞病毒和腺病毒使用HEp-2(人體喉頭癌)細胞；和(3)對於腮腺炎用VERO(非洲綠猴腎)細胞。在37℃下所有細胞在具有5-10％血清的最小必須培養基的試管或燒瓶中幾乎匯合成單層。在合適的細胞系中在37℃下用沒有血清的最小必須培養基中進行病毒感染。
監測被病毒感染的培養物並通過特徵性的合胞作用和用病毒類型特異單克隆抗體進行免疫螢光試驗來觀察。對於每個病毒觀察到下列特徵性的合胞作用(1)流行性感冒A和B大面積，不規則的顆粒狀或有空泡的細胞，細胞單層具有進行性退化；(2)副流行性感冒1細胞單層貫穿了小圓細胞；(3)副流行性感冒2從細胞單層上縮的黑色、顆粒狀和不規則的合胞；(4)副流行性感冒3伸長融合的細胞，它從細胞單層中均勻退縮和離開；(5)呼吸道合胞病毒大、不規則形狀的合胞，其外觀好象是大的多核細胞，整個細胞單層具有不可區分的邊界；(6)腺病毒大、圓的緻密細胞，它均勻地聚合成圓細胞片並附著在培養瓶上；和(7)腮腺炎具有空泡的合胞，整個細胞單層細胞退化。市售的病毒類型特異單克隆抗體被用於螢光分析以確認培養物中每個病毒的生長。來自感染培養物的細胞被甲醇固定在玻璃片上或蓋玻片上，然後在37℃下用螢光素標記的單克隆抗體培養。使用直接或間接的螢光分析。對於直接分析，固定的病毒感染的細胞用病毒類型特異的螢光素異硫氰酸酯(FITC)標記的單克隆抗體培養30分鐘。對於間接分析，固定的、病毒感染的細胞用病毒類型特異的、未標記的單克隆抗體培養30分鐘，然後再用輔助的FITC-標記的單克隆抗體培養30分鐘。玻璃片或蓋玻片用載片培養基覆蓋，用螢光顯微鏡檢查。有特徵的、病毒特異的、蘋果綠菌株的存在表示陽性病毒結果。進行性和特徵性細胞病原作用的存在(和伴隨的特定病毒用螢光分析確認)是特定培養的病毒繁殖最快的徵兆。
在得到最大的病毒生長和確認有合適病毒存在後，從收穫培養的液體，用4-甲氧基-N-乙醯基神經氨酸和4,7-二甲氧基-N-乙醯基神經氨酸顯色底物評估。含病毒的培養液(0.1毫升)與在含賦形劑和緩衝劑以使pH和神經氨酸酶活性最佳的1毫升或2毫升溶液中的顯色底物混合。緩衝劑/賦形劑溶液含具有10mM氯化鈣、0.85％氯化鈉、0.1％甘露醇、0.5％甲醇和0.1％羥苯甲酯的35mM馬來酸/馬來酸鹽緩衝液。底物與pH約5.4的緩衝劑混合以提供對產生神經氨酸酶病毒進行監測，對於不產生神經氨酸酶病毒和陰性病毒培養物具有清楚的陰性結果。
使試驗溶液在37℃下培養約1小時，通過加入0.2毫升緩衝劑濃縮物將pH改變為約為9來中止反應，並幫助增加所釋放的顯色物質的沉澱。完成的反應混合物然後轉移到含選擇性多孔濾膜和吸收墊的收集設備中以吸去溶液，從而使沉澱物濃縮。收集裝置在我們共同待批專利申請08/479,789(1995年6月7日提交)中揭示。出現合適顏色的沉澱物表示是陽性反應，而沒有這類合適顏色的沉澱物表示陰性反應。使用5…溴-3-吲哚基顯色物，陽性試驗的沉澱物的特徵顏色為藍色。
用這些各種病毒培養物得到下列結果。病毒培養物生長到其最大的滴度(通過多方面觀察…約90到100％…在細胞片中有病毒特徵的細胞病原作用，和對大多數細胞進行螢光分析有蘋果綠、病毒特異的著色進行確證)以保證任何反應差異不是由於不可監測的病毒濃度產生的。
根據反應顏色的強度作出的1+到3+的分級用來表示可監測到的神經氨酸活性的相對水平。分級顏色與來自標準參照源(The PantoneColorSpecific Book 747XR)的顏色樣本相配。1+(淡顏色)表示低陽性，2+(中等顏色)表示中等陽性，3+(深顏色)表示高陽性。沒有特徵顏色表示為陰性。若肉眼觀察到極為暗淡的特徵顏色或提示有特徵顏色，則表示不確定的結果。
從這些結果可見，含流行性感冒A型和B型神經氨酸酶的病毒為與未稀釋的4-甲氧基-Neu5Ac和4,7-二甲氧基-Neu5Ac底物和所有稀釋試驗中給出陽性反應的僅有的試驗微生物。對於副流行性感冒1、2和3型病毒和腮腺炎病毒，4-甲氧基-Neu5Ac底物根據稀釋情況給出陰性和陽性反應。副流行性感冒1型、2型和3型及其腮腺炎病毒與4,7-二甲氧基-Neu5Ac底物不論是未稀釋或稀釋時都是陰性的。含非神經氨酸酶病毒(即呼吸道合胞病毒和腺病毒)與兩個底物都產生陰性結果。當然，沒有病毒的陰性對照也是陰性的。這些結果清楚地顯示出4,7-二烷氧基-N-乙醯基神經氨酸顯色底物對流行性感冒A型和B型病毒的特異性。
實施例4用5-溴-4-氯-吲哚-3-醇和4-甲基-7-羥基香豆素作為4-甲氧基-Neu5Ac和4,7-二甲氧基-Neu5Ac的報告性分子時得到與實施例3相似的結果。
預期本技術領域的人員在考慮到前述本發明的詳述後，對實施本發明可有許多種修飾和改變。結果這類修飾和改變也在下列權利要求書的範圍裡。
權利要求
1．一種對來自懷疑有呼吸道病毒感染的個體的臨床樣本檢測流行性感冒A和B型病毒的方法，所述的方法包括(1)將臨床樣本分成第一部分和第二部分；(2)使第一部分與下式的顯色或螢光4,7-二烷氧基N-乙醯基神經氨酸第一底物培養 其中R1和R2是含1-4個碳原子的烷基，R3是當從第一底物或第一底物的鹽上裂解下來後出現明顯的和特徵性顏色的第一顯色或螢光基團；(3)觀察培養的第一部分以決定是否形成了第一明顯和特徵性的顏色，其中第一明顯和特徵性顏色的形成表示在臨床樣本中有流行性感冒A或B型病毒的存在；(4)使第二部分與下式的顯色或螢光4，7-二烷氧基N-乙醯基神經氨酸第二底物培養 其中R4是含1-4個碳原子的烷基，R5是當從第二底物或第二底物的鹽上裂解下來後出現明顯和特徵性顏色的第二顯色或螢光基團；(5)觀察培養的第二部分以決定是否形成了第二明顯和特徵性的顏色，其中第二明顯和特徵性顏色的形成表示在臨床樣本中有流行性感冒A或B型病毒的存在；其中第一和第二顏色的存在表示在臨床樣本中單有流行性感冒A型或B型病毒或有與非流行性A型或B型病毒的神經氨酸酶反應活性病毒組合的存在；其中有第二顏色但沒有第一顏色表示在臨床樣本中有非流行性感冒A型和B型病毒的神經氨酸酶反應活性病毒；和沒有第一和第二顏色表示臨床樣本中沒有神經氨酸酶反應活性病毒。
2．根據權利要求1所述的方法，其中R1和R2是甲基，R3是第一顯色基團。
3．根據權利要求2所述的方法，其中R4是甲基，R5是第二顯色基團。
4．根據權利要求2所述的方法，其中R3和R4獨立地選自4-甲基-7-羥基-香豆素、3-氰基-7-羥基香豆素、2-硝基苯基、4-硝基苯基、3-試滷靈、5-溴-4-氯-3-吲哚基、5-溴-3-吲哚基、3-吲哚基、硝基苯基偶氮苯基、硝基苯基偶氮間苯二酚基、3-甲氧基苯基、3-二甲基氨基苯基、4-氯-1-萘基和6-溴-2-萘基。
5．根據權利要求4所述的方法，其中R3是5-溴-3-吲哚基。
6．根據權利要求3所述的方法，其中R3和R4獨立地選自4-甲基-7-羥基-香豆素、3-氰基-7-羥基香豆素、2-硝基苯基、4-硝基苯基、3-試滷靈、5-溴-4-氯-3-吲哚基、5-溴-3-吲哚基、3-吲哚基、硝基苯基偶氮苯基、硝基苯基偶氮間苯二酚基、3-甲氧基苯基、3-二甲基氨基苯基、4-氯-1-萘基和6-溴-2-萘基。
全文摘要
本發明提供了一種對來自懷疑有呼吸道病毒感染的個體的臨床樣本檢測流行性感冒A和B型病毒的方法,包括將臨床樣本分成第一部分和第二部分;使第一部分與下式的第一底物一起培養;使第二部分與下式的第二底物一起培養;根據培養後顯示的顏色不同來檢測病毒的存在。第一底物第二底物如圖所示。
文檔編號C07H17/00GK1324954SQ0111669
公開日2001年12月5日 申請日期2001年4月18日 優先權日1996年9月25日
發明者A·利亞弗, J·A·漢斯傑根, C·D·島嶼 申請人:俄克拉何馬州醫學研究基金會