一種新型含香豆素螢光基團透明質酸衍生物的製備方法

2023-09-14 01:47:25 1

專利名稱：一種新型含香豆素螢光基團透明質酸衍生物的製備方法
技術領域：
本發明涉及於製備一種新型含香豆素透明質酸衍生物的方法，屬於生物化學技術 領域。
背景技術：
透明質酸(hyaluronic acid，hyaluronan，HA)又名透明酸或玻璃酸是一種酸性黏 多糖，最早是由美國 Meyer (Meyer K, Palmer J W. The polysaccharide of the vitreous humor [J]. J. Biol. Chem. 1934，107 :629_634.)等從牛眼玻璃體中分離出來。HA是由 β-D-N-乙醯氨基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸為結構單元的以β-1，3和β-1，4-糖苷鏈 交替連接而成的一種直鏈線型陰離子粘多糖。對不同組織來源的HA進行的結構測定表 明，其結構均一致，沒有種屬差異，只存在相對分子量的不同，範圍為IO5-IO7,雙糖單位數為 300-1100對。其結構如結構式1所示
formula see original document page 3結構式1HA廣泛存在於動物和人體結締組織細胞間質中，在眼玻璃體、皮膚、臍帶、軟骨和 關節滑液中含量較高。HA因其高度的黏彈性、獨特的保溼性、優良的生物相容性和可降解 性，已被廣泛應用於臨床醫學和高級化妝品。在醫學領域，HA被廣泛應用於關節疾病、眼科 手術、預防術後粘連、治療燙傷以及作為藥物傳遞系統的媒介和藥用輔料等。透明質酸及其 衍生物作為藥物載體，主要利用其良好的生物相容性和可降解性、高粘彈性以及與細胞表 面特異受體專一性結合的能力，以達到藥物增稠、藥物緩釋、促進藥物透皮能力及靶向性的 目的(李奇，王鳳山等.中國藥學雜誌，2005，40 (7) :485-488)。天然HA具有諸多有點，但是對強酸、強鹼、熱、自由基及透明質酸酶敏感(Lapcik LJr, Lapcik L，De Smedt S, et al. Chemical Reviews, 1998,98(8) :2663_2684)，容易發生 降解，而限制其作為藥物載體的應用。同時，透明質酸作為藥物載體，因為透明質酸作為天 然高分子在滑液中大量存在，作為藥物載體的透明質酸在人體中傳輸機理與人體滑液中存 在的天然透明質酸之間由於一定的相似性，很難區分，為了克服這些缺點，在保留透明質酸 優良特性的前提下，有必要通過化學改性以提高其穩定性及其他性能，同時對透明質酸的 活性部分進行適當的修飾，引入具有藥物活性或非活性無毒的螢光基團，並利用螢光光譜 等分析技術研究透明質酸螢光衍生物對藥物的包覆作用和藥物釋放作用及作為藥物載體 的透明質酸螢光衍生物在模擬體液中的穩定性。透明質酸可進行化學修飾的4個部位分別為羥基、N-乙醯基、羧基以及還原 末端(胡幗穎，顧漢卿.透明質酸交聯、酯化衍生物的製備及醫學應用進展[J].透析與人工器官，2003，14(3) :30-46.)，其中末端修飾較少見。主要修飾方法有酯化、醚化(P. Mlcochova, V. Hajkova, B.Steiner. Preparation and characterization of biodegradable alkylether derivatives ofhyaluronan[J]. Carbohydrate Polymers, 2007,69 :344-352.)、交聯、接枝等。經過改性後形成的HA衍生物，可賦予新的特性。對於我們提出的含香豆素透明質酸衍生物的合成未見文獻報導。

發明內容
本發明採用醫用透明質酸鈉(Mw 2. OX IO6)和具有螢光性質的香豆素衍生物反 應，對透明質酸鈉的羥基部位進行化學改性，以便賦予透明質酸螢光性能，根據不同的反應 時間和不同的反應溫度製備出不同取代度的香豆素透明質酸衍生物，為下一階段螢光示蹤 法研究動物體內藥物傳輸機理研究提供實驗基礎。本發明所解決的關鍵問題是提供製備含香豆素螢光基團透明質酸衍生物的方法。本發明的合成路線圖如下反應式1所示
H。成 J 一。廣滅^
123
QH3
R: H or -^^γ^ο'^^ο'^ο) OH反應式1為解決上述技術問題，所採用的具體方案如下首先以7-羥基-4-甲基香豆素為原料經過醚化反應得到環氧丙烷取代的香豆素， 然後將其再與透明質酸鈉通過醚化反應製備出含有香豆素單元的透明質酸衍生物；其中所 述7-羥基-4-甲基香豆素與環氧丙烷的摩爾比為1 12. 75 ；透明質酸鈉和香豆素衍生物 的摩爾配比為1 3-1 20;反應後的混合液裝入透析袋內，透析時間為72h，然後用無水 乙醇沉析、冷凍乾燥得到目標產物；其中所述的透明質酸鈉，具有2，800, OOODa的平均分子 量其中所述的反應體系的pH為8-12 ；其中所述所用的溶劑為二甲亞碸和水的混合溶劑，且二甲亞碸和水的體積比為 4:1;其中所述反應溫度30°C _40°C，反應時間為20h_50h，優選反應時間均為40h。本發明的有益效果是通過將香豆素螢光基團引入到難以檢測的透明質酸上，在 保留透明質酸的天然結構的同時，又賦予其螢光性能，為透明質酸在動物或人體內相應的 藥物代謝和藥理等多方面的研究提供了實驗基礎。


其中圖1為透明質酸Na-HA的1H匪R(500MHz，D20)譜圖；圖2為40°C透明質酸香 豆素衍生物3的1H NMR (500MHz, D2O)譜。
具體實施例方式本發明以4-甲基-7-羥基香豆素1為起始原料經過醚化反應先生成7-甲氧 基-4-甲基香豆素-1，2-環氧丙烷2，然後將其與透明質酸鈉(Mw 2. 8 X IO6)經過醚化反 應，製備含有香豆素結構單元的透明質酸衍生物3。純化後含環氧結構的香豆素2的1H 匪R(DMS0-d6)為δ 7. 71(d，J = 8. 8Hz，1H, Ar-H), 7. 02 (s, 1Η, Ar-H), 7. 01 (d, J = 8. 8Ηζ, 1Η, Ar-H) ,6. 22 (s, 1Η, CH)，4. 48 (dd，J = 10. 0，2. 5Hz，1Η，ArOCH2), 3. 96 (dd, J = 10.0， 5. OHz, 1Η, ArOCH2)，3. 37 (s, 1Η, 0CH)，2. 86-2. 88 (m, 1Η, OCH2)，2. 73-2. 74 (m, 1Η, OCH2)， 2. 40(s，3H，CH3)。我們同時做了透明質酸的1H NMR(D2O-Cl6)如圖1。這樣我們可以通過最終 透明質酸產物1H NMR中2. Oppm處乙醯胺上的甲基與所含香豆素結構單元2. 45ppm處甲基 的積分比計算出產物3中每個透明質酸結構單元中香豆素基團的取代度。我們考察了不同 溫度下製備透明質酸衍生物3的反應情況(見具體實施例)，不同溫度下通過將反應液後經 乙醇沉析處理得到產品的1HN MR圖可知，在25°C下透明質酸的醚化反應沒有發生，在30°C 下有透明質酸香豆素衍生物3生成，但在低場芳環附近的氫質子的積分為負值，可能是由 於產物中香豆素取代度太少造成的；在35°C下生成的透明質酸衍生物香豆素單元的取代 度約為3. 9% ；而在40°C下生成的透明質酸衍生物香豆素單元的取代度為5. 2% (圖2)。香豆素衍生物2的合成方法將3. 5g(20mmol)羥甲基香豆素置於裝有空氣冷凝管、恆壓滴液漏鬥和溫度計的 250mL的三口瓶中，加入IOOmL無水乙醇和5mL水溶解的1. 4g(25mmol)KOH的水溶液，攪拌 30min.。向該體系中滴加20mL環氧氯丙烷(255mmol)，滴加完畢後，將體系升溫到60°C， 反應 3h(詳細參考 Y L Chen, C M Lu, S J Lee, et al. Synthesis, antiproliferative, andvasorelaxing evaluations of coumarin α -methylene-y-butyrolactones[J]. BioorRanic & MedicinalChemistry，2005，20 (13) :5710_5716.)。將反應液倒入 IOOOmL 燒 杯中，往燒杯中不斷加入水直至不再析出白色沉澱為止。過濾收集濾餅，然後用無水乙醇重 結晶得白色固體4-甲基-7-(2，3-環氧丙氧基)香豆素2.62g，產率為56%。實施例125mL圓底燒瓶中加人0. lg(0. 25mmol)透明質酸鈉，然後加入12mL 二甲亞碸和 3mL水，強磁力攪拌使透明質酸鈉溶解，逐滴加入0. IM NaOH溶液使混合溶液的pH = 8-12, 然後加入0. 173g(0. 75mmol),4-甲基_7_(2，3-環氧丙氧基)香豆素，反應在30°C反應20h。 將反應混合液裝入透析袋內透析72h，透析液用乙醇沉析得白色固體，將固體冷凍真空乾燥 後用1H NMR進行表徵，通過比較2. Oppm(3H, -NHCOCH3)和2. 45ppm(3H，所引入的香豆素基 團上的-CH3)的信號計算出產物的取代度為1.8%。實施例225mL圓底燒瓶中加人0. lg(0. 25mmol)透明質酸鈉，然後加入12mL 二甲亞碸和 3mL水，強磁力攪拌使透明質酸鈉溶解，逐滴加入0. IM NaOH溶液使混合溶液的pH = 8-12, 然後加入0. 173g(0. 75mmol)香豆素衍生物2，反應在30°C反應30h。將反應混合液裝入透 析袋內透析72h，透析液用乙醇沉析得白色固體，將固體冷凍真空乾燥後用1HNMR進行表徵， 通過比較2. Oppm(3H, -NHCOCH3)和2. 45ppm(3H，所引入的香豆素基團上的-CH3)的信號計 算出產物的取代度為2.4%。實施例3
25mL圓底燒瓶中加人0. lg(0. 25mmol)透明質酸鈉，然後加入12mL 二甲亞碸和 3mL水，強磁力攪拌使透明質酸鈉溶解，逐滴加入0. IM NaOH溶液使混合溶液的pH = 8-12, 然後加入0. 173g(0. 75mmol)香豆素衍生物2，反應在30°C反應40h。將反應混合液裝入透 析袋內透析72h，透析液用乙醇沉析得白色固體，將固體冷凍真空乾燥後用1HNMR進行表徵， 通過比較2. Oppm(3H, -NHCOCH3)和2. 45ppm(3H，所引入的香豆素基團上的-CH3)的信號計 算出產物的取代度為3.6%。實施例425mL圓底燒瓶中加人0. Ig(0. 25mmol)透明質酸鈉，然後加入12mL 二甲亞碸 和3mL水，強磁力攪拌使透明質酸鈉溶解，逐滴加入0. IM NaOH溶液使混合溶液的pH = 8-12，然後加入香豆素衍生物2，反應在30°C反應50h。將反應混合液裝入透析袋內透析 72h，透析液用乙醇沉析得白色固體，將固體冷凍真空乾燥後用1HNMR進行表徵，通過比較 2. Oppm(3H,-NHCOCH3)和2. 45ppm(3H，所引入的香豆素基團上的-CH3)的信號計算出產物的 取代度為3.4%。實施例525mL圓底燒瓶中加人0. Ig(0. 25mmol)透明質酸鈉，然後加入12mL 二甲亞碸 和3mL水，強磁力攪拌使透明質酸鈉溶解，逐滴加入0. IM NaOH溶液使混合溶液的pH = 8-12，然後加入香豆素衍生物2，反應在35°C反應40h 。將反應混合液裝入透析袋內透析 72h，透析液用乙醇沉析得白色固體，將固體冷凍真空乾燥後用1H NMR進行表徵，通過比較 2. Oppm(3H,-NHCOCH3)和2. 45ppm(3H，所引入的香豆素基團上的-CH3)的信號計算出產物的 取代度為4.7%。實施例625mL圓底燒瓶中加人0. lg(0. 25mmol)透明質酸鈉，然後加入12mL 二甲亞碸和 3mL水，強磁力攪拌使透明質酸鈉溶解，逐滴加入0. IM NaOH溶液使混合溶液的pH = 8-12, 然後加入0. 173g(0. 75mmol)香豆素衍生物2，反應在40°C反應40h。將反應混合液裝入透 析袋內透析72h，透析液用乙醇沉析得白色固體，將固體冷凍真空乾燥後用1HNMR進行表徵， 通過比較2. Oppm(3H, -NHCOCH3)和2. 45ppm(3H，所引入的香豆素基團上的-CH3)的信號計 算出產物的取代度為5.2%。
權利要求
一種製備新型透明質酸香豆素衍生物的方法，其特徵在於首先以7-羥基-4-甲基香豆素為原料經過醚化反應得到環氧丙烷取代的香豆素，然後將其再與透明質酸鈉通過醚化反應製備出含有香豆素單元的透明質酸衍生物；其中所述7-羥基-4-甲基香豆素與環氧丙烷的摩爾比為1∶12.75；透明質酸鈉和香豆素衍生物的摩爾配比為1∶3-1∶20；其中所述反應溫度30℃-40℃，反應時間為20h-50h；其中所述的反應體系的pH為8-12；其中所述所用的溶劑為二甲亞碸和水的混合溶劑，且二甲亞碸和水的體積比為4∶1；反應後的混合液裝入透析袋內，透析時間為72h，然後用無水乙醇沉析、冷凍乾燥得到目標產物。
2.根據權利要求1所述的一種製備新型透明質酸香豆素衍生物的方法，其特徵在於其 中所述的透明質酸鈉具有2，800, OOODa的平均分子量。
3.根據權利要求1所述的一種製備新型透明質酸香豆素衍生物的方法，其特徵在於其 中所述的反應時間均為40h。
全文摘要
本發明涉及一種新型含香豆素透明質酸衍生物的合成方法，該方法以4-甲基-7-羥基香豆素為起始原料經過醚化反應先生成7-甲氧基-4-甲基香豆素-1，2-環氧丙烷，然後將其與透明質酸鈉經過醚化反應，製備含有香豆素結構單元的透明質酸衍生物；反應後的混合液裝入透析袋內，透析時間為72h，然後用無水乙醇沉析、冷凍乾燥得到目標產物。本發明的有益效果是通過將香豆素螢光基團引入到難以檢測的透明質酸上，在保留透明質酸的天然結構的同時，又賦予其螢光性能，為透明質酸在動物或人體內相應的藥物代謝和藥理等多方面的研究提供了實驗基礎。
文檔編號C09K11/06GK101831006SQ20101018040
公開日2010年9月15日 申請日期2010年5月21日 優先權日2010年5月21日
發明者任振, 孫小強, 席海濤, 繆春寶 申請人:常州大學