水稻葉片直接用於聚合酶鏈式反應的方法
2023-09-14 17:58:00 1
專利名稱：水稻葉片直接用於聚合酶鏈式反應的方法
技術領域：
本發明涉及一種水稻葉片經鹼處理後直接作為模板用於聚合酶鏈式反應的方法。
自從1980年Batstein等首次描述限制性片段長度多態性分析(RFLP)作為一種DNA分子標記後，隨著分子生物學技術的發展，產生了多種基於聚合酶鏈式反應的分子標記技術，如隨機擴增長度多態性(RAPD)、擴增片段長度多態性(AFLP)以及簡單重複序列(SSR)分析等。這些標記技術可以用於種屬特異性鑑定、外源導入基因的追蹤、基因定位、遺傳作圖及基因分離等方面。這些標記技術的第一步即需提取待檢樣品的基因組DNA，用核酸定量分析確定提取的DNA濃度，取適量的DNA作為模板，再進行相應的聚合酶鏈式(PCR)反應。常規的水稻葉片提取DNA需相關的有機及生化試劑和冷凍高速離心機等較昂貴的儀器設備，且提取一份樣品的時間較長，工作量較大(盧揚江、鄭康樂，中國水稻科學，1992，6(1)47-48)，尤其是在利用聚合酶鏈式反應進行物種種性鑑定及輔助田間育種時，因檢測的樣品量多，用常規方法提取基因組DNA更顯得費時費力且成本高。
本發明創造性地應用鹼處理水稻葉片直接作為PCR反應模板，並結合改進PCR反應條件和反應程序，其目的在於創立一種快速、有效、簡便地進行植物DNA擴增的新方法。
本發明的具體內容是
1．水稻葉片的鹼處理剪取若干片水稻葉片(後稱葉片)，每片長1～2cm。將葉片投入盛有0．2～0．3mol／L NaOH的離心管中，於沸水中煮20～35秒；取出離心管並向離心管內加入等當量的HCl和一定量的0．5mol／L Tris-HCl溶液(pH8．0)，搖勻後再於沸水中孵育1～3分鐘。取出葉片，便可作為模板直接用於PCR反應。
2．以鹼處理葉片直接作為模板的PCR反應本PCR反應同樣需要在DNA擴增儀上進行設置的變性、退火、延伸若干個循環，PCR反應產物經瓊脂糖凝膠電泳、染色、觀察及拍照記錄。所不同的是鑑於模板不一樣，反應時所使用的PCR反應緩衝液有別於常規使用的緩衝液。本發明所使用的PCR反應緩衝液為10～20mmol／L(NH4)2SO4、1．5～3．0mmol／L MgCl2、50～80mmol／LTris-HCl(pH8．8)。
本發明用鹼處理葉片替代提取待測植株葉片基因組DNA作為PCR反應的模板，在作物品種種性和純度鑑定以及輔助田間育種材料的選育中，使檢測所需的時間大大縮短、實驗成本大幅度降低，例如，300份待測樣品的檢測工作一名技術人員在一天內即可完成。本方法不僅快速、簡便，而且結果清晰、重複性好、準確可靠、對待測植株的損傷較小，是育種工作者所希望的、也是可以接受的一種分子標記的分析體系。
圖1a、
圖1b是本發明應用於品種種性鑑定結果。圖2a、圖2b和圖2c是本發明應用於轉基因材料的追蹤和輔助田間育種分析結果。
非限定實施例敘述如下一、水稻葉片的鹼處理1．剪取水稻葉片(3葉期最佳)1～2cm，放入含200μl 0．2mol／LNaOH的離心管中，將此離心管插入沸水中煮35秒，取出加入200μl0．2mol／L HCl和100μl0．5mol／L Tris-HCl(pH8．0，含0．25％(v／v)Non-idet P40)，再次將該管放入沸水中孵育3分鐘，最後挑取一片(約2mm2)經過上述鹼處理的葉片直接作為PCR反應的模板。
2．剪取水稻葉片(3葉期最佳)1～2cm，放入含200μl 0．25mol／LNaOH的離心管中，將此離心管插入沸水中煮30秒，取出加入200μl0．25mol／L HCl和100μl 0．5mol／L Tris-HCl(pH8．0，含0．25％(v／v)Nonidet P40)，再次將該管放入沸水中孵育2分鐘，最後挑取一片(約2mm2)經過上述鹼處理的葉片直接作為PCR反應的模板。
3．剪取水稻葉片(3葉期最佳)1～2cm，放入含200μl 0．3mol／LNaOH的離心管中，將此離心管插入沸水中煮35秒，取出加入200μl0．3mol／L HCl和100μl0．5mol／L Tris-HCl(pH8．0，含0．25％(v／v)Non-idet P40)，再次將該管放入沸水中孵育1分鐘，最後挑取一片(約2mm2)經過上述鹼處理的葉片直接作為PCR反應的模板。
二、用鹼處理的水稻葉片直接作為模板的PCR反應4．配製PCR反應緩衝液。PCR反應緩衝液的成份及濃度如下10～20mmol／L(NH4)2SO4、1．5～3．0mmol／L MgCl2和50～80mmol／LTris-HCl(pH8．8)。
5．PCR反應。每20μl PCR反應中加入2μl上述緩衝液，並加入200mmol／L dNTP，各10pmol的PCR正、反向引物，2u的Taq DNA聚合酶及約2mm2鹼處理葉片，最後用無菌雙蒸餾水定量至20μl。在PE9600型DNA擴增儀(美國產)上進行擴增，反應程序為95℃1分鐘變性後按94℃30秒、55℃30秒、72℃1分鐘設置40個循環。PCR反應產物在1．4％的瓊脂糖凝膠上電泳1．5小時(5v／cm)，以EcoRI+HindIII酶切的λDNA為分子量標記，溴化乙錠染色，紫外光下觀察、拍照記錄。
三、利用鹼處理葉片直接作為模板進行PCR反應用於品種種性的鑑定。
選用水稻雜交組合汕優63及其相應的三系珍汕97A、珍汕97B、明恢63種子(由安徽省農業科學院水稻研究所提供)。供試種子在26℃發芽至三葉期。剪切1～2cm長的葉片經前述的鹼處理後直接作為PCR反應的模板。同時，作為對照，按常規方法(盧揚江、鄭康樂，中國水稻科學，1992，6(1)47-48)對應地提取水稻基因組DNA，定量後取50ng作為PCR反應的模板。
PCR反應的引物由本實驗自行設計、合成(楊劍波、汪秀峰、李莉等，中華人民共和國發明專利申請公開說明書，專利文獻出版社，CN1237328A；向太和、汪秀峰、李莉等，作物學報，2000，26(3)292-296)，具體見表1。PCR反應如實施例4～5所述。
表1 PCR引物及檢測結果
PCR擴增反應結果見
圖1a和
圖1b。
圖1a為4#引物的PCR擴增結果。M為DNA標準分子量(λDNA+EcoRI+HindIII)，1、2、3、4、5、6、7、8為本發明方法進行PCR反應的結果，其中1、2是珍汕97B，3、4是珍汕97A，5、6是汕優63，7、8是明恢63。9、10、11、12為常規方法進行PCR反應的結果，其中9是珍汕97B，10是珍汕97A，11是汕優63，12是明恢63。多態性標記以「_」標示。
圖1b為7#引物的PCR擴增結果。M為DNA標準分子量(λDNA+EcoRI+HindIII)，1、2、3、4、5、6、7、8為本發明方法進行PCR反應的結果，其中1、2為珍汕97B，3、4為珍汕97A，5、6為汕優63，7、8為明恢63。9、10、11、12為常規方法進行PCR反應的結果，其中9為珍汕97B，10為珍汕97A，11為汕優63，12為明恢63。多態性標記以「_」標示。
結果表明，由本發明方法和常規方法檢測品種種性的結果完全一致，且與田間種植結果完全相符。
五、利用鹼處理葉片直接作為模板進行PCR反應應用於轉基因材料的追蹤和輔助田間育種選用轉Xa21基因恢復系明恢63及其雜交、回交後代(由美國加州Scripps公司提供)。葉片直接取自田間自然生長的植株，剪取1-2cm長的葉片經前述的鹼處理後直接作為PCR反應的模板。同時，作為對照，按常規方法對應地提取水稻基因組DNA，定量後取50ng作為PCR反應的模板。
PCR反應的引物Pt參照Zhang等使用的序列(Zhang Shiping，SongWen-Yuan，Chen Lili et al，Molecular Breeding，1998，4551-558)，由本實驗室合成，具體見表1。PCR反應如實施例4～5所述。
PCR擴增反應結果見圖2a、圖2b和圖2c。圖2a為轉Xa21基因明恢63 F5代株系單株鑑定結果。M為DNA標準分子量(λDNA+EcoRI+HindIII)，1、2、3、4、5、6為本發明方法進行PCR反應的結果，7、8、9、10、11、12為常規方法進行PCR反應的結果。其中，1與7、2與8、3與9、4與10、5與11、6與12分別是同一單株的PCR反應結果。所檢測的單株均含有Xa21基因片段，以「_」標示。
圖2b為轉Xa21基因明恢63 F5與不育系057雜交的F2代鑑定結果。M為DNA標準分子量(λDNA+EcoRI+HindIII)，1、2、3、4、5為本發明發明方法進行PCR反應的結果，6、7、8、9、10為常規方法進行PCR反應的結果。其中，1與6、2與7、3與8、4與9、5與10分別是同一單株的PCR反應結果。除3與8不含Xa21基因片段外，其餘均含有Xa21基因片段，以「_」標示。
圖2c為轉Xa21基因明恢63 F5與未轉Xa21基因明恢63回交的F1代鑑定結果。M為DNA標準分子量(λDNA+EcoRI+HindIII)，1、2、3、4、5、6為本發明方法進行PCR反應的結果，7、8、9、10、11、12為常規方法進行PCR反應的結果。其中，1與7、2與8、3與9、4與10、5與11、6與12分別是同一單株的PCR反應結果。1與7、2與8、6與12含Xa21基因片段，以「_」標示。3與9、4與10、5與11不含Xa21基因片段。
結果表明，由本發明方法和常規方法檢測轉Xa21基因恢復系明恢63後代及其雜交、回交後代的結果完全一致，且與田間種植、接種抗白葉枯病菌株鑑定結果完全相符(含Xa21基因表現為高抗白葉枯病)。
權利要求
1．一種水稻葉片經鹼處理後直接作為模板用於PCR反應的方法，其特徵在於剪取供試水稻葉片1～2cm，放入含200μl 0．2～0．3mol／LNaOH的離心管中，將此離心管插入沸水中煮20～35秒，取出加入等當量的HCl和100μl 0．5mol／L Tris-HCl(pH8．0)，再將該管放入沸水中孵育1～3分鐘，取出葉片。
2．用鹼處理水稻葉片直接作為模板的PCR反應，包括在DNA擴增儀上進行設置的變性、退火、延伸若干循環和反應產物的瓊脂糖凝膠電泳、染色和觀察，其特徵在於PCR反應中加入如下組成和濃度的反應緩衝液10～20mmol／L(NH4)2SO4、1．5～3．0mmol／L MgCl2、50～80mmol／LTris-HCl(pH8．8)。
全文摘要
本發明為一種水稻葉片直接用於聚合酶鏈式反應的方法,包括水稻葉片的鹼處理和以鹼處理後的水稻葉片直接作為模板的PCR反應。本發明應用於作物品種種性和純度鑑定以及分子標記輔助田間育種材料的選擇中,使檢測的時間大大縮短,實驗成本大幅度降低。本方法不僅快速、簡便,而且結果清晰、重複性好、對待測植株的損傷小。
文檔編號C12Q1/68GK1288957SQ0011248
公開日2001年3月28日 申請日期2000年8月24日 優先權日2000年8月24日
發明者楊劍波, 汪秀峰, 李莉, 向太和, 皮桃花, 倪大虎, 吳家道, 張盤娣, 張毅 申請人:安徽省農業科學院